Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik makromolekülleri etiketlemek için kullanılabilecek lantanit içeren kompleksleri sentezlemek, saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bu, çözeltinin pH'ını kontrol ederken önce metal başlangıç malzemesi ve ligandın karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, elde edilen kompleksi diyaliz kullanarak saflaştırmaktır.

Daha sonra, serbest metalin yokluğunun doğrulanması gerekir. Prosedürün son adımı, görüntüleme ile ilgili olan kompleksin özelliklerinin karakterizasyonudur. Sonuç olarak, sentezlenen komplekslerin gevşeme aktivitesi ölçümleri yoluyla kontrast maddeler olarak davranacağını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, bir kontrast maddenin su koordinasyon numarasının bir proteine bağlandıktan sonra değişip değişmediği gibi görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme ihtiyaç duyan bireyler mücadele edecektir, çünkü pH'ı dikkatli bir şekilde kontrol etmek, LI'nin biyolojik eğitim için işe yaramaz hale gelmesine neden olacaktır. Diyaliz ve aktivite ölçümlerini gösteren Buda ve Sashi olacaktır.

Laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri: Lantanit tuzları kullanarak methation'a başlamak için önce 30 ila 265 milimolar bir çözelti üretmek için bir ligand eşdeğerini suda çözün. Ligand Paraiso Benzyl DTPA burada 73 Milimolar konsantrasyonda kullanılır. Daha sonra, bir molar amonyum hidroksit ekleyerek ligand çözeltisinin pH'ını 5.5 ile yedi arasında ayarlayın.

Bu videoda, bir molar amonyum hidroksit çözeltisinin 0.2 mililitresi kullanılır, şimdi beş ila 1000 milimolar konsantrasyonda bir çözelti üretmek için bir ila iki eşdeğer lantanit klorür suda çözülür. Euro bium klorür veya gadolinyum klorür 111 milimolar konsantrasyonlarda kullanılabilir. Havalandırmayı tamamlamak ve sonuç olarak arıtmayı basitleştirmek için genellikle fazla metal kullanılır.

Daha sonra, karıştırırken hazırlanan ligand çözeltisine her bir latan tuzu çözeltisi ekleyin. Şimdi elde edilen reaksiyon karışımlarının pH'ını 0.2 molar amonyum hidroksit ekleyerek 5.5 ile yedi arasında ayarlayın. Burada, çözeltiyi ayarlamak için toplam 0.5 mililitre 0.2 molar amonyum hidroksit çözeltisi kullanılır.

Kullanılan ligand aside duyarlı fonksiyonel gruplar içeriyorsa, bu adım sırasında pH'ı birden çok kez ayarlayın. PH'ı ayarlarken dikkatli olun, çünkü çözelti çok bazik hale gelirse, İzotiyosiyanat gibi baza duyarlı fonksiyonel gruplar kullanılamaz hale gelecektir. Konjugasyon için, pH ölçümleri yoluyla reaksiyonu yakından izleyin.

pH sabit kaldığında reaksiyon tamamlanır Herhangi bir baza duyarlı fonksiyonel grubu olmayan ligandlar için, pH'ın yükseltilmesini içeren bir çalışma da yararlı olabilir. Diyaliz çalışmasına başlamak için, numune hacmini tutmak için uygun bir diyaliz tüpü uzunluğu ve numune hacminin ek %10'unu tutmak için ekstra uzunluk belirleyin. Ardından, boruyu bu uzunlukta kesmek için üretici yönergelerini izleyin.

Bu videoda, 100 ila 500 Dalton moleküler ağırlıklı bir kesme membranı kullanıldı, ancak methation'dan önce konjugasyon yapılırsa, uygunsa, üreticinin yönergelerine göre, kesilen diyaliz tüpünü ıslatın ve ortam sıcaklığında 15 dakika boyunca sulayın. Daha sonra, bir diyaliz rezervuarını diyalizat görevi görecek suyla doldurun. Burada bir litrelik bir beher kullanılır.

Diyalizat hacmi, numunenin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Şimdi borunun bir ucunu iki kez katlayın ve katlanmış kısmı diyaliz kapatma kelepçesi ile sabitleyin. Diyaliz sırasında kapalı kalmasını sağlamak için kapağın ucunu bir lastik bantla sarın.

Önceden hazırlanmış reaksiyon karışımını 0.2 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından süzüntüyü borunun açık ucuna yükleyin. Boruyu yırtmamaya dikkat edin.

Boruyu kapatmak için yeterli baş boşluğu bıraktığınızdan emin olun. Borunun kalan açık ucunu iki kez katlayın, ardından bir kapakla sabitleyin ve kapağı bir lastik bantla sarın. Daha sonra, başka bir lastik bant kullanarak diyaliz tüpünün bir ucundaki kelepçeye hava içeren bir cam şişe takın.

Ardından diğer kelepçeye kum içeren bir şişe takın. Bu şişeler, borunun diyalizat içine daldırılmış halde kalmasını sağlar. Şimdi, dolu hortumu diyalizat içeren diyaliz rezervuarına yerleştirin.

Diyalizatı ortam sıcaklığında yavaş bir hızda manyetik bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın. Karıştırma hızının yavaş kaldığından ve çözeltinin yavaş kalmadığından emin olun. Girdap. Diyalatı bir gün boyunca üç kez değiştirin.

Bu videoda diyalat 2.5, 6.5 ve 11.5 saatlerde değiştirilmiştir. Diyalizin gece boyunca toplam 20 ila 28 saat devam etmesine izin verin. Diyaliz tamamlandıktan sonra, tüpü diyalattan çıkarın ve numuneyi çıkarmak için dikkatlice bir kapağı açın.

Diyaliz tüpünü üç kez suyla yıkayın ve yıkamaları numune ile birleştirin. Son olarak, burada düşük basınç altında numunedeki suyu çıkarın. Bu, dondurarak kurutma ile gerçekleştirilir.

Numune dondurulur ve daha sonra bir dondurarak kurutma aparatına yerleştirilir. Numunedeki serbest metal varlığını değerlendirmek için, önce 1.4 mililitre asetik asidi 400 mililitre su içinde çözerek asetat tamponu hazırlayın ve bir molar amonyum hidroksit ile pH'ı 5.8'e ayarlayın ve toplam 500 mililitre hacim elde etmek için su ekleyin. Daha sonra her bir kompleksin 0.3 miligramını 0.3 mililitre tamponda çözün.

Şimdi pH 5.8 tamponunda 16 mikromolar olması gereken xol turuncu göstergesini hazırlayın. Önceden çözünmüş metal komplekslerine bu gösterge çözeltisinden üç mililitre ekleyin. Göstergenin sarıdan mora renk değişimini gözlemleyerek serbest metalin varlığını tespit edin.

İstenirse, serbest metal miktarı bir kalibrasyon eğrisi oluşturularak ölçülebilir. Serbest metal kalırsa, numune karakterizasyondan önce diyaliz veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak daha fazla saflaştırılmalıdır. Daha sonra, bir afyon numunesi için su koordinasyon numarasını belirlemek için, su içinde afyon içeren kompleksin yaklaşık bir milimolar çözeltisi ve daha sonra döteryum oksit içinde aynı konsantrasyonda başka bir çözelti hazırlayın.

Analizden önce, döteryum oksit çözeltisi, kalan suyu çıkarmak, spektro florimetreyi açmak, su çözeltisini temiz bir damara eklemek ve vete'yi spektro florimetreye yerleştirmek için üç kez döteryum oksit içinde buharlaştırılmalı ve çözülmelidir. Şimdi, sırasıyla yaklaşık 395 nanometre, 595 nanometrede her biri için maksimumu belirlemek için uyarma ve emisyon gerçekleştirin. Ardından, az önce belirlenen uyarma ve emisyon dalga boylarını ve burada görüntülenen parametreleri kullanarak bir fosforesans süresi bozunması deneyi gerçekleştirin.

Bu adımı, az önce elde edilen lüminesans bozunma verilerinden hazırlanmış bir döteryum oksit çözeltisi ile tekrarlayın, zamana karşı yoğunluğun doğal günlüğü. Bu çizgilerin eğimi bozunma oranlarıdır. Bu videoda, ham verilerden doğal günlük grafikleri oluşturmak için Microsoft Excel 2007 kullanılmıştır.

Burada görülen hors ve iş arkadaşları tarafından geliştirilen denklemdeki bozunma oranlarını kullanın. Ligandınız metale koordineli OH veya NH grupları içeriyorsa, kullanmadan önce denklem değiştirilmelidir. Önce numunenin görelilik ölçümlerini belirlemek için, gevşeme süresi analizöründe istenen uygulama modunu T bir veya T iki olarak seçin.

Burada, T bir ayarı seçilir. Daha sonra, kabul edilen bir çözücü içinde farklı konsantrasyonlarda lantanit içeren kompleks içeren bir dizi numune hazırlayın. Burada çözücü olarak su ve on beş iki 0.5, 1.25, 0.625 ve sıfır çözeltileri kullanılır.

Milimolar hazırlanır. Diğer kabul çözücüler veya tamponlar kullanılabilir, ancak çözücüyü boşluk olarak kullanmak önemlidir. Numunenin son hacmi, kullanılmakta olan alete özgüdür.

Alete bir numune yerleştirin ve bu videoda kullanılan ünite için 37 santigrat derece olan cihazın sıcaklığına dengelenmesi için beş dakika bekletin. Şimdi, T bir veya T iki için düzgün bir üstel eğri elde etmek için yazılımın parametrelerini ayarlayarak gevşeme süresini saniye birimlerinde belirleyin. Boşluk da dahil olmak üzere tüm örnekler için bunu tekrarlayın.

Şimdi, ölçülen T bir veya T iki gevşeme değerinin tersini hesaplayın ve grafiği çizin. Lathan konsantrasyonuna ve milimolar birimlere karşı bu değerler grafiğe düz bir çizgi ile uyar. Takılan hattın eğimi, T bir ve T iki için sırasıyla R bir veya R iki olan rahatlama aktivitesidir.

Burada arabuluculuk ve arınma için genel şemayı görüyoruz. Bu şema, methation için genel prosedürü ve farklı saflaştırma köklerinin seçilmesinin nedenlerini göstermektedir. Burada, doğal bozunma günlüğünün zamana karşı çizildiği temsili bir lüminesans bozunma grafiği görüyoruz, su ve döteryum oksit çözeltileri için gerekli olan benzer eğrilerden oluşturulan çizgilerin eğimleri, afyon içeren komplekslerin su koordinasyon sayısını belirlemek için denklem bir ile kullanılır.

Canlılık ölçümlerinin temsili bir örneği, numunenin T bir canlılığı olan takılan çizginin eğimi ile burada görülebilir. Protokolde açıklanan su koordinasyon numarası ve canlılık karakterizasyonuna ek olarak, nihai ürünlerin standart kimyasal teknikler kullanılarak karakterize edilmesi de önemlidir. Bileşiğin kimliği, kütle spektrometresi kullanılarak elde edilebilir, gadolinyum ve afyon içeren kompleksler için tanısal izotop modellerini gösteren temsili kütle spektrumları burada gösterilmektedir.

Bu prosedürü takiben, ortaya çıkan kompleksleri daha fazla karakterize etmek için endr spektroskopisi, HPLC ve element analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik makromolekülleri etiketlemek için kullanılabilecek lantanit içeren komplekslerin nasıl sentezleneceğini, saflaştırılacağını ve karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.