Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro

Proteinin test edilmesi. Protein etkileşimi, protein işlevselliğinin diseksiyonu için vazgeçilmezdir. Bu video, bir zar ve hareketsizleştirilmiş protein ile çözünür bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için bir in vitro protein protein bağlama testini tanıtmaktadır.

İlk olarak, füzyon proteinleri klonlanır, eksprese edilir ve ekstrakte edilir. Etiketli çözünmeyen protein, nitroselüloz membran üzerinde hareketsiz hale getirilir ve doğal onayına göre yeniden katlanmak üzere işlenir. Membran daha sonra etiketlenmiş çözünür proteinlerle incelenir ve proteinleri tespit etmek için immünoblotlama yapılır.

Etiketli proteinler etkileşime girerse, zar üzerinde hareketsiz hale getirilen protein tarafından yakalanırlar ve immünoblotlamadan gelen sinyal gözlenir. Bu nedenle, bu tahlil, çözünmeyen bir protein ile çözelti içindeki bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu tekniğin GST pull down gibi mevcut damarlara göre ana avantajı, çözünmeyen protein ile çözünür protein arasındaki bağlanmayı in vitro olarak güvenilir bir şekilde değerlendirebilmenizdir.

Bu prosedürün ilk adımı, tespit için genetik olarak etiketlenmiş proteinler üretmektir. Zar üzerine hareketsiz hale getirilecek proteini klonlayarak başlayın. Burada, hareketsizleştirilmiş proteinin bir ekspresyon vektörüne dönüştürülmesi için pro Im olarak bakın, GST gibi büyük bir etiketi kodlayın, yalnızca etiketi kodlayan boş ifade vektörü, hareketsizleştirilmiş protein negatif kontrolü olarak kullanılacaktır ve pro IM nc olarak adlandırılır.

Daha sonra, çözünür bir prob olarak kullanılacak proteini, strep two gibi farklı bir etiketi kodlayan bir ekspresyon vektörüne klonlayın. Bu, aynı ekspresyon vektörüne negatif kontrol, klon, negatif kontrol çözünür protein olarak çözünür protein için prosol olarak adlandırılacaktır. Bu, çözünür protein negatif kontrolü için Prosol NC olarak adlandırılacaktır.

Daha sonra, kullanılan ekspresyon sisteminin kullandığı etiketli proteinleri ifade etmek için coli veya balo virüsü gibi bir protein ekspresyon sistemi kullanın, translasyon sonrası modifikasyon gereksinimine göre dikkatlice seçilmelidir. İfade edilen proteinleri tercih edilen organizmadan çıkarın. Pro IM ve pro I mnc Resus'a göre.

Hücreleri, proteaz inhibitörü kokteyli içeren SDS sayfa yükleme tamponunda askıya alın. Daha sonra hücreleri beş dakika kaynatın, ardından Prosol ve prosol NC'yi çıkarmak için çökeltiyi çıkarmak için santrifüjleyin. Standart prosedürleri kullanın. Pro IMS, denatüre edici koşullar altında ekstrakte edilebilir, çünkü proteinler nitroselüloz membranda hareketsiz hale getirildikten sonra yeniden katlanacaktır.

Bununla birlikte, prosol, doğal bir onay vermek için ekstrakte edilmelidir, çünkü etiketli proteinler ekstrakte edildikten sonra bağlanma tamponuna ekleneceklerdir. BioRad protein test kiti gibi standart bir yöntem kullanarak rekombinant proteinlerin konsantrasyonunu belirleyin. Tahlil için saflaştırılmış protein yerine ham ekstrakt kullanılacaktır.

Kumasi lekeli bir SDS poli akrilamid jel üzerinde karşılık gelen bandın dansitometrisini tarayarak ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu tahmin edin. Bilinen BSA konsantrasyonlarını referans olarak kullanmak. Ardından, BSA'nın tarama dansitometrisi tarafından ölçülen sinyal yoğunluklarına dayalı olarak standart eğriyi çizin ve ham ekstraktta bulunan protein miktarını hesaplayın.

Prosedürün bir sonraki adımı, pro Iam ve pro IAM NC'yi membran üzerinde hareketsiz hale getirmektir. Pro Iam ve pro IAM NC ekstraktlarının her biri olmak üzere bir mikrogram bir SDS poli akrilamid jel üzerine iki kopya halinde yükleyerek başlayın. Elektroforezden sonra, jeli cam plakalardan çıkarın ve 100 mililitre transfer tamponuna yerleştirin, ardından oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, zara bağlı proteinlerin yeniden katlanmasına izin vermek için transferden sonra proteinleri bir nitroselüloz zarına aktarmak için bir western lekesi gerçekleştirin. Membranı 15 mililitre tampon A'ya yerleştirin ve hafif çalkalama ile inkübe edin. Artık SDS'yi çıkarmak için, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, zarı tampondan dikkatlice çıkarın. Ardından zarı 25 mililitre denatürasyon tamponuna yerleştirin. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İnkübasyon sırasında nitroselüloz membran opak hale gelecektir. Daha sonra, forseps kullanarak, zarı 25 mililitre TBS'ye aktarın ve beş dakika boyunca hafif bir çalkalama ile inkübe edin. Bu aşama sırasında, zar orijinal beyaz rengine geri döner.

Daha sonra, zarı 25 mililitre bağlayıcı tampona aktarın. Gece boyunca hafif çalkalama ile dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, çözünür protein, hareketsizleştirilmiş protein için zarı araştırmak için kullanılacaktır.

İlk olarak, hibridizasyon tamponlarını hazırlayın, 10 mililitre taze bağlama tamponu içeren ayrı tüplerde bir ila 10 mikrogram prosol ve prosol NC seyreltin. Ardından tamponu bir hibridizasyon torbasına aktarın. Ardından, zarı hem pro IM hem de pro IAM nc içeren iki şerit halinde kesin.

Bu membranlar hibridizasyon tamponuna yerleştirilecektir. Her bir zarı prosol veya prosol NC hibridizasyon çözeltisine aktarın ve hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin. Membranları hibridizasyon çözeltilerinden çıkarın ve TBS'de 15 dakika boyunca üç kez durulayın.

Protein protein etkileşimlerini görselleştirmek için, zarı bir saat boyunca TBST'de% 2,5 yağsız sütle bloke edin. İnkübasyondan sonra, tıkalı zarları birincil antikor çözeltisine yerleştirin. Burada antis strep iki poliklonal tavşan antikoru kullanılır.

İnkübasyonu takiben hafif çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST'de 15 dakika ve oda sıcaklığında iki kez beş dakika boyunca hafifçe çalkalayarak durulayın. Daha sonra membranları HRP konjuge ikincil antikor çözeltisine yerleştirin Burada, HRP'ye konjuge edilmiş bir anti tavşan IgG antikoru kullanılır.

Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST'de 15 dakika ve oda sıcaklığında iki kez beş dakika boyunca daha önce olduğu gibi hafif bir çalkalama ile durulayın, TBS'deki son durulamadan sonra, bir HRP kemilüminesan substrat Here Millipore kullanarak protein protein etkileşimini görselleştirin. Im Molan Batı Kemilüminesan.

HRP substratı, prosolün immün bloklamasından sonra kullanılır. Membranı ve TBST'yi oda sıcaklığında 15 dakika ve iki kez beş dakika durulayın. Ardından, etiketin pro olması için zarları birincil antikorla yeniden araştırın.

Beni uygun ikincil antikor takip ediyor. Protein zarı kaplama testinde elde edilen bantların kimliğini doğrulamak için kemilüminesansı tespit ederek PRO I ve pro Im NNC'yi görselleştirin. A ve K proteinleri ile YFP ve MP CYFP arasındaki etkileşim, burada gösterildiği gibi bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak tütün epidermal hücrelerinde değerlendirildi.

Biyomoleküler floresan komplementasyonu değerlendirildiğinde, güçlü YFP sinyali yeniden yapılandırıldı. Bu BFC sinyali, Punta'da hücre çevresinde birikir ve bu, MP'nin yüksek oranda çözünmeyen bir protein olması nedeniyle plazma de'nin tanısıdır. Bakterilerde veya bitkilerde eksprese edildiğinde, bu etkileşimi doğrulamak için protein zarı kaplama testi benimsenmiştir.

Bir mikrogram GST MP veya kaynaşmamış GST içeren in vitro protein ekstraktları, SDS poli akrilamid jel elektroforezi ve ardından bir nitroselüloz membrana elektro transfer ile çözüldü. Bu proteinler çözünür bir nnk strep iki GST mp ile incelendiğinde, ancak kaynaştırılmadığında, GST bağlanma gösterdi. Ayrıca, aynı pro IMS seti, ilgisiz bir pro saw nc IE Arabidopsis Sitoplazmik, NADH kinaz etiketli strep iki ile incelendiğinde, A NK MP etkileşiminin özgüllüğünü daha fazla gösteren hiçbir bağlanma gözlenmedi Bu prosedürü denerken, sunulan protokolü takiben hareketsizleştirilmiş proteinleri uygun şekilde yeniden doldurmayı hatırlamak önemlidir.