Name: Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin, membrana immobilize edilmiş proteinler ile çözünür proteinler arasındaki etkileşimleri test etmek için in vitro protein bağlama analizi yöntemini. Bu teknik, çözünmez proteinlerin işlevsel etkileşimlerini güvenilir şekilde incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuarda çalışma NIH, ABD Tarım Bakanlığı Gıda ve Tarım Ulusal Enstitüsü, NSF, BARD, Enerji Bakanlığı ve BSF VC hibe tarafından desteklenmektedir

1. İfade ve proteinlerin ekstraksiyonu <ol><li> Farklı şekillerde kendi tespiti için test edilmesi proteinler etiketi. Membran (ProIM), daha büyük boyutta (örneğin, GST) bir etiket ile immobilize ve halkaya yapışmamış etiketi hareketsiz bir negatif kontrol (ProIMnc) olarak kullanılabilir protein etiketleyin. Ya büyük ya da küçük bir etiket ile çözünebilir bir prob (ProSOL) olarak kullanılmak üzere protein etiketleyin. Aynı etiket uygun bir negatif kontrol çözünür protein (ProSOLnc) Sigorta ve tespit edilen bağlama özgüllüğü onaylamak için etkileşim tahlil dahil. </li><li> Etiketli proteinleri ifade etmek protein ekspresyon sistemi, yani E. seçin coli, bakülovirüs vb proteinler potansiyel mesaj translasyonel modifikasyonlar ve verim için ihtiyaç bağlı olarak. </li><li> SDS-PAGE proteinaz inhibitörü kokteyl içeren yükleme tamponu (% 20 gliserol,% 4 SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) kullanarak seçim organizma (adım 1.2) ProIM ve ProIM nc ayıklayın. Hücre süspansiyonu bırakın, 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 merkaptoetanol ve 5 dakika boyunca kaynatın% 0.5 'i ekleyin. </li><li> ProSOL ve ProSOL nc, standart protokolleri 16 kullanarak seçim organizma (adım 1.2) ayıklayın . Bu proteinler adım 4.1 (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT,% 1 BSA,% 0.1 Tween 20) bağlayıcı tampon kolayca çözünür olmalıdır. </li><li> Bio-Rad protein tahlil kiti standart bir yöntem kullanılarak rekombinant proteinlerin konsantrasyonu belirleyin. Bio-Rad protein tahlil kiti gibi. Proteinin saflaştırılmış yerine ham özü, tahlil için kullanılması durumunda, Coomassie Brillant Blue R-250 ile ilgili bant densitometrisi SDS-poliakrilamid jel boyanmış ve bilinen kullanarak bu özü ilgi protein konsantrasyonu tahmin referans olarak BSA konsantrasyonları. </li></ol> 2. Membran ProIM ve ProIMnc immobilizasyonu <ol><li> Özler, standart bir protokol 16 göre, SDS-poliakrilamid jel üzerinde ProIM ve ProIM nc 1 mcg içeren her iki takım giderin . </li><li> Elektroforez sonra, 100 ml (60 mM Glisin, 10 mM Tris,% 0.0006 SDS,% 20 MeOH) transfer tampon transferi jel yerleştirin ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. </li><li> Nitroselüloz membrana göre standart bir protokol 16 jel bulunan proteinler Electrotransfer. </li></ol> 3. Membrana bağlı proteinler Re-katlama <ol><li> Electrotransfer sonra, 15 dakika için 15 ml tampon membran inkübe A (30 mM Tris-HCl pH7.4,% 0.05 Tween 20) artık SDS kaldırmak için yavaşça sallanarak. </li><li> Dikkatli bir şekilde boşaltılmasının ardından, denatürasyon tampon (7 M guanidin hidroklorür, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3) 25 ml membran aktarın. ve yavaşça sallanarak 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. (Not: denatürasyon tampon inkübe nitroselüloz membran bulanıklaşır). ve yavaşça sallanarak 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 25 TBS ml (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) ve 5 dakika boyunca hafif ajitasyon ile inkübe membran Devret (Not: Bu adım sırasında, orijinal beyaz renkli membran kavuşur). </li><li> Membran bağlayıcı tampon 25 ml (1.2 adım) transferi ve 4 ° C yavaşça sallanarak gece boyunca inkübe edin. </li></ol> 4. ProSOL tarafından ProIM problama <ol><li> Iki şeritler, hem de içeren ProIM ve ProIM nc membran kesin. </li><li> 10 ml taze bağlayıcı tampon ProSOL veya ProSOLnc 1-10 mikrogram ile hazırlık seyreltilmesi ProSOL ve ProSOLnc hibridizasyon çözümleri olun. ProSOL veya ProSOLnc hibridizasyon çözümü her membran transferi ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon çözümler membranlar çıkarın ve 15 dakika TBS içinde her biri için üç kez yıkayın. </li></ol> 5. Immün protein-protein etkileşim görselleştirme <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle TBST% 2,5 yağsız süt (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl,% 0.05 Tween 20, pH 7.4) ile membran engelleyin. TBST% 0,5 yağsız süt üretici tarafından önerilen konsantrasyonda birincil antikor (anti-strepII poliklonal tavşan antikoru) sulandırınız. </li><li> Antikor çözüm bloke membranlar yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca inkübe 4 ° C yavaşça sallanarak. </li><li> 15 dakika için 20 ml TBST membranlar durulayın ve iki kez yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> TBST% 0,5 yağsız süt üretici tarafından önerilen konsantrasyonda at turp peroksidaz (HRP) ile konjuge sekonder antikoru (anti-tavşan IgG) sulandırınız. Membranlar ikincil antikor yerleştirinçözüm ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 15 dakika için 20 ml TBST membranlar durulayın ve iki kez yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 5 dakika. TBS son durulama sonra, HRP kemilüminesans substrat (örneğin, Millipore Immobilon batı kemilüminesan HRP substrat) kullanarak protein-protein etkileşimleri görselleştirmek. </li><li> 5.4 adımları 5.1 'de açıklanan uygun ikincil antikor takip ProIM, erimiş etiketi için birincil antikor ile aynı membranlar Prob. Görselleştirin ProIM ve ProIMnc protein membran kaplama assay (adım 5.5) elde edilen bantların kimliğini doğrulamak için 5.5 adımı nitelendirdi. Çoğu durumda, bu adımı ile elde edilen sinyal adım 5.5 'ten elde edilen kalıntı sinyali daha güçlü çünkü sıyırma, gerekli değildir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: ANK-MP etkileşim tütün epidermal hücreler (Şekil 1A) BiFC gözlendi. MP, bakteri veya bitkilerde ifade yüksek çözünmeyen bir protein olduğu için, protein membran kaplama testi, in vitro (Şekil 1B) bu etkileşimin doğrulamak için kabul edildi. GST-MP (ProIM) veya halkaya yapışmamış GST (ProIM nc) 1 mg protein özleri içeren bir nitroselüloz membran electrotransfer takip SDS-poliakrilamid jel elektroforezi, çözüldü. Bu ProIMs çözünür ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, ancak halkaya yapışmamış değil GST probed bağlayıcı sergilenmektedir (Şekil 1B, hat 1, 2, 5, 6 şeritli karşılaştırın). Ayrıca, aynı ProIMs ANK-MP etkileşim özgüllüğü (Şekil 1B, daha gösteren bir ilgisi olmayan ProSOLnc, yani strepII (NADH3-strepII) etiketli Arabidopsis sitoplazmik NADH kinaz, hiçbir bağlayıcı gözlenmemiştir ile probed şerit 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, in vivo ve in vitro TMV MP tütün ANK Özgül bağlayıcıdır . (A), BiFC tarafından tespit edilen tütün epidermal hücrelerin yaşam ANK-MP etkileşim. MP ve ANK, C-terminal ve sırasıyla YFP N-terminal yarısı erimiş Güçlü YFP sinyali kodlayan genlerin microbombardment tütün epidermiste coexpressed, yeniden inşa edildi. Bu BiFC sinyal plasmodesmata 15 tanı hücre çevre, puncta birikmiş. (B) in vitro ANK-MP etkileşim gibi protein membran kaplama yöntemi ile tespit edildi. GST-MP (ProIM) veya halkaya yapışmamış GST (ProIMnc) 1 mg protein özleri içeren bir nitroselüloz membran üzerine electrotransfer% 15 SDS-poliakrilamid jel, çözüldü. GST-MPProIM ve GSTProIMnc ANK-strepII (ProSOL) 0.5 mg / ml ile inkübe edildi ve ANK bağlama konjuge anti-tavşan IgG + M sekonder antikoru, anti-strepII tavşan poliklonal antikor ile membran problama tespit edildi HRP (1 ve 2 şeritli). GST-MPProIM ne GSTProIMnc ne strepII etiketi (ProSOLnc, şerit 3 ve 4) erimiş alakasız bir protein, Arabidopsis sitoplazmik NADH kinaz ile etkileşim. Bu testte gözlenen grubun kimliğini anti-GST antikor (şerit 5 ve 6) ile membran problama tarafından teyit edildi. ANK-strepII GST-MP ve GST contining protein özleri bulunan kimliği belirsiz proteinler ile reaksiyona membran tampon A ile yıkanır olmadan denatürasyon tamponu ile tedavi edildi, GST-MP ANK bağlama önemini gösteren, kaybolur 3.1 adım önce denatürasyon süreci (şerit 7 ve 8).

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yaklaşım, proteinler en az bağlayıcı tampon kolayca çözünür olduğu ve diğer proteinlerin kombinasyonu 17,18 başarıyla uygulandı proteinler kombinasyonları arasında protein-protein etkileşimleri, test etmek için uygundur . Bu koşullar altında hem de çözünmez proteinler arasındaki iInteractions Bu protokol tarafından test edilemez. Ayrıca, başarılı refolding ProIM testi için kritik öneme sahiptir. Kalan SDS denatürasyon / Yeniden doğallaştırmanın sürecini etkilememeli çünkü elect...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Protein tahlil kiti </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteinaz inhibitörü kokteyl </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-Protean sistemi </td><td> Bio-RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Yarı kuru western blot SD electrotransfer sistemi </td><td> Bio-RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> At turp peroksidaz ile konjuge anti-tavşan IgG </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST tavşan poliklonal antikor </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> Biotrace, NT nitroselüloz transferi membran </td><td> Pall Bilimsel </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon batı kemilüminesan HRP substrat </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membran kaplama testi: Çözünür ve çözünmez proteinler arasında etkileşim test protokolü in vitro</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating farklı proteinler arasındaki etkileşimleri, moleküler düzeyde kendi biyolojik fonksiyonları incelenmesi için hayati önem taşımaktadır. Proteine ​​bağlanma in vitro ve in vivo olarak değerlendirmek için, çeşitli yöntemler vardır ve birbirlerinin eksikliklerini tamamlayacak en az iki yöntem güvenilir bilgiler elde etmek için yapılmalıdır. In vivo tayininde, iki moleküllü floresan tamamlama (BiFC) tayini, canlı hücre içerisinde protein-protein etkileşimleri algılamasını sağlar en popüler ve en az invaziv bir yaklaşımı temsil ediyor, hem de etkileşen proteinler 1,2, hücre içi lokalizasyonu belirlemek için. Bu testte, GFP veya türevleri olmayan floresan K ve C-terminal yarıya iki füzyon proteinleri test proteinler &#39;etkileşimleri nedeniyle bir araya getiren ne zaman test proteinler erimiş, ve floresan sinyal 3-6 sulandırılmış. . Çünkü sinyali Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile kolayca tespit edilebilir, BiFC hücre biyologlar arasında seçim canlı hücreler 3 protein-protein etkileşimleri hakkında eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu testte, ancak, bazen yalancı pozitif sonuç üretebilir. Örneğin, floresan sinyal daha ziyade bu spesifik etkileşimler nedeniyle 7, küçük bir hücre içi kompartmanda ambalaj yakın nedeniyle her bildiğim kadarıyla 7 nm düzenlenmiş iki GFP parçaları ile sulandırılmış olabilir. Bu sınırlamalar nedeniyle, canlı hücre görüntüleme teknolojilerinden elde edilen sonuçlar, protein etkileşimleri tespit etmek için farklı bir prensip dayalı bağımsız bir yaklaşım tarafından teyit edilmelidir. Co-immunoprecipitation (Co-IP) ya da glutatyon transferaz (GST) açılan deneyleri, in vitro protein-protein etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılır gibi alternatif yöntemler temsil eder. Ancak, bu testlerin iin, ancak, test edilen proteinleri bağlama reaksiyon supportsused tampon kolayca çözünür olmalıdır. Bu nedenle, spesifik etkileşimler çözünmeyen bir protein içeren bu tekniklerin tarafından değerlendirilmelidir. Burada, biz bu zorluğu circumvents protein membran kaplama bağlayıcı testi için protokol göstermektedir. Bu teknikte, çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşim, bir zar matriks proteinleri biri üzerinde hareketsiz çünkü güvenilir bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, in vivo deneyler, bu tür BiFC ile birlikte, sadakatle çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek ve karakterize etmek için güvenilir bir yaklaşım sağlar. Bu makalede, Tütün mozaik virüsü (TMV) arasında viral hücre-hücre 8-14 taşıma sırasında birden çok işlevi uygular hareket protein (MP), ve kısa bir süre önce tanımlanmış bitki hücresel interactor, tütün ankyrin tekrar içeren protein bağlama (ANK 15), bu tekniği kullanarak gösterilmiştir.

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir tanıtmak<em&gt; In vitro</emÇözünen bir protein ile bir zar hareketsiz protein prob&gt; protein-protein bağlayıcı tahlil. Bu testte, çözünmeyen bir protein ve çözüm bir protein arasındaki ilişkiyi test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Farklı proteinler arasındaki etkileşimlerin doğrulanması, bunların moleküler düzeydeki biyolojik işlevlerinin araştırılması için hayati önem taşımaktadır. Şunlar mevcuttur...

Protein testi. Protein etkileşimi, protein fonksiyonelliğinin çözümlenmesi için vazgeçilmezdir. Bu video, bir membran üzerindeki immobilize edilmiş protein ile çözünür bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için kullanılan bir in vitro protein-protein bağlanma analizini tanıtmaktadır.İlk olarak, füzyon proteinleri klonlanır, eksprese edilir ve ekstrakte edilir. Etiketli çözünmez protein nitroselüloz membrana immobilize edilir ve doğal konformasyonuna yeniden katlanması için işleme tabi tutulur. Ardından membran, etiketli çözünür proteinlerle probe edilir ve proteinlerin tespiti için immünoblotlama gerçekleştirilir.Etiketli proteinler etkileşime girerse, membrandaki immobilize protein tarafından yakalanırlar ve immunoblotting kaynaklı sinyal gözlemlenir. Bu nedenle bu analiz, çözünmez bir protein ile çözeltideki bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için güvenilir bir yöntem sunar. Bu tekniğin GST pull down gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çözünmez protein ile çözünür protein arasındaki bağlanmayı in vitro ortamda güvenilir bir şekilde değerlendirebilmenizdir.Bu prosedürün ilk adımı, tespit için genetik olarak etiketlenmiş proteinler üretmektir. Membrana immobilize edilecek proteinin klonlanmasıyla başlayın. İfade vektörüne kodlanan GST gibi büyük bir etikete sahip, immobilize edilecek proteine pro Im olarak atıfta bulunun; sadece etiketi kodlayan boş ifade vektörü ise immobilize protein negatif kontrolü olarak kullanılacak ve pro IM nc olarak adlandırılacaktır.Ardından, çözünür prob olarak kullanılacak proteini, strep two gibi farklı bir etiketin kodlandığı bir ekspresyon vektörüne klonlayın. Bu, çözünür protein için prosol olarak adlandırılacaktır; negatif kontrol olarak, negatif kontrolle bir çözünür proteini aynı ekspresyon vektörüne klonlayın. Bu, çözünür protein negatif kontrolü için Prosol NC olarak adlandırılacaktır.Ardından, etiketli proteinleri eksprese etmek için E. coli veya baculovirüs gibi bir protein ekspresyon sistemi kullanın. Kullanılan ekspresyon sistemi, translasyon sonrası modifikasyon gereksinimlerine göre dikkatle seçilmelidir. Eksprese edilen proteinleri seçilen organizmadan ekstrakte edin. pro IM ve pro I mnc Resus için.Hücreleri, proteaz inhibitör kokteyli içeren SDS page yükleme tamponunda süspande edin. Ardından hücreleri beş dakika boyunca kaynatın ve ardından çökelmeyi uzaklaştırmak için santrifüj ederek Prosol ve prosol NC'yi ekstrakte edin. Standart prosedürleri uygulayın. Proteinler nitrocellulose membrana immobilize edildikten sonra yeniden katlanacağı için pro IMS denatüre edici koşullar altında ekstrakte edilebilir.Bununla birlikte, etiketli proteinler ekstre edildikten sonra bağlama tamponuna eklenecekleri için, doğal konformasyon sağlamak amacıyla prosol ekstrakte edilmelidir. Rekombinan proteinlerin konsantrasyonunu BioRad protein analiz kiti gibi standart bir yöntem kullanarak belirleyin. Analiz için saflaştırılmış protein yerine ham ekstrakt kullanılacaksa.Kumasi ile boyanmış bir SDS poliakrilamid jel üzerindeki ilgili bandın tarama densitometrisi ile ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu tahmin edin. Referans olarak BSA'nın bilinen konsantrasyonlarını kullanın. Ardından, BSA'nın tarama densitometrisi ile ölçülen sinyal yoğunluklarına dayanarak standart eğriyi çizin ve ham ekstrede bulunan protein miktarını hesaplayın.Prosedürün bir sonraki adımı, pro Iam ve pro IAM NC'nin membrana immobilize edilmesidir. İşleme, pro Iam ve pro IAM NC ekstraktlarından birer mikrogramı, bir SDS poliakrilamid jele çift kopya halinde yükleyerek başlayın. Elektroforez sonrası jeli cam plakalardan çıkarıp 100 mililitre transfer tamponuna yerleştirin ve oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 20 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, proteinleri bir nitroselüloz membrana aktarmak için western blot uygulayın; aktarım sonrası membranla bağlanan proteinlerin yeniden katlanmasına izin verin. Membranı 15 milliliters tampon A içerisine yerleştirin ve hafif ajitasyonla inkübe edin. Kalan SDS'yi uzaklaştırmak için oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 15 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından membranı tampondan dikkatlice çıkarın. Daha sonra membranı 25 mililitre denatürasyon tamponuna yerleştirin. Oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla iki saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon sırasında nitrokselüloz membran opak hale gelecektir. Ardından, pens kullanarak membranı 25 mililitre TBS içerisine aktarın ve beş dakika boyunca hafif ajitasyonla inkübe edin. Bu adım sırasında membran orijinal beyaz rengine döner.Ardından, membranı 25 mililitre bağlama tamponuna aktarın. Dört derece Celsius'ta, hafif ajitasyonla gece boyunca inkübe edin. Sonrasında, immobilize edilen proteini tespit etmek için membran üzerinde çözünür protein kullanılacaktır.İlk olarak, hibridizasyon tamponlarını hazırlayın; 10 mililitre taze bağlama tamponu içeren ayrı tüplere birer 10 mikrogram prosol ve prosol NC seyrelterek ekleyin. Ardından tamponu bir hibridizasyon torbasına aktarın. Sonrasında, membranı her ikisi de pro IM ve pro IAM nc içeren iki şerit halinde kesin.Bu membranlar hibridizasyon tamponuna yerleştirilecektir. Her bir membranı prosol veya prosol NC hibridizasyon çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 1,5 saat boyunca inkübe edin. Membranları hibridizasyon çözeltilerinden çıkarın ve TBS içerisinde 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.Protein-protein etkileşimlerini görüntülemek için, membranı TBST içerisindeki %2,5 yağsız süt ile bir saat boyunca bloke edin. İnkübasyonun ardından, bloke edilmiş membranları primer antikor çözeltisine yerleştirin. Bu aşamada anti-strep two poliklonal tavşan antikoru kullanılır.İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile bir saat boyunca inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST içinde 15 dakika boyunca ve ardından oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile beşer dakikalık iki kez durulayın. Daha sonra membranları HRP konjuge ikincil antikor solüsyonuna yerleştirin; burada HRP'ye konjuge edilmiş bir anti-tavşan IgG antikoru kullanılır.Oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla bir saat boyunca inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST içerisinde 15 dakika ve ardından daha önce olduğu gibi oda sıcaklığında hafif ajitasyonla iki kez beşer dakika boyunca yıkayın. Son TBS yıkamasından sonra, bir HRP kemilüminesans substratı (Millipore, Molan Western Chemiluminescent) kullanarak protein-protein etkileşimini görselleştirin.HRP substratı, prosolün immün blotlanmasından sonra kullanılır. Membranı TBST ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir kez ve beşer dakikalık iki kez durulayın. Ardından membranları, proya yönelik etiket için birincil antikor ile yeniden problayın.Ardından uygun sekonder antikor uygulanır. Protein membran kaplama analizinde elde edilen bantların kimliğini doğrulamak için kemilüminesans saptaması ile PRO I ve pro Im NNC görselleştirilir. Protein A ve K ile YFP ve MP CYFP arasındaki etkileşim, burada gösterildiği gibi, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak tütün epidermal hücrelerinde değerlendirilmiştir.Biyomoleküler floresan komplementasyonu değerlendirildiğinde, güçlü bir YFP sinyali yeniden oluşturulmuştur. Bu BFC sinyali, MP'nin oldukça çözünmez bir protein olması nedeniyle plazma membranının karakteristik özelliği olan hücre çeperindeki Punta bölgelerinde birikmiştir. Protein bakterilerde veya bitkilerde eksprese edildiğinde, bu etkileşimi doğrulamak için protein membran örtüm deneyi uygulanmıştır.Bir mikrogram GST MP veya füzyonlanmamış GST içeren in vitro protein ekstraktları, SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıştırılmış ve ardından nitrocellulose membrana elektro transferi yapılmıştır. Bu proteinler çözünür a nnk strep iki ile problandığında, füzyonlanmamış GST'nin aksine GST mp bağlanma göstermiştir. Dahası, aynı protein seti ilgisiz bir pro saw nc IE Arabidopsis Sitoplazmik, NADH kinaz strep iki etiketli ile problandığında hiçbir bağlanma gözlemlenmemiş olup bu durum A NK MP etkileşiminin özgüllüğünü daha da kanıtlamıştır. Bu prosedürü uygularken, immobilize edilen proteinlerin sunulan protokole uygun olarak doğru şekilde yeniden doldurulduğunu hatırlamak önemlidir.

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Öğrenin, membrana immobilize edilmiş proteinler ile çözünür proteinler arasındaki etkileşimleri test etmek için in vitro protein bağlama analizi yöntemini. Bu teknik, çözünmez proteinlerin işlevsel etkileşimlerini güvenilir şekilde incelemeyi sağlar.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro

Daha fazla video keşfet