Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını kullanarak bir çift spesifik etkileşimli proteini tespit etmek ve izole etmek için, memeli hücreleri içeren bir kültür plakasına bir çift bimoleküler floresan tamamlama plazmitleri-transfeksiyon ajanı karışımı ekleyin.

Bir plazmit, bir raportör floresan protein parçasına kaynaşmış bir etkileşimli proteini - yem proteinini - kodlar. Diğer plazmit, floresan proteinin tamamlayıcı fragmanına kaynaşmış diğer bağlayıcı proteini - av proteinini - kodlar.

Kuluçkaya yatmak. Transfeksiyon ajanı plazmid hücresel alımını kolaylaştırır. Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, hücre zarı lokalize proteinleri eksprese eder.

Yem-av proteinlerinin etkileşimleri, floresan protein parçalarını daha da yakınlaştırır. Bu, parçaların kaynaşmasına ve yeniden katlanmasına neden olarak, floresansı bir floresan mikroskobu altında görüntülenebilen fonksiyonel floresan proteinini oluşturur.

Hücresel zarları bozmak ve füzyon proteinlerini serbest bırakmak için ortamı iyonik olmayan deterjan içeren bir lizis tamponu ile değiştirin. Hücre lizatını bir tüpte toplayın. Merkezkaç.

Füzyon proteini içeren süpernatanı taze bir tüpe aktarın. Katlanmış floresan prot