Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını kullanarak bir çift spesifik etkileşimli proteini tespit etmek ve izole etmek için, memeli hücreleri içeren bir kültür plakasına bir çift bimoleküler floresan tamamlama plazmitleri-transfeksiyon ajanı karışımı ekleyin.

Bir plazmit, bir raportör floresan protein parçasına kaynaşmış bir etkileşimli proteini - yem proteinini - kodlar. Diğer plazmit, floresan proteinin tamamlayıcı fragmanına kaynaşmış diğer bağlayıcı proteini - av proteinini - kodlar.

Kuluçkaya yatmak. Transfeksiyon ajanı plazmid hücresel alımını kolaylaştırır. Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, hücre zarı lokalize proteinleri eksprese eder.

Yem-av proteinlerinin etkileşimleri, floresan protein parçalarını daha da yakınlaştırır. Bu, parçaların kaynaşmasına ve yeniden katlanmasına neden olarak, floresansı bir floresan mikroskobu altında görüntülenebilen fonksiyonel floresan proteinini oluşturur.

Hücresel zarları bozmak ve füzyon proteinlerini serbest bırakmak için ortamı iyonik olmayan deterjan içeren bir lizis tamponu ile değiştirin. Hücre lizatını bir tüpte toplayın. Merkezkaç.

Füzyon proteini içeren süpernatanı taze bir tüpe aktarın. Katlanmış floresan proteini üzerindeki üç boyutlu bir epitopu tanıyan ve ona bağlanan floresan proteini hedefleyen tek alanlı antikor, nanokor ile konjuge agaroz boncukları ekleyin.

merkezkaç. Füzyon proteinine bağlı agaroz boncuklarını tamponda yeniden süspanse edin. Füzyon proteinlerini agaroz boncuklarından ayırmak için ısıtın. Tek tek proteinleri ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin, ardından floresan protein fragmanlarına özgü antikorlarla western blotlama yapın.

Sadece floresan fragmanlarla etiketlenmiş etkileşimli proteinler tespit edilir ve bu da izolasyonlarını doğrular.

İlk olarak, 10 mililitre DMEM içeren 10 santimetrelik tabaklarda HEK293T hücreleri tohumlayın. Daha sonra, her bir bimoleküler floresan tamamlama vektörünün 2.5 mikrogramını 500 mikrolitre transfeksiyon tamponunda seyreltin.

10 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karışımı 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra numuneleri kısaca santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, DNA transfeksiyon karışımını tabağa damla damla ekleyin. Ardından, numuneleri 8 ila 24 saat inkübe edin.

Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre lizis tamponunu ve takviye edilmiş hücre lizis tamponunu hazırlayın. Ardından, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 1 mililitre buz gibi soğuk takviyeli hücre lizis tamponu ekleyin.

Sonra, çanağı buzun üzerine yerleştirin ve beş dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri çıkarmak ve bunları soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücresel kalıntıları gidermek için tüpü yerçekiminin 18.000 katı sıcaklıkta 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından, berrak süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Uygun miktarda agaroz boncuklarını 1 mililitre PBS'de yıkayın. Ardından, boncukları 300 kat yerçekiminde santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, her numuneye 20 mikrolitre agaroz boncuk ekleyin ve uçtan uca rotasyonla iki saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Boncukları 300 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve üç kez hücre lizis tamponunda yıkayın. Ardından, yıkanmış boncukları 50 mikrolitre seyreltilmiş numune tamponunda yeniden süspanse edin. Son olarak, numuneleri 95 santigrat derecede iki ila üç dakika ısıtın.