Beyin Tümörü Kök Hücre (BTSC) Nörosfer İnvazyon Testi: İlaç Tedavisinin Nörosferden BTSC İnvazyonu Üzerindeki Etkisini Analiz Etmek İçin Bir İn Vitro Test

Beyin tümörü kök hücreleri veya BTSC'ler - beyin tümörleri içindeki hücrelerin bir alt kümesi - kendini yenileme yeteneklerine sahiptir ve tümörün ilerlemesine ve tedavi direncine katkıda bulunur. İlaçların in vitro BTSC invazyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, kültür şişelerinde uygun bir ortamda BTSC süspansiyonları ile başlayın. Süspansiyonlardan birini ilgilendiğiniz ilaçla tedavi edin.

Şişeleri kuluçkaya yatırın. Medya bileşenleri hücre çoğalmasını teşvik eder. Hücreler askıda kalır, böylece nörosfer adı verilen küresel kümeler oluşturur. İstenilen boyuta ulaştığınızda, nörosferleri toplayın. Yerçekimi ile çökelmelerine ve ortamı çıkarmalarına izin verin. Daha sonra, tedavi edilmemiş ve ilaçla tedavi edilmiş nörosferleri, uygun bir hücre dışı matris proteini ve ilacı içeren soğutulmuş ortamda yeniden süspanse edin.

Süspansiyonları soğutulmuş çok kuyulu bir plakaya koyun. Daha iyi görüntüleme için nörosferlerin kuyu dibine çökelmesine izin verin. Daha sonra, nörosferleri içine gömerek matris protein polimerizasyonu için kuluçkaya yatırın. Canlı hücre mikroskobu kullanarak nörosferleri uzun süre görüntüleyin. Kültürde, gömülü BTSC'ler, matris proteinlerini parçalayan ve hücre göçünü sağlayan proteolitik enzimler salgılar.

Zamanla, artan matris bozulması, nörosferlerden çevreleyen matrise BTSC istilası için uygun bir mikro ortam oluşturur. Uygun yazılımı kullanarak, nörosferlerin toplam yüzey alanını farklı zaman noktalarında ölçün. Tedavi edilmemiş BTSC'ler, ilaçla tedavi edilen BTSC'lerden daha yüksek bir invazyon oranını gösteren artan yüzey alanı gösterir.

BTSC nörosfer invazyonunu değerlendirmek için, önce, nörosfer invazyon kaplamasından önce önceden belirlenmiş zaman seyri için istenen konsantrasyonda şişeye ilgilenilen bileşiği ekleyin. Ortalama nörosfer boyutu yaklaşık 150 ila 200 mikrometreye ulaştığında, şişeyi bir pipetle eğin ve nazikçe karıştırın ve 500 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş BTSC nörokürelerini buz üzerindeki deneysel koşul başına 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Nörosfer peletini kaybetmeden her 1.5 mililitrelik tüpün altından mümkün olduğunca fazla besiyerini aspire edin ve nörosferleri mililitre tip I kollajen çözeltisi başına 500 mikrolitre taze hazırlanmış 0.4 miligram içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Kollajen süspansiyonlu nörosferlerin 100 mikrolitresini, buz üzerinde 96 oyuklu yeni bir plakaya koşul başına üç oyuğa aktarın ve nörosferlerin 5 dakika boyunca oturmasına izin verin.

Nörosferlerin buz üzerinde 5 dakika yerleşmesine izin vermek çok önemlidir. Aksi takdirde, küreler görüntüleme için aynı odak düzleminde olmayacaktır. Hücre kültürü inkübatöründe 5 dakikalık kollajen polimerizasyonundan sonra, invazyon başlamadan önce kaplama sırasında nörosfer boyutunun bir referans görüntüsünü elde etmek için plakayı canlı hücre görüntüleme sisteminin tepsisine aktarın. Ardından, yazılımı, istila oranı sabit hale gelene kadar, genellikle 24 saatte bir görüntü alacak şekilde ayarlayın.

BTSC'lerin zaman içinde matrisi istila ettikçe artan yüzey alanını görüntülemek için, her üç çoğaltma kuyusu seti için kuyu başına dört görüntü elde etmek için 10x hedefini kullanın. Kuyunun birleşme yüzdesi olarak temsil edilen göreli hücre yüzey alanını belirlemek için, kuyunun arka planı üzerindeki hücreleri özellikle vurgulayan bir işleme tanımı ayarlayın. Ardından, verileri her zaman noktasındaki her kuyucuk için toplam hücre yüzey alanı olarak toplayın. Üç kopya kuyusunun ortalamasını belirleyin ve zaman içinde artan hücre alanını çizerek BTSC'lerin istilasının grafiğini çıkarın.