Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Bu prosedürün genel amacı, kronolojik ömrü bir dizi basit DNA hasarı ve mutasyon tahlili ile birleştirerek mayadaki yaşa bağlı genomik kararsızlığı incelemektir. Bu, ilk olarak her iki günde bir kronolojik yaşlanma kültürlerinden numune alınması ve koloni oluşturma birimi veya CFU oluşumu ile canlılığın kontrol edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yaşlanma kültürlerini örnekleyerek ve hücreleri mutasyona özgü seçim ortamı üzerinde kaplayarak DNA mutasyonlarını incelemektir.

Sonuç olarak, mutasyon tahlil sonuçlarının canlılığa normalleştirilmesi yoluyla maya kronolojik yaşlanması sırasında DNA mutasyonlarındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, yaşlanma ve genomik kararsızlığı birbirine bağlayan mekanizmalar gibi yaşlanma alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Maya kronolojik ömrü veya CLS için tahlil yapmak için, önce tek bir maya kolonisini bir mililitre sentetik tam glikoz veya SDC ortamına aşılayın ve ertesi gün 30 santigrat derecede çalkalanarak gece boyunca inkübe edin. Gece boyunca kültürü 10 mililitre taze SDC ortamına seyreltin, üç gün boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak 0.05 ila 0.1'lik bir OD 600'e inkübe edin.

Üçüncü günde, hücreler durağan fazdayken, her bir Eloqua'yı otoklav suyunda 10.000 kez seyreltin, daha sonra şişeden iki adet 10 mikrolitrelik alikot çıkarın ve her seyreltilmiş kültürden 10 mikrolitre A-Y-E-P-D plakasına yerleştirin. Koloniler ortaya çıkana kadar plakayı 30 santigrat derecede inkübe edin. Kültürün üçüncü gününden itibaren ortaya çıkan koloni sayısı veya koloni oluşturan birimlerin sayısı %100 hayatta kalma olarak kabul edilir.

Kaplama için sonraki günlerde yaşlanan kültürden alikotları çıkarmaya devam edin. CFU tahlilinde yaklaşık 20 ila 100 koloni sağlamak için seyreltme faktörlerini buna göre ayarlamak. Kültürün canlılığı tipik olarak 11. ve 13. günler arasında %1'in altına düştüğünde numune alma durdurulur, hücre canlılığı plakalar üzerinde yaşlandırılmış hücrelerde de incelenebilir.

Bu tahlile başlamak için, tek bir koloniyi bir mililitre sentetik tam glikoz ortamına aşılayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalanarak inkübe edin. Kültür mililitre başına yaklaşık 10 ila sekizinci hücreye ulaştığında, kültürü otoklav suyu ile 10 mikrolitre başına 100 ila 200 hücreye ve 10 mikrolitre başına 1000 hücreye seyreltin. Her suş için, kaplama yoğunluğuna göre etiketlenmiş sekiz ila 20 tritofan bırakma SDC plakasından oluşan bir set hazırlayın.

Yaşlanma sırasında canlılığın azalması beklentisiyle 10 ila 100 koloninin sayılabilmesini sağlamak için, plaka üzerine 10 ila 30 mikrolitre seyreltilmiş kültürden oluşan iki alikot. Kaplama gününde kullanım ömrü analizi süresince 30 santigrat dereceye ayarlanmış plakayı inkübe edin ve daha sonra her iki günde bir, bir plakayı çıkarın ve canlı hücrelerin büyümesine izin vermek için damla damla 0,5 mililitre tripofan ekleyin. Plakayı 30 santigrat derecede 48 ila 72 saat daha inkübe edin.

48 ila 72 saat sonra. Kronolojik yaşlanma sırasında dört DNA hasarını ve mutasyon sıklığını test etmek için triptofan baskısının yapıldığı günün yaşayabilirliği için CFU'yu sayın. Maya CLS tahlili için vahşi tip suşa paralel olarak özel özelliklere sahip bir dizi garip yetiştirilir.

Spontan mutasyon frekansı, kronolojik olarak yaşlanan bir kültürde kanna vanning direncinin sıklığı ölçülerek değerlendirilebilir. Plazma arginin geçirgenliğini kodlayan bir gendeki mutasyonlar, hücreleri arginin analogu L Canavan'a dirençli hale getirir, Canavan'a dirençli hücreler, arginin bırakma üzerine büyüyecektir L Canavan sülfat ile desteklenmiş sentetik tam ortam plakaları, yolculukta bir kehribar mutasyonu içeren bir suşta trip pozitif geri dönüş frekansının ölçümü. Bir kaplama dizisi, maya kronolojik yaşlanma gezisi sırasında baz ikame oranının tahmin edilmesine izin verir.

Pozitif geri dönüş hücreleri, triptofan bırakma plakalarında büyüyecektir. Lizaz negatif suşu EH one 50, açık okuma çerçevesinde artı dört kayma barındırır, bu da lizin için öküz atrofisi ile sonuçlanır ve bu, küçük ekleme veya silme mutasyonları ile tersine çevrilebilir. Geri döndürücüler, brüt kromozomal yeniden düzenlemeleri veya gcr'yi tespit etmek için lizin bırakma plakaları üzerinde seçilecektir.

Beşinci kromozom üzerinde 7.5 kilobaz telomerik bulunan HX T 13'ün bir kutu ile bozulduğu bir mutant suş kullanılır, hem kutu bir hem de U üç genindeki üç kaset mutasyonu, hücreleri sırasıyla L Canavan ve beş floroorotik aside dirençli hale getirir. Her iki gende meydana gelen nokta mutasyonlarının sıklığı düşük olduğundan, hem El Canavan'a hem de beş floroorotik aside direnç frekansının analizi, homolog ve homolog rekombinasyon seviyesini izlemek için bir gcr tahmini sağlar. Kronolojik yaşlanma sırasında, %100 homolog ters çevrilmiş tekrarlar veya %91 homolog taşıyan mutantlar üretilir.

IRS'deki üç lokus rekombinasyonu, IRS arasındaki fonksiyonel üç proteinin ekspresyonuna izin verir. Bu nedenle, rekombinasyonun meydana geldiği hücreler, galaktoz ile desteklenmiş histidin bırakma plakaları üzerinde büyüyecektir. Üçüncü günde, hücreler durağan fazda olduğunda ve her yaşlanma kültüründen uygun miktarda hücre çıkarılacaktır.

Tüm tahliller için aynı prosedür kullanıldığından, sadece bir numune işlenecektir. Bu videonun amacı için, bir tezgah üstü santrifüjde döndürerek hücreleri peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri bir mililitre otoklav su peletinde yeniden süspanse edin.

Yine, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini, istenen geri dönüşleri seçmek için uygun plakalar üzerinde 100 mikrolitre su plakası hücresinde yeniden süspanse edin. Plakaları üç ila dört gün sonra 30 santigrat derecede inkübe edin, CFU'ları sayın, mutasyon frekansı canlı hücre sayısına normalize edilir. Bu grafik, vahşi tip hücrelerin kronolojik sağkalımı S, CH, dokuz delta, TOR, bir delta ve RA'lar, iki delta mutantınkiyle karşılaştırıldığında, tipik bir kronolojik yaşam süresi testinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir.

Sıvı kültürde, TOR bir, s, CH dokuz veya RA ikiden yoksun mutantlar uzun bir kronolojik yaşam süresi gösterir. Ayrıca, s CH dokuz ve RA'ların ikisindeki eksiklikler, çeşitli karbon kaynaklarının varlığında uzun ömürlülüğün teşviki kronolojik sağkalımı üzerinde ilave bir etki göstermektedir. NC iki canlılık testi kullanılarak bu sonraki grafikte gösterilmiştir.

Birinci gün, SDC yabani tip kültürler seyreltildi ve karbon kaynağı olmayan SC trip bırakma plakalarına kaplandı. Glikoz, etanol veya gliserol orat plakaları ile takviye edilmiş SC Tripp bırakma plakaları, her iki günde bir 30 santigrat derecede inkübe edildi. Her setten bir tabak alındı ve büyüme ve koloni oluşumuna izin vermek için uygun besinler eklendi.

Yaşa bağlı mutasyon sıklığı, suş, geçmiş, genetik manipülasyon, kültür, koşullar ve yaşa bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Bu tablo, vahşi tip bir suşta elde edilen tipik sonuçları göstermektedir. Trans lezyon sentezinin temsili sonuçları bu sonraki görüntüde gösterilmiştir.

Yaşa bağlı mutasyon frekansı artışı, nükleer ekstraktlar ve çeşitli DNA şablonları kullanılarak hatalı DNA onarımındaki değişiklikleri içerebilir. Kronolojik olarak yaşlı hücrelerde translasyon sentezini veya TLS'yi değerlendirebiliriz. Üç günlük durağan faz, vahşi tip ve SCH dokuz delta mutant hücrelerinden elde edilen nükleer ekstraktlar analiz edildi.

Hasar görmemiş şablona sahip TLS ürünleri düz çizgilerle, hasarlı şablona sahip TLS ürünleri ise noktalı çizgilerle gösterilir. Uzun ömürlü s CH dokuz delta mutant serbest primerlerinden elde edilen nükleer ekstraktlarda translezyon sentezi gözlenmemiştir, açık okla gösterilir. Bu videoyu izledikten sonra, mayada kronolojik yaşam süresi ve DNA mutasyon analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.