Name: Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin yaşlanmaya bağlı genomik istikrarsızlığı S. cerevisiae kronolojik ömür modeli kullanarak. Bu yöntem, yaşlanma süreçlerinde DNA mutasyonlarını ve hücre canlılığını değerlendirerek araştırmacılara gen fonksiyonlarını inceleme imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz plazmid ve maya suşları için S. cümbüş Robertson ve E. Heidenreich teşekkür P. Pham ve MF Goodman yardım withthe TLS tahlil için. Bu çalışma, Amerikan Federasyonu tarafından Yaşlanma Araştırma hibe için, NIH AG20642, AG025135 tarafından kısmen desteklenmiştir.

İki ömrü modelleri S. yaşlanma çalışma var cerevisiae: Huzursuz bacak sendromu ve CLS. Replikatif (tomurcuk) ömür (HBS), maya anne hücreleri bölümler 3-6 sonlu sayıda geçmesi gözleme dayanır . Biz kronolojik ömrü (CLS), kronolojik yaşam, kültür ya da plakaları 7-11 olmayan bölünmesi maya dayalı bir model üzerinde durulacaktır. Wild tip maya sentetik dekstroz tam (SDC) orta 10-12 saat boyunca katlanarak büyür . Glukoz seviyesini düşüren, maya fermantasyonu sonucu solunum anahtarlar, bir süreç diauxic kayması olarak adlandırılır. Hücreler G 0 tutuklama girmeden önce yaklaşık 48 saat sonrası diauxic aşamasında yavaş bölmek için devam ediyor. Hücrelerin metabolik hızı gün 5-6 (0 gün aşılama gün) kadar yüksek kalır. G 0 tutuklama ve form zengin YPED plakalar üzerinde koloni çıkabilirsiniz her iki günde bir örneklenmiş kronolojik yaşlanma hücrelerinin yüzdesi, zamanla hücre canlılığı ulaşılabilir. 1. Maya kronolojik ömrü sıvı kültüründe (CLS) <ol><li> 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC, Tablo 1) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C Üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız. </li><li> OD taze SDC orta (genellikle 10 ml) içine bir gecede kültür sulandırınız = 0.05-0.1 (~ 1:100 dilüsyon) ve 30 (220 rpm) sallayarak inkübe ° C Bu zaman noktası, kronolojik yaşlanma gün 0 olarak kabul edilir. Uygun havalandırma sağlamak için bir kültür / balon hacmi (10 ml, 50 ml kültür, ya da daha uzun / geniş deneyler 125 ml 25 ml kültür) 01:05 oranını korumak. </li><li> 3. gün başlayarak, 2 alikotları şişeden 10 ul kaldırmak, YEPD (% 1 maya özü,% 2 bacto pepton, 2% dekstroz otoklava su, 10 ul seyreltilmiş kültürü (yani, 10 4 -10) 10.000 kez seyreltilmiş % 2 agar) plakaları ve birleştirmek (CFU) oluşturan koloni sayılır önce 48-72 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. </li><li> 3. Gün CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir. ~ 20-100 koloniler CFU testi (örneğin, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, vb) sağlamak için, sonraki gün yaşlanma kültür Seyreltme faktörü buna göre düzenlenmelidir . DBY746 arka planda vahşi tip hücreler için, CLS, 11 gün% 1 civarına hayatta kalma ulaşır. </li></ol> In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır : <ul><li> Kalori kısıtlaması glikoz sınırlama (CR). Glikoz sınırlı SC orta gecede kültür seyreltilmesi (örneğin, standart% 2 glukoz yerine% 0.5 veya 0.05), genellikle 3. gününde düşük nüfus doygunluk yoğunluğu yol, ancak çok ömrü 12 (10% sağkalım), ortalama ve maksimum uzatıldı. </li><li> Aşırı CR / açlık için, (eşit hacimde su tekrar süspansiyon hücreleri ve 3 kez tekrarlayın, 2500 rpm'de 5 dakika boyunca aşağı spin) otoklava su ile günde 3 sabit faz kültürü (genellikle 10 ml olarak yukarıdaki adım 3) yıkayın. Su Incubationof hücreler maya vahşi karşılaşabileceğiniz açlık durumu taklit eder. Her iki günde bir daha sonra yaşlanma kültür otoklava su ile yıkanır ve parçalanmış ölü hücrelerden salınan herhangi bir besin kaldırmak için eşit miktarda su yeniden süspanse edilmelidir. Yukarıda açıklandığı gibi yaşlanma kültürü örneklemesi, canlılığı tahlil gerçekleştirin. Bu açlık durumu vahşi tip DBY746 suşu 12 ortalama CLS neredeyse iki katına yol açtı. </li></ul> 2. in situ canlılığı tayininde Sıvı kültüründe, hayatta kalan hücrelerin küçük bir kısmını hücre döngüsü yeniden girdi ve kalan besin ya da orta parçalanan bu ölü hücreleri serbest formu kullanarak büyümek, bir fenotip regrowth olarak adlandırdığı / 13 nefes nefese . DBY746 suşu (trp1) auxotrophy regrowth / nefes nefese sorunu aşmak için kullanır ve aynı zamanda sürekli maruz kalma ya da yoksunluk, çeşitli dış besin veya maya uyaranların etkisi test izin canlılığı-on-a-plate sistem geliştirdi. CLS 11. Bu aynı zamanda in situ canlılığı tayininde hücreler sürekli ömrü analizi boyunca bol miktarda besin maruz kaldığı bu tür replikatif ömrü modeli taklit eder . <ol><li> 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C En az üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız. </li><li> Kültür ~ 10 8 hücre / ml (OD 600 = ~ 10) büyümeye culturewith otoklava su sulandırmak, 100-200 cell/10 ul (genellikle 10 4 kat seyreltme) ve 1.000 cells/10 ul (10 3 kat dilüsyon). </li><li> Plaka bir triptofan okulu terk SDC plaka üzerine seyreltilmiş kültür 10-30 ul iki alikot. Içinr ve her bir suş, 8 ila 20 plakaları bir dizi hazırlamak ve kaplama yoğunluğuna göre etiketli (örneğin, 10 4 kat seyreltik, plaka 10 ul veya 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , vb), 10-100 koloniler yaşlanma sırasında azalma canlılığı beklentisiyle sayılabilir sağlamak. </li><li> Plaka ömrü analiz süresi 30 ° C'de inkübe edin. </li><li> Kaplama yapıldığı gün ve daha sonra her 2 günde bir, bir plaka ve açılan akıllı kaldırmak canlı hücrelerin büyümesine izin 0.5 ml Triptofan (2 mg / ml) ekleyin. Plaka ek 48-72 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Triptofan ek gününde canlılığı için CFU güvenin. Kaplama gününde CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir. </li></ol> In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır : <ul><li> Agar plaklarına Yaş hücreleri (aşırı açlık koşul). Ekle 1 ml 2x sonraki gün izin büyüme ve CFU sayısı 14 yerine triptofan YPED. </li><li> Yaş hücreleri çeşitli karbon kaynakları, örneğin glikoz çeşitli konsantrasyonlarda (glikoz sınırlama kalori kısıtlaması), etanol gibi çeşitli karbon kaynakları, gliserol, asetik asit 14 triptofan okulu terk sentetik tam orta plakalar. Büyüme ve CFU sayısı izin için 1 ml glukoz / triptofan solüsyonu (% 20 glikoz ve 1mg/ml triptofan) ekleyin. </li><li> Gibi azot gibi diğer besin manipülasyon. </li></ul> 3. Kronolojik yaşlanma sırasında DNA hasarı ve mutasyon sıklığı Canavanine direnci (Can r) ve can1 sıralama Spontan mutasyon sıklığı, kronolojik yaşlanma kültürlerde canavanine direnci (Can r) frekans ölçerek değerlendirilir . Plazma arginin permease kodlar CAN1 (YEL063) gen, mutasyonlar, farklı zaman noktalarında toplanan arginin analog L-canavanine.Can r koloniler karşı dirençli olan hücreler de genomik DNA ve CAN1 sonraki sıralama çıkarılması için kaydedilebilir hale gen mutasyonu spektrum verileri (Mutasyon Surveyor ile SoftGenetics) sağlayabilir. Temel değiştirmelerin (Trp + reversions) Trp1-289 ile Suşlarının TRP1 kodlama sırayla sarı mutasyon (C403T) içerir. Trp + reversion 15 trp1-289 frekans ölçümü maya Kronolojik yaşlanma sırasında baz ikame oranı tahmini sağlar. Çerçeve-kayması mutasyonları Lys - suşu EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200 ura3-52, ade2-1o) LYS2 gen bir BGL II restriksiyon enzimi sitesi oluşturmak için 4 nükleotidler takarak inşa edilmiş bir lys2ΔBgl II mutasyon limanlar . Ekleme / silme küçük mutasyonların 16-17 ters olabilir lisin için auxotrophy açık okuma çerçevesi sonuçları sonucu 4 vardiya. Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) saptamak için, hangi HXT13 (YEL069), son derece gereksiz bir heksoz taşıyıcı kodlama, bir URA3 kaset 18 kesintiye uğramıştır, bir mutant suşu oluşturulur. HXT13 CAN1 için telomerik 7.5 kb V. Mutasyonlar kromozom bulunur CAN1 ve URA3 genler hem de sırasıyla, L-canavanine ve 5-fluoroorotic asit (5FOA) hücreleri direnç veren. R 5FOA r frekans hem genler, analiz meydana gelen nokta mutasyonu düşük frekanslı göz önüne alındığında, hem genlerin kaybına neden GCRs bir tahmin sağlar. Homolog ve homeologous rekombinasyon Homolog ters yineler (IRS) (pSR406% 100 ya da taşıma: Kronolojik yaşlanma sırasında homolog seviyesi (% 100) ve homeologous rekombinasyon (% 91) izlemek için, biz lineerleştirilmiş plazmid (intron-IR-URA3 HIS3) mutantlar oluşturulan ) veya IRs homeologous HIS3 lokus 19% 91 (pSR407). IRs arasında Rekombinasyon fonksiyonel His3 protein ifade sağlar. <ol><li> Normal canlılığı assay (yukarıda açıklandığı gibi) paralel olarak, yaşlanma kültür hücreleri, uygun bir miktarda kaldırmak <ol><li> Can r mutasyon, ~ 2x10 7 hücre (3 gün kültür ul 200) ile başlar; </li><li> Trp + reversion, ~ 10 8 hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar; </li><li> Lys + çerçeve kayması mutasyonu için ~ 10 8 hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar; </li><li> GCRs, 2-3x10 8 hücreleri (2-3 ml 3. gün kültür) ile başlamak; </li><li> homolog ve homeologous rekombinasyon &amp; tilde ile başlamak5x10 7 hücre (200-500 ul gün 3 kültür); </li></ol> kaplama miktarı, toplam canlılığında azalma ve Kronolojik yaşlanma sırasında (Tablo 2) mutasyon sıklığı artış göre ayarlayın . Hypermutator fenotip ile suşların (DNA onarım eksiklikleri olanlar gibi) durumunda, buna göre örnekleme miktarını azaltmak. </li><li> Pelet tezgah üstü santrifüj makinesi (5 dakika için 6000 rpm) hücreler. </li><li> 1 ml otoklava su, ve pelet hücrelerin hücre tekrar tekrar </li><li> Su 100 ul yeniden süspanse hücre pelletini. Plaka hücreler, <ol><li> arginin-ayrılma sentetik tam orta plakaları r mutasyon (SDC-Arg, 60 mikrogram / ​​ml L-canavanine sülfat ile takviye); </li><li> Trp + reversion, triptofan ayrılma plakaları (SDC-Trp); </li><li> Lys + çerçeve kayması mutasyonu, lisin ayrılma plakaları (SDC-Lys); </li><li> GCRs, arginin ayrılma plakaları (SDC-Arg) 5FOA (1 mg / ml) ve L-canavanine sülfat (60 mg / ml) ile desteklenmiş; </li><li> homolog ve homeologous rekombinasyon, histidin ayrılma plakaları galaktoz (% 2) ile desteklenmiştir. </li></ol></li><li> 3-4 gün inkübasyondan sonra CFU Sayısı 30 ° C. Mutasyon frekansı canlı hücrelerin sayısı normalize. </li></ol> Tamamlayıcı in situ canlılığı tayininde, yaşa bağlı Trp + reversion, Lys + çerçeve kayması mutasyon, rekombinasyon, veya r mi plaka üzerinde yaşlı hücreleri de incelenebilir . <ol><li> Trp, Lys, His-ayrılma ya da L-canavanine sentetik tam orta tabak (yukarıda açıklandığı gibi) Plaka hücreleri (~ 10 8 hücre / plaka). </li><li> Her iki gün (ya da ilgi bir zaman noktasında), yeni ortaya çıkan koloniler puan. </li><li> Mutasyon sıklığı, canlı hücreler, belirli bir günde toplam sayısı yeni ortaya çıkan koloniler normalleştirilmesi tahmin edilmektedir. </li></ol> 4. Translesion sentezi (TLS) Yaşa bağlı mutasyon sıklığı artış, makromolekül hasar, azalmış hücresel koruma / onarım içerir ve yaşlanma sırasında hatalı DNA onarım (Polζ bağımlı translesion sentezi, TLS gibi) artmış olabilir. Örneğin, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar SOD2 yükselmiş ifade sergi, ve hata eğilimli DNA onarım enzimi Rev1 20 ekspresyonu azalmıştır. Burada hasarlı DNA'nın in vitro TLS değerlendirmek için şablon ve tüm nükleer özü birleştiren bir tahlil açıklar. <ol><li> Wang ve ark tarafından tanımlanan nükleer özü hazırlayın 21 BCA yöntemi (Pierce) ile protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> TLS Tampon (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7.8), 200 μMdNTPs ve 100 nM içeren 50 ul (son hacim) reaksiyonları için nükleer özler 0, 5, 10 veya 20 mikrogram ekle 5'-32 P-12-mer astar etiketli ilgi DNA hasarı (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC içeren bir 48-mer şablon tavlanmış (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') ACG TTK GTA CCA TCG-3 ', X), abasic sitesi, 8-oxo-G, vb hasarlı site, örn. </li><li> Karışım 30 ° C'de 30 dakika için 2.5 ul EDTA (20 mM) ve proteinaz K (10 mg / ml) 2 ul ilavesi ile reaksiyon feshedebilir. </li><li> Fenol ekstraksiyonu ve etanol yağış DNA arındırın. </li><li> Süspanse edin jel yükleme tamponu 50 ul DNA (% 98 formamid, 20 mM EDTA, boya ve). </li><li> % 19 poliakrilamid jeller translesion sentez ürünleri giderin. </li><li> Phosphorimaging (Şekil 1) kullanarak TLS niceliğini. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Biz, genellikle standart sıvı CLS analizinde yüzde 100 sağkalım olarak 3 gün CFU sayar. Sonraki günlerde yüzde sağkalım ortalama (% 50 hayatta kalma) hesaplamak için donatılmış ve en fazla (% 10 hayatta kalma) ömrü 12 yayılmış olabilir. Ömrü yerinde canlılığı tayininde elde edilen sonuçlar genellikle sıvı CLS tahlil kullanan kişiler ile tutarlı, ancak kısmen hücreleri besinlerin sürekli maruz kaldığı gerçeği nedeniyle ortalama yaşam süresi, azaltılmış. Glikoz varlığı hücresel koruma etkinliği azaltılmış transaktivasyonunun MSN2 / 4 ve Gis1 12 gibi stres yanıtı transkripsiyon faktörü gösterdi engeller. Yaşa bağımlı mutasyon sıklığı büyük ölçüde gerginlik arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, ve yaşa bağlı olarak değişir. Tablo 2 yabani tip suşu (DBY746) elde edilen tipik sonuçlar gösterir. <table border="1"><tbody><tr><th> Bileşen </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Amonyum sülfat </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Azot taban (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Aspartik asit </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Glutamik asit </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucine </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lizin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Triptofan </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Urasil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sentetik tam şekeri orta, SDC (NaOH ile pH 6.0 ayarlamak). 4 kat fazla histidin, lösin, triptofan ve urasil DBY746 suşu auxotrophy telafi etmek dahildir. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> 3. Gün (ortalama ± SEM) </th><th> Kadar (yaşlanma sırasında) </th></tr><tr><td> R mi </td><td> 1.76 ± 0.12 x10 -6 </td><td> X10 -6 6-8 </td></tr><tr><td> Trp + reversion </td><td> 6.60 ± 1.70 x10 -8 </td><td> X10 -6 1.60 </td></tr><tr><td> Lys + çerçeve kayması mutasyonu </td><td> 3.00 ± 0.78 x10 -8 </td><td> X10 -6 0.70 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0.62 ± 0.10 x10 -8 </td><td> X10 -6 0.30 </td></tr><tr><td> Homolog rekombinasyon </td><td> 5.55 ± 2.74 x10 -6 </td><td> X10 -6 27.00 </td></tr><tr><td> Homeologous rekombinasyon </td><td> 0.12 ± 0.04 x10 -6 </td><td> X10 -6 0.48 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Kronolojik yaşlanma sırasında vahşi tip hücrelerin tipik mutasyon frekansları (DBY746 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg"> Şekil 1 translesion sentezi (TLS) 20 Sonucu. 3 gün eski sabit yabani tip faz (DBY746) ve sch9 Δ mutant hücreler Nükleer özler, 30 ° C'de 30 dakika için hasarsız ya da abasic site içeren DNA şablonları inkübe edildi. TLS ürünleri katı (hasarsız şablonu ile) veya noktalı (hasarlı şablonu ile) hatları ile belirtilmiştir. Sch9 Δ mutantlar nükleer özü gözlenen hiçbir translesion sentezi vardı. Ücretsiz primerler açık bir ok ile gösterilir.

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sıvı yaşlanma kültürler regrowth / CLS analiz karmaşıklaştırır nefes nefese fenotip 13, bazen sergiler. Nüfusun% 90-99 daha fazla canlılığını kaybetti büyütme genellikle oluşur. Bu fenotip genellikle artmış oksidatif stres ve / veya hücre içinde azalma koruma ile ilişkilidir. Örneğin, bu fenotip frekans uzun ömürlü mutantlar sitozolik süperoksit dismutaz eksik hücrelerinde iki katına daha fazla ve büyük ölçüde azaltır (örneğin, sch9 Δ veya ras2 Δ) veya mutantlar eksprese süperoksit dismutaz 22. Uygulamada, biz regrowth Kronolojik yaşlanma sırasında yüksek mortalite faz 3 ardışık örnekleme için canlılığı canlılığı veya istikrar bir artış olarak tanımlar. Yaşa bağımlı frekansları farklı DNA mutasyonlarının zorlanma arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, yanı sıra regrowth / nefes nefese ve son derece düşük sağkalım önemli ölçüde bağlı olarak değişir. Ön deneyler performingthe tam ölçekli ömrü analizden önce mutasyon frekans aralığını belirlemek için mutasyon deneyleri için çeşitli kaplama yoğunluğu ile maksimum ve ortalama sağkalım süresi noktalarında yapılmalıdır. Vahşi tip suşu, her zaman, herhangi bir tedavi ya da genetik mutant ile paralel bir ömrü veya mutasyon sıklığı çalışma dahil edilmelidir deneme arası varyasyonlar için açıklanamayacağı gibi. Çoklu biyolojik kopyaları çalışmaya dahil olmalıdır;, hem sıvı ve yerinde canlılığını / mutasyon deneyleri sonuçları doğrulamak için yapılmalıdır. Yaşa bağlı genomik instabilite birlikte birden fazla testleri kullanarak profil belirli bir DNA mutasyon tipi, odaklanmak yerine, belirli bir DNA hasarı ve DNA hasarı tamir yaşa bağlı genomik istikrarsızlığa katkıda sistem (ler) ışık tutabilir. Örneğin, diğer DNA mutasyonlarının göre brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) önemli bir artış, vahşi tip maya maya sırasında homolog olmayan sonunda bir elevationof çift iplikli kırmak ve / veya bir değer düşüklüğü katılmadan (NHEJ) düşündüren görülmektedir Kronolojik yaşlanma (Tablo 2). Yabani tip yaşlanma maya elde can1 mutasyon spektrumu (CAN1 gen sıralama) oksidatif hasarı, kronolojik yaşlanma ve hata eğilimli DNA onarım sırasında bir artış önerisi ise, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar, daha az oksidatif DNA hasarı ve çok azaltılmış hata eğilimli translesion sentezi 20 gözlenmiştir. Burada açıklanan yöntemlerden yaşa bağlı genomik istikrarsızlık daha fazla çalışması için harcanan olabilir. Örneğin, sükunet ve non-latent hücrelerin Allen ve ark tarafından tanımlanan yoğunluk gradiyenti yöntemi kullanarak maya sabit faz kültürlerinden izole edilebilir. 23. Burada açıklanan mutasyon deneyleri ile birlikte, yaşa bağlı mutasyonların büyük bir kısmı, bölme hasar görmüş ya da apoptotik hücreleri 20,24 daha ziyade latent hücreleri, ortaya çıktığı bildirdin .

yaşa bağımlı genomik İstikrarsızlık incelenmesi s. cerevisiae kronolojik ömrü modeli

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Saccharomyces cerevisiae yaşlanma modeli kullanılarak yapılan çalışmalar, yüksek ökaryotlar 1-2 kısmen korunmuş ömrü düzenleyici yollarda ortaya çıkarmıştır . Maya yaşlanma modeli sadeliği ve gücü de, DNA hasarı ve genom bakım yanı sıra, yaşlanma sırasında hastalıkları katkıları çalışma araştırılmalıdır. Burada, maya kronolojik ömrü basit bir DNA ile birleştirerek temel yerine, çerçeve kayması mutasyonları, brüt kromozom düzenlenmeleri ve homeologous / homolog rekombinasyon yanı sıra nükleer DNA onarım faaliyetleri de dahil olmak üzere, yaşa bağlı DNA mutasyonlarının, çalışma sistemi tanımlamak hasar ve mutasyon deneyleri. Burada açıklanan yöntemler genomik istikrarsızlık ve memelilerde yaşa bağımlı DNA mutasyonları ve kanser altında yatan mekanizmaları düzenleyen genleri / yollarının belirlenmesini kolaylaştırmak gerekir.

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Saccharomyces cerevisiae yaşlanma modelini kullanan çalışmalar, yüksek ökaryotlarda kısmen korunan yaşam süresi düzenleyici yollarını ortaya çıkarmıştır1-2. ...

Bu prosedürün genel amacı, kronolojik yaşam süresini bir dizi basit DNA hasarı ve mutasyon analizi ile birleştirerek mayadaki yaşa bağlı genomik instabiliteyi incelemektir. Bu işlem, öncelikle kronolojik yaşlanma kültürlerinden her iki günde bir örnekleme yapılarak ve koloni oluşturan birim veya CFU oluşumu yoluyla canlılık kontrol edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yaşlanan kültürlerden örnekleme yapılması ve hücrelerin mutasyona özgü seçici besiyerine ekilmesiyle DNA mutasyonlarının incelenmesidir.Nihayetinde, mutasyon analizi sonuçlarının canlılık oranına göre normalize edilmesi yoluyla, mayaların kronolojik yaşlanması sırasında DNA mutasyonlarındaki değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, yaşlanma alanındaki temel soruların, örneğin yaşlanma ve genomik instabiliteyi birbirine bağlayan mekanizmaların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mayaların kronolojik yaşam süresini veya CLS'yi analiz etmek için, öncelikle tek bir maya kolonisini bir mililitre sentetik komplet glukoz veya SDC ortamına inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu kültürü taze SDC ortamının 10 mililitresi içinde OD 600 değeri 0,05 ile 0,1 olacak şekilde dilüe edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak üç gün boyunca inkübe edin.Hücrelerin stasyoner fazda olduğu üçüncü günde, her Eloqua örneğini otoklavlanmış su ile 10.000 kat seyreltin, ardından flasktan iki adet 10 µL'lik alikot alın ve her bir seyreltilmiş kültürden 10 µL'yi A-Y-E-P-D plaklarına ekleyin. Koloniler oluşana kadar plakları 30 °C'de inkübe edin. Üçüncü gün kültüründen ortaya çıkan koloni sayısı veya koloni oluşturan birimler %100 sağkalım olarak kabul edilir.Plakaya ekim yapmak için sonraki günlerde yaşlanan kültürden alikotlar almaya devam edin. CFU analizinde yaklaşık 20 ila 100 koloni oluşmasını sağlamak için dilüsyon faktörlerini buna göre ayarlayın. Örnekleme, kültürün canlılığı %1'in altına düştüğünde durdurulur; bu durum genellikle 11. ve 13. günler arasındadır; hücre canlılığı ayrıca plaklarda yaşlandırılan hücrelerde de incelenebilir.Bu analize başlamak için tek bir koloniyi bir mililitre sentetik komple glukoz besiyerine inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Kültür mililitre başına yaklaşık 10⁸ hücreye ulaştığında, kültürü otoklavlanmış su ile 10 µL başına 100 ila 200 hücre ve 10 µL başına 1000 hücre olacak şekilde dilüe edin. Her suş için, ekim yoğunluğuna göre etiketlenmiş sekiz ila 20 adet triptofan eksik SDC plakasından oluşan bir set hazırlayın.Yaşlanma sırasında azalabilecek canlılık ihtimalini göz önünde bulundurarak, 10 ila 100 koloninin sayılabildiğinden emin olmak için, her plakka 10 ila 30 µL seyreltilmiş kültürden oluşan iki alikot ekleyin. Plak setini 30 °C'de inkübe edin; ekim gününde ve ardından her iki günde bir, bir plak çıkarın ve canlı hücrelerin büyümesini sağlamak için damla damla 0,5 mL triptofan ekleyin. Plağı 30 °C'de ek bir 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin.48 ila 72 saat sonra. Kronolojik yaşlanma sırasında DNA hasarını ve mutasyon sıklığını değerlendirmek için, triptofan ekleme günündeki canlılığı belirlemek amacıyla CFU sayımı yapın. Maya CLS analizi için, özel özelliklere sahip bir dizi suş, vahşi tip suş ile paralel olarak büyütülür.Spontan mutasyon frekansı, kronolojik olarak yaşlanan bir kültürde canavanin direnci frekansı ölçülerek değerlendirilebilir. Plazma arginin permeazını kodlayan can1 genindeki mutasyonlar, hücreleri arginin analoğu L-canavanin'e karşı dirençli hale getirir. Canavanin dirençli hücreler, L-canavanin sülfat ile desteklenmiş, arginin eksik sentetik kompleks besiyeri plaklarında büyüyecektir. trip1 kodlama dizisinde amber mutasyonu içeren bir suşta trip pozitif reversiyon frekansının ölçülmesi, maya kronolojik yaşlanması sırasında baz substitüsyon hızının tahmin edilmesine olanak tanır.Pozitif reversiyon hücreleri, triptofan eksikliği olan plakalarda büyüyecektir. Liz negatif suş EH150, açık okuma çerçevesinde artı dört kaymaya sahiptir; bu durum lizin için oks atrofiye yol açar ve küçük insersiyon veya delesyon mutasyonlarıyla geri döndürülebilir. Kaba kromozomal yeniden düzenlemeleri veya gcr'yi tespit etmek için revertantlar, lizin eksikliği olan plakalarda seçilecektir.HX T 13'ün kromozom beşte can one'ın telomerik tarafında 7,5 kilobaz uzağında yer aldığı ve U üç kasetiyle bozulduğu bir mutant suş kullanılır; can one ve U üç genlerinin her ikisindeki mutasyonlar hücreleri sırasıyla L Canavan ve beş florootik aside karşı dirençli hale getirir. Her iki gende meydana gelen nokta mutasyonlarının sıklığı düşük olduğundan, hem El Canavan hem de beş florootik aside karşı direnç sıklığının analizi, homolog ve homolog olmayan rekombinasyon seviyesini izlemek için gcr tahminini sağlar. Kronolojik yaşlanma sırasında, ya %100 homolog ters tekrarlar ya da %91 homolog tekrarlar taşıyan mutantlar oluşturulur.IRS'deki his üç lokusu arasındaki rekombinasyon, fonksiyonel his üç proteininin ekspresyonuna olanak tanır. Bu nedenle, rekombinasyonun gerçekleştiği hücreler, galaktoz ile desteklenmiş histidin eksikliğindeki plakalarda büyüyecektir. Hücrelerin stasyoner faza girdiği üçüncü günde, her bir yaşlanma kültüründen uygun miktarda hücre alınacaktır.Tüm analizler için aynı prosedür uygulandığından, yalnızca tek bir örnek işlenecektir. Bu videonun amacı doğrultusunda, hücreleri bir masaüstü santrifüjle döndürerek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre otoklavlanmış su içerisinde yeniden süspande edin.Süpernatantı tekrar uzaklaştırın ve hücre peletini 100 µL su içinde yeniden süspanse edin; istenen revertantları seçmek için hücreleri uygun plakalara ekimleyin. Plakaları 30 °C'de inkübe edin ve üç ila dört gün sonra CFU'ları sayın; mutasyon frekansı canlı hücre sayısına göre normalize edilir. Bu grafik, yabani tip hücrelerin kronolojik sağkalımı ile S CH nine delta TOR one delta ve RAs two delta mutantlarının sağkalımı karşılaştırıldığında, tipik bir kronolojik yaşam süresi analizinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir.Sıvı kültürde TOR1, SCH9 veya RAS2 eksikliği olan mutantlar uzamış bir kronolojik yaşam süresi sergiler. Ayrıca, SCH9 ve RAS2 eksiklikleri, çeşitli karbon kaynaklarının varlığında kronolojik sağkalımı artırarak uzun ömürlülük üzerinde ekleyici bir etki gösterir. NC2 canlılık testi kullanımı bir sonraki grafikte gösterilmiştir.Birinci gün, SDC vahşi tip kültürleri seyreltildi ve karbon kaynağı içermeyen SC trip dropout plakalara ekildi. Glikoz, etanol veya gliserol ile desteklenmiş SC Tripp dropout plakaları 30 °C'de iki günde bir inkübe edildi. Her setten bir plaka alındı ve büyüme ile koloni oluşumunu sağlamak için uygun besinler eklendi.Yaşa bağlı mutasyon frekansı; suşa, arka plana, genetik manipülasyona, kültüre, koşullara ve yaşa bağlı olarak büyük ölçüde değişiklik gösterir. Bu tablo, bir vahşi tip suşta elde edilen tipik sonuçları göstermektedir. Lezyon ötesi sentezin temsili sonuçları bir sonraki görüntüde gösterilmiştir.Yaşa bağlı mutasyon frekansı artışı, nükleer ekstraktlar ve çeşitli DNA şablonları kullanılarak yapılan hatalı DNA onarımındaki değişiklikleri içerebilir olabilir. Kronolojik olarak yaşlanmış hücrelerde translasyon sentezini veya TLS'yi değerlendirebiliriz. Üç günlük stasyoner fazdaki vahşi tip ve SCH dokuz delta mutant hücrelerden alınan nükleer ekstraktlar analiz edildi.Hasarsız şablonlu TLS ürünleri düz çizgilerle, hasarlı şablonlu TLS ürünleri ise noktalı çizgilerle gösterilmiştir. Uzun ömürlü s CH nine delta mutantının nükleer ekstraktlarında trans lezyon sentezi gözlemlenmemiştir; serbest primerler açık okla belirtilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mayada kronolojik ömür ve DNA mutasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğine dair kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için Saccharomyces cerevisiae

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Görüntüleme platformu "The Lifespan Machine", büyük popülasyonların yaşam boyu gözlemini otomatikleştirir. Yaşam süresi, stres direnci, patogenez ve davranışsal yaşlanma testlerini gerçekleştirmek için gereken adımları gösteriyoruz. Verilerin kalitesi ve kapsamı, araştırmacıların biyolojik ve çevresel varyasyonların varlığına rağmen yaşlanmaya yönelik müdahaleleri incelemelerine olanak tanır.

Lifespan Machine'i kullanarak yüksek verimli davranışsal yaşlanma ve ömür testleri

Biz invaziv ve pseudohyphal farklılaşması bir önlem olarak maya yapışma ve agar işgali için kalitatif bir testtir açıklar. Bu basit testi çeşitli mutant gibi invaziv fenotip etkileri çevresel ipuçlarını değerlendirmek ve maya farklılaşma sinyalizasyon yollar kullanılabilir.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Keşfedin yaşlanmaya bağlı genomik istikrarsızlığı S. cerevisiae kronolojik ömür modeli kullanarak. Bu yöntem, yaşlanma süreçlerinde DNA mutasyonlarını ve hücre canlılığını değerlendirerek araştırmacılara gen fonksiyonlarını inceleme imkanı sunar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Daha fazla video keşfet