Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Bu prosedürün genel amacı, tekil haplo maya hücrelerini tüm replikatif yaşam süreleri boyunca takip etmektir. İlk adım, mikro pedlerden oluşan bir dizi içeren bir mikroakışkan çip hazırlamaktır. Ardından, maya hücreleri mikroakışkan çipe yüklenir ve mikro pedlerin altındaki alanın yüksekliği bir maya hücresinin çapına benzer olduğu için hücreler orada çökecektir.

Ardından, tutulan maya hücrelerinin üzerine taze besiyeri sürekli bir akış şeklinde uygulanır ve ortaya çıkan yavru hücreler besiyeri akışıyla uzaklaştırılır. Yaşlanan maya hücrelerinde meydana gelebilen hücre veya organel morfolojisi, protein ekspresyonu ve protein lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek için parlak alan ve floresan mikroskopisi kullanılır. Bu tekniğin klasik mikrodiseksiyon yöntemine göre temel avantajı, daha az iş gücü gerektirmesi ve tekil maya hücrelerinin tüm yaşam süresi boyunca uzun süreli ve sürekli mikroskobik görüntülerin alınmasına olanak tanımasıdır.

Bu yöntem replikatif yaşlanma hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda uzun süreler boyunca sürekli mikroskobik gözlem gerektiren çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez deneyen kişiler, mikro feic çipinin üretimindeki belirli adımlarda dikkatli olunması gerektiği için zorluk yaşayabilirler. Ayrıca, hücrelerin mikro feic çipine yüklenmesi bir miktar deneyim gerektirebilir.

Silikon gofret kalıbı, yumuşak litografi ile üretilir. Üretim detayları için lütfen ekteki protokole bakınız. Sert etiketten yaklaşık 0,5 milimetre çarpı üç milimetrelik ince şeritler kesin.

Bir skalpel yardımıyla şeritleri, giriş kanalları ile mikro baba arasındaki kanal yapısının hafifçe üzerine, silikon gofret kalıba dikkatlice yerleştirin. Ardından, bir cam petri kabını çift katmanlı alüminyum folyo ile kaplayın ve gofret plakayı petri kabına yerleştirin. Alüminyum folyo, mikroakışkan çiplerin üretimi sırasında PDMS'in gofret plaka ile petri kabı arasına sızmasını önleyecektir.

Mikroakışkan çiplerin hazırlanma prosedürüne başlamak için, teraziye boş bir plastik kap yerleştirin ve teraziyi daralayın. Plastik kaba 40 gram PDMS baz dökün. Bir ila 10 ağırlıkça oranında, ki bu durumda yaklaşık dört mililitreye denk gelmektedir, PDMS kürleme ajanı ekleyin.

Kullan-at plastik pipetle birkaç dakika boyunca iyice karıştırın; PDMS'in daha sonra düzgün şekilde polimerleşmesini sağlamak için karışımın iyi karıştırılması önemlidir. PDMS'i cam Petri kabındaki wafer'ın üzerine dökün. Petri kabındaki PDMS karışımı, gazı alınması (degazasyon) gereken çok sayıda kabarcık içerecektir.

PDMS, tüm kabarcıklar giderilene kadar yaklaşık 30 dakika boyunca vakum pompasına bağlı bir desikatör içindeki Petri kabında bekletilir. PDMS, üzerine wafer yerleştirilmiş Petri kabının bir sıcak plaka üzerinde önce 120 °C'de bir saat, ardından 65 °C'de bir saat daha tutulmasıyla polimerize edilir. İki saatin sonunda, alüminyum folyo wafer ve polimerize olmuş PDMS cam Petri kabından çıkarılır.

Alüminyum folyoyu gofretin arkasından PDMS'den ayırarak soyun. Ardından, PDMS tabakasını gofretin üzerinden dikkatlice kaldırın. PDMS tabakasını, kanallar yukarı bakacak şekilde tezgaha ters olarak yerleştirin ve PDMS üzerine basılmış tekil çip tasarımlarını neşter yardımıyla dikkatlice kesin.

Kanalların kenarları boyunca yaklaşık üç milimetrelik PDMS bırakmaya çalışın. Bir sonraki adım, bu şemada gösterildiği gibi giriş, çıkış ve yan kanal uçlarındaki PDMS'e delikler açmaktır. Delik açmak için, 20 gauge bir luer uçla PDMS'i düz bir şekilde tamamen delin.

Stub'ı dışarı çekmeden önce, lure stub içindeki PDMS kolonunu çıkarın. Bu işlem, PDMS kolonunun yeni delinen deliği tıkamasını önlemek içindir. Tüm delikler delindikten sonra, çipin yüzeylerini toz partiküllerinden ve kalıntı PDMS'den temizlemek için üzerine şeffaf bant yapıştırın ve bandı hemen geri çekin.

Benzer şekilde, çipin yapıştırılacağı lam camını temizleyin. Çipi ve lam camını, birbirine bağlanması gereken yüzeyleri UV lambasına bakacak şekilde masaüstü bir UV ozon temizleyicinin altına yerleştirin, altı ila sekiz dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve ardından maruz kalan yüzeyleri üst üste koyun. PDMS'in lam camına tutunmasını sağlamak ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için çipin kenarlarına hafifçe vurun.

Kanal yapısının üzerine vurmayın, çünkü bu durum mikro pedlerin kapağa yapışmasına neden olabilir. Cam için de aynısı geçerlidir. Yeni hazırlanan mikroakışkan düzeneğini 100 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine bir saat boyunca yerleştirin.

Ardından, PDMS çipin kenarlarını hafifçe yukarı kaldırarak lamelin PDMS çipe bağlanma durumunu kontrol edin. Eğer bu mümkün değilse, bağlanma başarılıdır ve çip kullanıma hazırdır. Mikroakışkan çipi hücre yüklemesine hazırlamak için, çipin camı ile tutucunun metal parçaları arasına silikon jel yerleştirerek çipi metal tutucuya yerleştirin.

Su sızdırmaz bir mühür oluşturmak için, camın kırılmasını önlemek adına somunları nazikçe sıkın. İnce tüpleri çipin yan kanalına ve çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanmak, tüplerin deliklere yerleştirilmesini kolaylaştırır.

50 mililitrelik bir luer lock şırıngayı kültür medyumu ile doldurun. Şırıngadaki havayı tahliye edin ve ardından sırasıyla bir şırıngaya bağlayın. 20 gauge luer stub, kısa kalın bir tüp ve ince bir tüpü filtreleyin.

Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve ince tüp tamamen besiyeri ile dolana kadar pompayı hızlıca ilerletin. Şırıngaya bağlı olan ince tüpü giriş kanalına itin ve besiyerinin çip boyunca dakikada 10 µL hızla akmasını sağlayın. Çipten çıkan besiyerini bir Petri kabında toplayın.

Büyük, sert etiketten yapılmış yan kanal ile çıkış kanalı arasındaki direnç farkı nedeniyle besiyeri yan kanaldan akacaktır. Çipi mikroskop tablasına yerleştirin ve mikroskobun odağını pedlere ayarlayın.

Bu prosedüre başlamak için, beş mililitrelik luer uçlu bir şırıngayı 20 gauge luer konnektöre ve kalın bir tüpe bağlayın. Şırıngaya, çipe yüklenecek yaklaşık bir mililitre hücre süspansiyonu doldurun. Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, mililitre başına bir ile beş x 10⁶ hücre arasındadır.

Şırınga pompasının akış hızını 0.5 µL/dakika değerine düşürün. Bu prosedürün en zor kısmı, hücrelerin mikroakışkan çipe yüklenmesidir. Bu işlem genellikle biraz pratik gerektirir.

Hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı çıkış kanalının tüpüne bağlayın. Şırınganın pistonuna bastırarak hücreleri yükleyin. Hücrelerin girişini ve mikro pedlerin altına yerleşmesini oküler veya bilgisayar ekranı üzerinden dikkatlice gözlemleyin.

Yeterli sayıda hücre pedlerin altına yerleşene kadar piston üzerindeki basınca devam edin. Optimum yükleme miktarı, ped başına bir ila üç hücredir. Hücre yükleme için kullanılan şırıngayı ayırın ve hava kabarcıklarını ve/veya çipten henüz çıkmamış hücreleri uzaklaştırmak için yan kanalı birkaç dakika boyunca daha yüksek akış hızlarında yıkayın.

Şırınga pompasının akış hızını tekrar 0,5 µL/dakika seviyesine düşürün ve yan kanalı, ucunda kateter tıpası bulunan kalın bir tüpe bağlayarak kapatın. Şırınga pompasının akış hızını, nihai olarak 1 ila 5 µL/dakika arasına yükseltin. Akış hızları, kullanılan ortama ve maya suşuna bağlı olarak değişiklik gösterebilir.

Mikroskop ve kamera ayarlarını deneyin amacına uygun şekilde yaparak çekime başlayın. Bu, YPD ortamında büyüyen tek bir vahşi tip E hücresinin örnek bir zaman atlamalı videosudur. Ortam görüntüleri her 10 dakikada bir alınmıştır ve gösterilen ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir.

Hücre, ölmeden önce toplam 30 tomurcuk üretir. Replikatif yaşam süresi, tek bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısı sayılarak belirlenebilir. Bu veriler, canlı hücre yüzdesinin üretilen tomurcuk sayısına veya nesil sayısına karşı grafiğe dökülmesiyle bir yaşam süresi eğrisine dönüştürülür.

Bu şekil, yabanıl tip bir maya suşu ve iki mutant suş için elde edilen yaşam süresi eğrilerine bir örnek göstermektedir. SER2 geninin silinmesi daha kısa bir yaşam süresiyle sonuçlanırken, FOB1 geninin silinmesi daha uzun bir yaşam süresiyle sonuçlanır. Yaşa bağlı mitokondriyal morfoloji, mikroakışkan cihaz kullanılarak incelenebilir.

Mitokondriyere hedeflenen ILV 3G FP ekspres eden BY 7 42 vahşi tip maya hücreleri ile bir yaşlanma deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, tek bir hücredeki mitokondriyal morfolojide yaşla ilişkili değişikliklerin temsili bir örneği beyaz ok ile gösterilmiştir. Tüm görüntüler aynı ölçeklendirilmiştir ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir.

İkinci zaman atlamalı video, mitokondriyal morfolojinin yaşın bir fonksiyonu olarak gözlemlendiği deneyden, ILV 3G FP eksprese eden tek bir hücreye aittir. Görüntüler her 30 dakikada bir alınmıştır ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir. Bu son şekil, aynı hücre setinde ilk tomurcuklarını oluşturmadan önce, 10 tomurcuktan sonra ve ölümden hemen önce, farklı replikatif yaşlarda gözlemlenen mitokondriyal morfolojileri göstermektedir.

Tübüler, fragmante tübüler, benekler ve büyük benekler olmak üzere her morfoloji sınıfına ait bir örnek görüntü eklenmiştir. Orta yaştaki hücrelerde görülen morfolojik değişiklikler, daha önce hücrelerin bölünürken sürekli olarak izlenmesiyle rapor edilenlerle benzerlik göstermektedir. Bu yöntem; bir maya hücresi neden yaşlanır, ne tür fenotipik değişiklikler meydana gelir ve bunlar mayanın replikatif yaşam süresini nasıl etkiler gibi maya replikatif yaşlanmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, temel olarak herhangi bir floresan mikroskop kullanarak kendi mikro çiplerinizi nasıl oluşturacağınızı ve hücrelerdeki replikatif yaşlanmayı nasıl inceleyeceğinizi öğrenmiş olmalısınız.