Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Bu prosedürün genel amacı, tek haplo maya hücrelerini tüm replikatif ömürleri boyunca izlemektir. İlk adım, bir dizi mikro ped içeren bir mikroakışkan çip yapmaktır. Daha sonra, maya hücreleri mikroakışkan çipe yüklenir ve mikro pedlerin altındaki alan bir maya hücresinin çapına benzer bir yüksekliğe sahip olduğundan, hücreler oraya yerleşir.

Daha sonra, sıkışmış maya hücrelerinin üzerine sürekli bir taze ortam akışı uygulanır ve ortaya çıkan yavru hücreler, orta parlak alan ve floresan akışı ile yıkanır. Mikroskopi, yaşlanan maya hücrelerinde meydana gelebilecek hücre veya organel morfolojisi, protein ekspresyonu ve protein lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek için kullanılır. Bu tekniğin klasik mikrodiseksiyon yöntemine göre en büyük avantajı, daha az emek yoğun olması ve tek tek maya hücrelerinin tüm ömrünün uzun süreli sürekli mikroskobik görüntülerini mümkün kılmasıdır.

Bu yöntem, replikatif yaşlanma hakkında fikir verebilse de, uzun süreler boyunca sürekli mikroskobik gözlem gerektiren çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü mikro feik çip üretiminin belirli adımlarında özen gösterilmesi gerekir. Ek olarak, hücrelerin mikro feik çipe yüklenmesi biraz deneyim gerektirebilir.

Silikon gofret kalıbı yumuşak litografi ile üretilir. Üretiminin detayları için lütfen ekteki protokole bakın. Metin, bir parça sert etiketi yaklaşık 0,5 milimetreye üç milimetrelik ince şeritler halinde kesin.

Bir neşter ile şeritleri dikkatlice silikon gofret kalıbının üzerine, giriş kanalları ile mikro padre arasındaki kanal yapısının hafifçe üstüne yerleştirin. Daha sonra, bir cam petri kabını çift kat alüminyum folyo ile örtün ve gofreti Petri kabına koyun. Alüminyum folyo, mikroakışkan çiplerin üretimi sırasında PDMS'nin gofret ve Petri kabı arasında çalışmasını önleyecektir.

Mikroakışkan çipler yapma prosedürüne başlamak için, terazinin üzerine boş bir plastik kap yerleştirin ve teraziyi yırtın. Plastik kabın içine 40 gram PDMS tabanı dökün. PDMS kürleme maddesini, bu durumda yaklaşık dört mililitre olan, bir ila 10 ağırlık oranında ekleyin.

Tek kullanımlık plastik pipetin birkaç dakika boyunca iyice karıştırılmasıyla, daha sonra PDMS'nin uygun şekilde polimerizasyonunu sağlamak için karışımın iyi karıştırılması önemlidir. PDMS'yi cam Petri kabındaki gofretin üzerine dökün. Petri kabındaki PDMS karışımı, Degas için çok fazla kabarcık içerecektir.

PDMS yeri, Petri kabı, tüm kabarcıklar çıkarıldığında yaklaşık 30 dakika boyunca bir vakum pompasına bağlı bir kurutucu içinde. Petri kabını gofret ile birlikte bir saat boyunca 120 santigrat derecede, ardından bir saat daha 65 santigrat derecede sıcak bir plakanın üzerine yerleştirerek PDMS'yi polimerize edin. İki saat sonra, alüminyum folyo gofret ve polimerize PDMS'yi cam Petri kabından çıkarın.

Alüminyum folyoyu gofretin arkasından PDMS'ye soyun. Ardından, PDMS katmanını gofretin üstünden dikkatlice kaldırın. PDMS katmanını, kanallar yukarı bakacak şekilde tezgaha baş aşağı yerleştirin ve PDMS üzerine basılmış tek çip tasarımlarını neşter ile dikkatlice kesin.

Kanalların kenarlarında yaklaşık üç milimetre PDMS tutmaya çalışın. Bir sonraki adım, bu şemada gösterildiği gibi giriş çıkışının ve yan kanalın uçlarında PDMS'de delikler açmaktır. Bir delik açmak için, 20 kalibrelik bir yem saplamasını PDMS'nin içinden düz bir şekilde itin.

Saplamayı dışarı çekmeden önce yem saplamasındaki PDMS sütununu çıkarın. Yine bu, PDMS sütununun yeni açılan deliği tıkamasını önler. Tüm delikler açıldıktan sonra, üzerine bant yerleştirerek ve bandı hemen çıkararak talaşın yüzeylerini toz parçacıklarından ve artık PDMS'den temizleyin.

Benzer şekilde, çipin takılacağı kapak camını da temizleyin. Çipi ve kapak camını, bir tezgah üstü UV ozon temizleyicinin UV lambasının altına, birbirine yapıştırılması gereken kenarları olacak şekilde, altı ila sekiz dakika boyunca UV ışığına maruz kalan lambaya bakacak şekilde yerleştirin ve açıkta kalan yüzeyleri üst üste koyun. PDMS'nin kapak camına yapışmasını sağlamak ve hava kabarcıklarını gidermek için çipin kenarlarına hafifçe vurun.

Mikro pedlerin kapağa takılmasına neden olabileceğinden kanal yapısının üstüne dokunmayın. Cam da öyle. Yeni yapılan mikroakışkan kurulumunu bir saat boyunca 100 santigrat derecede sıcak bir plakaya yerleştirin.

Daha sonra, PDMS çipinin kenarlarını hafifçe yukarı kaldırarak kapak camının PDMS çipine yapışıp yapışmadığını kontrol edin. Bu mümkün değilse, yapıştırma başarılı olur ve çip kullanıma hazırdır. Mikroakışkan çipi hücre yüklemesine hazırlamak için, çipi, çipin camı ile tutucunun metal parçaları arasına silikon jel ile metal tutucuya yerleştirin.

Su geçirmez bir conta oluşturmak için, camın kırılmasını önlemek için somunları hafifçe vidalayın. İnce tüpleri yan kanala ve çipin çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanımı, borunun delinmiş deliklere yerleştirilmesini kolaylaştırır.

50 mililitrelik bir yem kilit şırıngasını kültür ortamı ile doldurun. Şırıngadaki havayı çıkarın ve sırayla bir şırıngaya bağlayın. 20 gauge yem saplamasını, kısa, kalın bir tüpü ve ince bir tüpü filtreleyin.

Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve ince tüp tamamen orta ile dolana kadar pompayı hızlı ileri sarın. Şırıngaya bağlı ince tüpü şırınganın giriş kanalına itin ve ortamın çipten dakikada 10 mikrolitre hızında akmasına izin verin. Çipi bir Petri kabında bırakarak ortamı toplayın.

Ortam, yan kanal üzerinden tükenecektir. Büyük sert etiket yapımı yan kanal ile çıkış kanalı arasındaki direnç farkı nedeniyle. Çipi mikroskop tablasına yerleştirin ve mikroskobun odağını pedlerin üzerine ayarlayın.

Bu prosedüre başlamak için, beş mililitrelik yem ucu şırıngasını 20 kalibrelik bir yem saplamasına ve kalın bir tüpe bağlayın. Şırıngayı, çipe yüklenecek yaklaşık bir mililitre hücre süspansiyonu ile yükleyin. Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, mililitre başına altı hücrenin 10'unun bir ila beş katı arasındadır.

Şırınga pompasının akış hızını dakikada 0,5 mikrolitreye düşürün. Bu işlemin en zor kısmı, hücrelerin mikrom çipine yüklenmesidir. Bu genellikle biraz pratik gerektirir.

Hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı çıkış kanalının tüpüne bağlayın. Şırınganın pistonuna bastırarak hücreleri yükleyin. Oküler veya bilgisayar ekranı aracılığıyla mikro pedlerin altına giren ve yerleşen hücreleri nazikçe gözlemleyin.

Pedlerin altına yeterli hücre yerleşene kadar piston üzerindeki basıncı koruyun. Optimum yük, ped başına bir ila üç hücredir. Hücre yüklemesi için kullanılan şırıngayı ayırın ve hava kabarcıklarını ve/veya çipten henüz çıkmamış hücreleri çıkarmak için yan kanalı daha yüksek akış hızlarında birkaç dakika yıkayın.

Şırınga pompasının akışını tekrar dakikada 0,5 mikrolitreye düşürün ve ucunda kateter tıkacı bulunan kalın bir tüpe bağlayarak yan kanalı kapatın. Şırınga pompasının akışını dakikada bir ila beş mikrolitrelik bir nihai akış hızına yükseltin. Akış hızları, ortam ve maya türüne bağlı olarak değişebilir.

Deneyin amacına uygun mikroskop ve kamera ayarıyla bir film başlatın. Bu, YPD'de büyüyen tek bir vahşi E tipi hücrenin hızlandırılmış bir filmidir. Orta boy görüntüler her 10 dakikada bir çekildi ve az önce gösterilen ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil ediyor.

Hücre ölmeden önce toplam 30 tomurcuk üretir. Replikatif ömür, tek bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısı sayılarak belirlenebilir. Bu veriler, üretilen tomurcuk sayısına veya nesil sayısına karşı canlı hücrelerin yüzdesini çizerek bir yaşam süresi eğrisine dönüştürülür.

Bu şekil, yabani tip bir maya türü ve iki mutant suş için elde edilen yaşam süresi eğrilerinin bir örneğini göstermektedir. SER iki geninin silinmesi daha kısa bir ömre neden olurken, FOB bir geninin silinmesi daha uzun bir ömre neden olur. Yaşın bir fonksiyonu olarak mitokondriyal morfoloji, mikroakışkan cihaz kullanılarak incelenebilir.

Mitokondriye yönelik ILV 3G FP eksprese eden BY 7 42 yabani tip maya hücresi ile bir yaşlandırma deneyi yapıldı. Bu şekilde, tek bir hücrede mitokondriyal morfolojideki yaşa bağlı değişikliklerin temsili bir örneği beyaz okla gösterilmiştir. Tüm görüntüler aynı şekilde ölçeklenir ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil eder.

İkinci zaman atlamalı film, yaşın bir fonksiyonu olarak mitokondriyal morfolojinin gözlemlendiği deneyden ILV 3G FP'yi ifade eden tek bir hücreye aittir. Görüntüler her 30 dakikada bir çekildi ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil ediyor. Bu son şekil, 10 tomurcuktan sonra ve ölümden önce ilk tomurcuklarını üretmeden önce farklı replikatif yaşlarda aynı hücre setinde gözlemlenen mitokondriyal morfolojileri göstermektedir.

Her morfoloji sınıfının örnek bir görüntüsü, boru şeklinde, parçalı boru şeklinde, noktalar ve büyük noktalar içerir. Orta yaşlı hücrelerde görülen morfoloji değişiklikleri, daha önce bildirilenlere benzer Hücreleri bölünürken sürekli olarak izleyerek. Bu yöntem, bir maya hücresinin neden yaşlandığı, hangi fenotipik değişikliklerin meydana geldiği ve bunların mayanın replikatif ömrünü nasıl etkilediği gibi maya replikatif yaşlanmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi mikro çiplerinizi nasıl oluşturacağınızı ve temelde herhangi bir floresan mikroskobu kullanarak hücrelerde replikatif yaşlanmayı nasıl inceleyeceğinizi bilmelisiniz.