Name: Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Öğrenin, mikroakışkanlık cihazı kullanarak maya hücrelerinin tüm replikatif yaşam süresi boyunca sürekli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre yaşlanması süreçlerine değerli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mitokondriyal morfolojileri puanlama için hücre yükleme protokolü ve Marcus de Goffau ve Guille Zampar ilk sürümü yazmak için Laura Schippers teşekkür etmek istiyorum.

1. Bir Silikon Gofret Kalıp üretimi ve hazırlanması Mikroakışkan cips yumuşak litografi tarafından üretilen bir silikon yonga kalıp oluşturulur. Bu gofret mikroakışkan yongaları üretmek için birçok kez tekrar edilebilir. Bu ilgili bir gofret üretimi Mikroakiskan 6 uzmanlaşmış bir grup tarafından gerçekleştirildiğini tavsiye edilir. Gofret negatif fotorezist iki farklı katmanları, SU-8 7 kullanarak iki aşamalı bir fotolitografi işlemi yapılır. Kanalların üst katman (yüksekliği 10 mikron SU-8 2010) ile yapılır, oysa; alt tabaka, hücre bindirme alanı (yüksekliği 3-4 mikron SU-8 Aralık 2002) oluşturmak için kullanılır. Gofret üretim işleminin bir gösterim Huang ve ark 8&#39;de bulunabilir. Mikroakışkan cips çizimler ilgili bir gofret edinme hakkında yazarların yanı sıra tavsiye elde edilebilir. <ol><li> Gofret elde edildikten sonra, Sert-Tag int tek parça kesmekBir neşter ve giriş kanalları ve MicroPad dizi (Şekil 2A) arasındaki kanal yapısı üstüne biraz gofret dikkatle koyun ile 3 mm 0,5 mm kadar o ince şeritler. Bu, yalnızca hücre yükleme esnasında kullanılamaz her bir çip, büyük bir ek kanal oluşmasına neden olabilir, fakat mikroakışkan cihazın düzgün çalışması için de önem taşımaktadır. </li><li> Alüminyum folyo bir çift katmanlı ile cam Petri kabı Kapak ve Petri kabındaki gofret koydu. Alüminyum folyo gofret ve Petri kabı arasında çalışmasını PDMS önleyecektir. PDMS gofret ve cam Petri kabı arasında sürünme eğer, gofret Petri kabındaki sürekli sabit olacak. Gofret hala kullanılabilir olmasına rağmen sonları ve PDMS sonra kesmek gerekir, bu cam Petri kabı değiştirmek mümkün olmayacaktır. </li></ol> 2. Mikroakışkan Chips üretimi <ol><li> Boş bir plastik yerleştirindenge ve dara dengesine fincan. Plastik bardak (12 cm çapında cam petri için) içine 40 gr PDMS temel dökün. 4 ml 1:10 yani aw / w oranında bir pipet ile PDMS sertleştirici ekleyin. </li><li> Birkaç dakika boyunca iyice PDMS ve sertleştirici karıştırın. Bu sertleştirme ajanı pipetle için kullanılan tek kullanımlık bir plastik pipet ile yapılabilir. Bu karışım, iyi gofret üzerine dökülmeden önce karıştırılır önemlidir. Kötü karıştırma polimerize değil PDMS bir parçası neden olur. </li><li> Cam Petri kabındaki gofret üstüne PDMS dökün. </li><li> Sertleştirme maddesi ile PDMS karıştırma PDMS karışımı içinde kabarcık oluşumuna yol açacaktır. Bu kabarcıklar PDMS polimerize önce kaldırılması gerekir. PDMS bir vakum pompasına bağlı bir desikatör içinde petri yerleştirerek gofret üstüne dökülerek sonra gazı alınmış olabilir. Bu kurulum ile, karışım tüm kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Inci polimerizeBir saat boyunca 65 ° C de 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 120 ° C&#39;de sıcak bir levha üstünde gofret ile Petri kabı yerleştirerek e PDMS. </li><li> Cam Petri kabı gofret ve polimerize PDMS ile birlikte alüminyum folyo çıkarın. Alüminyum folyo ve gofret arkasından polimerize PDMS ince kalan tabaka soyun. Gofret üstüne PDMS katmanı sonra dikkatlice yukarı kaldırarak gofret ayrılabilir. </li><li> Bankta ters (yukarı bakacak şekilde kanalları) PDMS katmanı yerleştirin ve bir neşter ile dikkatle PDMS baskılı tek bir yonga tasarımları kesip. Daha sonra cam kapak için çip eki geliştirmek için kanal kenarlarında PDMS yaklaşık 3 mm korumak için deneyin. </li><li> Düz bir şekilde PDMS aracılığıyla 20 Ölçer Luer saplama tüm yol iterek giriş, çıkış ve yan kanal (Şekil 2A) uçlarında PDMS içinde delikler. </li></ol> Emin olun PDMS çipdelik delme ise hala bankta ters yatıyor. Bu kanalın tıkanmasına neden olabilir kanal içine yapışmasını PDMS engeller. <ol start="9"><li> Her delik delme sonra, tekrar saplama çekerek önce cımbız ile Luer saplama içinde PDMS sütun çıkarın. PDMS sütun aksi geride kalmak ve sadece delikli delik engelleyebilir. </li><li> Üzerinde viski bant yerleştirerek ve hemen tekrar bant kaldırarak toz parçacıkları ve artık PDMS gelen çip yüzeylerini temizleyin. Aynı çip takılacak için cam kapak temizleyin. </li><li> Tezgah üstü UV-Ozon Cleaner UV lamba altında temizlenir çip ve cam kapak yerleştirin. Birbirine bağlanmış gereken iki lamba bakmalıdır. </li><li> PDMS ortaya çıkarmak ve 6-8 dakika UV ışık cam kapak ve doğrudan daha sonra birbirlerinin üstüne yüzeyler yerleştirerek kapak camına çip koymak. </li><li> Yavaşça çip kenarından dokununcam kapak için PDMS eki teşvik etmek ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için. Bu micropads de cam kapak bağlı olsun neden olabilir gibi kanal yapısı üstüne dokunmayın. </li><li> 60 dakika için 100 ° C sıcak bir plaka üzerinde yeni yapılan mikroakışkan kurulum yerleştirin. Biraz PDMS çip kenarları kaldırmak için deneyerek kapağı cam ve PDMS çip arasındaki bağ gücünü test edin. PDMS blok cam yüzeyinden kaldırılması mümkün olmayan zaman, bir bağın başarılı olduğu ve çip kullanıma hazır hale gelir. </li></ol> 3. Hücre Yükleme için Chip hazırlanması Bir mikroakışkan cihazın arızası potansiyel mikroskop içine orta kaçağı neden olabilir. Bunu önlemek için, bir metal tutucu ve / kullanabilir veya PDMS oje veya epoksi yapıştırıcı ile cam karşılayan çipin iki mühür tavsiye niteliğindedir. Bu PDMS yonga, cam için yeterince bağlı değildir durumunda orta sızmasını önler. Aynı zamanda, borununbağlantı orta kaçağı önlemek için benzer bir şekilde ekleme noktaları etrafında güvence altına alınabilir. Kaçak durumunda şırınga pompası kapanır bir ev yapımı su sensörü ekstra bir güvenlik önlemi olarak kullanılabilir. Özellikle mikroakışkan çip için tasarlanmış metal sahibinin Çizimler yazarlar elde edilebilir. <ol><li> Çipin cam ve su geçirmez bir mühür oluşturmak için sahibinin metal parçalar arasında silikon jel ile, metal tutucuya mikroakışkan çip yerleştirin. Cam kırmak için değil, yavaşça fındık vida. </li><li> Ince tüpler (yaklaşık 5-15 cm uzunluğunda) yan kanal ve çip çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanımı daha kolay deliklere boru eklemek için yapar. </li><li> Kültür ortamı ile 50 ml Luer-Lok şırınga doldurun, şırınga hava çıkarın ve bir şırınga filtresi, 20 Ölçer Luer saplama, kısa kalın boru (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) ve ince bir tüp sıralı bağlayın. Emin olun ince küvete şırınga pompası ve mikroskop sahne arasındaki mesafe span yeterince uzun. </li><li> Hızlı ileri ince bir tüp kadar pompa tamamen ortam ile doldurulur, şırınga pompası şırınga yerleştirin. </li><li> Çipin giriş kanalının içine şırınga bağlı olan ince bir tüp itin ve 10 ul / dak (Şekil 2B) olan çip yoluyla orta akışını sağlar. Çip (bir Petri kabındaki gibi) bırakarak orta toplayın. Orta çünkü Sert Tag büyük yan kanal ve çıkış kanal yapılan arasındaki direnci fark yan kanalı üzerinden tükenecektir. </li><li> Mikroskop aşamasında çip yerleştirin ve yastıkları mikroskop odağı ayarlayın. </li></ol> Petrol Deney zaman boyunca kurumasına değil çünkü immersiyon yağı hedeflerinin kullanımı suya daldırma hedeflerinin bu tercih edilir. Mikroskop bağlı olarak f istinat ile ilgili sorunlar olabilirDeneyin ilk saatlerde ocus. Bu hücreler yükleme ve deney başlamadan önce yerleşmek böylece mikroskop aşamasında bir iki saat için çip bırakmak nedenle tavsiye edilir. 4. Mikroakışkan Chip içine Maya Hücreleri yüklenmesi <ol><li> 20 Ölçer Luer saplama ve kalın bir tüp (yaklaşık 3 cm) bir 5 ml Luer ucu şırınga bağlayın. </li><li> Yonga içine yüklenecek hücre kültürü bir örnek alın. </li></ol> Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, ml başına 1-5 x 10 6 hücre arasındadır. Yüksek hücre sayısı ile kültürleri yüklemeden önce seyreltilmesi gerekir. Hücreler ilk olarak suyla yıkandı ve yüklemeden önce benzer bir glukoz yüzdesi içeren minimal ortamda yeniden süspanse edilir ise YPD kültür hücreleri, hücre yükleme verimliliği birçok kat geliştirilebilir zaman. Çip işlemi sırasında, YPD ortamı daha güvenli bir şekilde kullanılabilir. <ol start="3"><li> Th içine hücre süspansiyonu, yaklaşık 1 ml yüke şırınga ve şırınga tüm hava çıkarın. </li><li> 0.5 ul / dak şırınga pompa akış hızı azaltın. Yükleme sırasında şırınga pompası (adım 4.5) tarafından uygulanan düşük ve sürekli akışı yan kanal (Şekil 2C) ile olmayan bağlı hücreleri itecektir. </li><li> Çıkış kanalının tüp hücre süspansiyonu içeren şırınga bağlayın. Yavaşça şırınga pistonu üzerine basarak hücreleri yerleştirin. Gelen ve göz ile micropads altında veya bilgisayar ekran üzerinden yerleşme hücreleri dikkat edin. </li><li> Yeterli hücreleri yastıkları altına yerleşmek kadar piston üzerindeki basıncı koruyun. Optimum yük ped başına 1-3 hücredir. Hücreleri rastgele yastıkları altında yerleşmek gibi, birkaç yastıkları herhangi bir hücre ve diğer yastıkları tamamen hücrelerle doldurulur içermeyen oldukça yaygındır. </li><li> Hücre yükleme ve çıkış kanalının ince borudan buna bağlı olan kalın bir tüp için kullanılan şırınga çıkarın, yan kanal hizadayüksek akış oranları (10 ul / dk) de birkaç dakika için annel hava kabarcıkları ve / veya henüz yonga (Şekil 2B) çıkmak yoktu hücreleri çıkarmak için. Hücreler yan kanal kaldırılmaz, bunlar yan kanalda büyümeye başlar ve daha sonra deney engelleyebilir. </li><li> Geri 0.5 ul / dk için şırınga pompası akışını koymak ve sonuna (Şekil 2B) bir kateter fişi içeren kalın bir tüp (yaklaşık 5 cm uzunluğunda) bağlayarak yan kanal kapatmak. </li><li> 1-5 ul / dakikalık nihai bir akış oranına akışını artırır. Akış hızları orta ve maya suşu bağlı olarak değişebilir. </li><li> Deney hedef için uygun mikroskop ve kamera ayarları ile bir film başlar. Mikroskop sahne hızını yağ takip edebilirsiniz böyle bir düşük hıza ayarlanmış olduğundan emin olun. Replikatif ömrü, görüntü hücreler her 10 dk belirlenmesi için. Halojen tarafından yayılan UV ışığının az miktarda hücreleri korumak içinDIC satın alma sırasında kullanılan lamba, ışığın yolunda ek bir UV filtresi yerleştirilmesi tavsiye edilir. Floresan mikroskobu kullanarak, bu fototoksik etkileri önlemek için (örneğin her 20 dakikada bir) daha az sıklıkla görüntü hücreleri tercih edilir. Deney Deney başlangıcında yüklenen tüm hücreler, normal koşullar altında 5 gün öncesine kadar sürer, ölü zaman tamamlanır. Düzenli olarak deney sırasında görüntülerin odak kontrol edin ve gerekirse ayarlamak için tavsiye edilir. </li></ol>

<ol><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li>
<li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li>
<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIR2%2F3%2F4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li>
<li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li>
<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan mikroakışkan yöntem sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birlikte maya replikatif ömrü veri basit ve otomatik nesil sağlar araştırma yaşlanma önemli bir yeni bir araçtır. Bu özellikler, klasik diseksiyon yöntemi deneysel olanakları üzerinde büyük gelişmeler, yine dikkate alınması gereken bir yöntem bazı sınırlamalar vardır. Bir MicroPad altında tutulur her hücre (komşu bir hücrenin tomurcuklanan hücre örneğin ondan itin olabilir çip yıkanabilir belirli bir ol...

Maya tomurcuklanma araştırmalar 1 yaşlanma için önemli bir model organizmadır. Yakın zamanda maya hücreleri yaşlanma replikatif eğitim kadar her tomurcuk elle anne hücre 2,3 kaldırıldı hangi, bir diseksiyon yöntemi gerektiren zahmetli bir süreçti. Bu sorunu çözmek için, son zamanlarda onların bütün ömrü boyunca 4 ayrı anne hücreleri izlemek mümkün yeni bir mikroakışkan kurulum sundu. Bizim mikroakışkan çip, maya hücreleri (bkz. Şekil 1) yumuşak elastomer tabanlı micropads altında sıkışıp kalırlar. Orta bir sürekli akış uzakta yeni kurulan kızı hücreleri yıkar ve taze besin hücreleri sağlar. Tek bir deneyde, 50 kadar anne hücreleri onların bütün replikatif ömrü boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir. Mikroakışkan çip mükemmel optik özellikleri nedeniyle, aynı anda maya hücre biyolojisi farklı yönleri (örneğin izlemek mümkündür </em&gt; floresan proteinleri) kullanarak. Klasik diseksiyon yöntemi ile karşılaştırıldığında, mikroakışkan kurulum önemli avantajlar sağlamaktadır. Bu bütün yaşlanma deney sırasında, tanımlı ve sürekli ortam sağlar. Hiçbir pahalı özel ekipman gerektirir ve otomatik odaklama ve zaman atlamalı yetenekleri yanı sıra sıcaklık kontrol hücre kültürü için donatılmış herhangi bir mikroskop üzerinde çalıştırılabilir. Mikroakışkan cips üretim ve operasyon birkaç gün içinde öğrenilebilir. Buna ek olarak, hücreleri doğrudan katlanarak büyüyen kültür, anne hücre biyotinilasyon gerektiren başka bir son yayınlanan mikroakışkan yöntemi 5, üzerinde bir avantaj yüklenebilir. Bir Burada anlatılan yöntemi kademeli değişiklikleri ölçmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntüleme, ile birlikte hücresel morfolojisi, maya sırasında protein ekspresyonu ve lokalizasyonu benzeri görülmemiş bir şekilde yaşlanma. Için yeteneğitek hücre uzun vadeli izleme de maya hücre döngüsü çalışmaları için eşsiz olanaklar sağlar. Bir Bu yöntem son zamanlarda bu yazının yorum iken yayınlandı protokol 16, gelen biyotinilasyon kaldırmak için optimize edilmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 elastomer </td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>Bu paket, PDMS tabanı ve PDMS kürleme maddesi içerir.</td></tr><tr><td>Cam petri kapları 120/20 mm </td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camları 22x40 mm </td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Sert Etiketler </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik tek kullanımlık bardak </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet 5 ml </td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>Scotch bant </td><td>VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Baysilone macunu (GE Bayer silikonları) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>İnce boru olarak adlandırılır </td></tr><tr><td>Tygon mikro delikli Boru, 0.030 "ID x 0.090" OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>Kalın boru olarak adlandırılır </td></tr><tr><td>Neşter </td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lok şırıngalar </td><td>BD</td><td></td> 300137 <td></td></tr><tr><td>5 ml şırıngalar, Luer ucu </td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız </td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>20 Gauge Luer saplamaları </td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtreleri (gözenek boyutu 0.20 &mu; m) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik kateter Tapası, 20 ga x12 mm </td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları </td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Tezgah Üstü UV-Ozon Temizleyici </td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pompa 11 Elite </td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 silikon ana kalıp (gofret) </td><td></td><td></td><td>Kendi kendine yapılan; Ayrıntılar için ilgili yazarla iletişime geçin </td></tr><tr><td>Balance </td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası </td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu </td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka </td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>Opsiyonel: Kapak camı için metal tutucu (22x40 mm) </td><td></td><td></td><td>Self; Ayrıntılar için sorumlu yazar </td></tr><tr><td>(Floresan) ile iletişime geçin: 60x objektif, otomatik odaklama, hızlandırılmış çekim özelliklerine sahip mikroskop ve tercihen otomatik (motorlu XY kontrolü) aşaması </td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlem geliştirici maya yaşlanma

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Biz tek tomurcuklanan maya hücreleri onların bütün ömrü boyunca izlenebilir hangi basit mikroakışkan kurulum, kullanımı göstermektedir. Mikroakışkan çip micropads bir dizi kullanarak anne ve kızı hücreleri arasındaki boyut farkı patlatır. MicroPad ve cam kapak arasındaki mesafe, bir maya hücresi (3-4 mikron) çapına benzer olduğu için yükleme sırasında, hücreler, bu micropads altında tutulur. Yerleştirme işleminden sonra, kültür ortamı sürekli olarak küçük boyutu nedeniyle yastıkları altında korunmaz ortaya çıkan kızı hücreleri üzerinden basması zamanda tüm deney boyunca sabit ve tanımlanmış bir ortam oluşturur sadece çip, ile kızarmış, ancak. Kurulum tek bir deneyde 50 kadar tek tek hücrelerin daha uzun, gerekirse, 5 gün boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir veya böylece verimli anne hücreleri korur. Buna ek olarak, yonga mükemmel optik özellikleri yüksek izinTüm yaşlanma sürecinde hücrelerin çözünürlüklü görüntüleme.

Bu protokol, hücreleri doğrudan orta-üstel kültür mikroakışkan çip yüklenir. Mikroakışkan çip sıkışıp hücrelerinin yaş dağılımı yükleme öncesi kültürünün benzer olup olmadığını tespit etmek için, hücreleri tomurcuk izleri görselleştirmek için FITC konjuge buğday agglutinin (WGA-FITC) ile boyandı. Şekil 3&#39;te görülebileceği gibi, mikroakışkan çip micropads altında hücrelerin tuzak belirli bir yaştaki hücrelere yanlı değildir. Replikatif ömrü sadece tek bir ana hücre tarafı...

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Bu prosedürün genel amacı, tekil haplo maya hücrelerini tüm replikatif yaşam süreleri boyunca takip etmektir. İlk adım, mikro pedlerden oluşan bir dizi içeren bir mikroakışkan çip hazırlamaktır. Ardından, maya hücreleri mikroakışkan çipe yüklenir ve mikro pedlerin altındaki alanın yüksekliği bir maya hücresinin çapına benzer olduğu için hücreler orada çökecektir.Ardından, tutulan maya hücrelerinin üzerine taze besiyeri sürekli bir akış şeklinde uygulanır ve ortaya çıkan yavru hücreler besiyeri akışıyla uzaklaştırılır. Yaşlanan maya hücrelerinde meydana gelebilen hücre veya organel morfolojisi, protein ekspresyonu ve protein lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek için parlak alan ve floresan mikroskopisi kullanılır. Bu tekniğin klasik mikrodiseksiyon yöntemine göre temel avantajı, daha az iş gücü gerektirmesi ve tekil maya hücrelerinin tüm yaşam süresi boyunca uzun süreli ve sürekli mikroskobik görüntülerin alınmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem replikatif yaşlanma hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda uzun süreler boyunca sürekli mikroskobik gözlem gerektiren çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez deneyen kişiler, mikro feic çipinin üretimindeki belirli adımlarda dikkatli olunması gerektiği için zorluk yaşayabilirler. Ayrıca, hücrelerin mikro feic çipine yüklenmesi bir miktar deneyim gerektirebilir.Silikon gofret kalıbı, yumuşak litografi ile üretilir. Üretim detayları için lütfen ekteki protokole bakınız. Sert etiketten yaklaşık 0,5 milimetre çarpı üç milimetrelik ince şeritler kesin.Bir skalpel yardımıyla şeritleri, giriş kanalları ile mikro baba arasındaki kanal yapısının hafifçe üzerine, silikon gofret kalıba dikkatlice yerleştirin. Ardından, bir cam petri kabını çift katmanlı alüminyum folyo ile kaplayın ve gofret plakayı petri kabına yerleştirin. Alüminyum folyo, mikroakışkan çiplerin üretimi sırasında PDMS'in gofret plaka ile petri kabı arasına sızmasını önleyecektir.Mikroakışkan çiplerin hazırlanma prosedürüne başlamak için, teraziye boş bir plastik kap yerleştirin ve teraziyi daralayın. Plastik kaba 40 gram PDMS baz dökün. Bir ila 10 ağırlıkça oranında, ki bu durumda yaklaşık dört mililitreye denk gelmektedir, PDMS kürleme ajanı ekleyin.Kullan-at plastik pipetle birkaç dakika boyunca iyice karıştırın; PDMS'in daha sonra düzgün şekilde polimerleşmesini sağlamak için karışımın iyi karıştırılması önemlidir. PDMS'i cam Petri kabındaki wafer'ın üzerine dökün. Petri kabındaki PDMS karışımı, gazı alınması (degazasyon) gereken çok sayıda kabarcık içerecektir.PDMS, tüm kabarcıklar giderilene kadar yaklaşık 30 dakika boyunca vakum pompasına bağlı bir desikatör içindeki Petri kabında bekletilir. PDMS, üzerine wafer yerleştirilmiş Petri kabının bir sıcak plaka üzerinde önce 120 °C'de bir saat, ardından 65 °C'de bir saat daha tutulmasıyla polimerize edilir. İki saatin sonunda, alüminyum folyo wafer ve polimerize olmuş PDMS cam Petri kabından çıkarılır.Alüminyum folyoyu gofretin arkasından PDMS'den ayırarak soyun. Ardından, PDMS tabakasını gofretin üzerinden dikkatlice kaldırın. PDMS tabakasını, kanallar yukarı bakacak şekilde tezgaha ters olarak yerleştirin ve PDMS üzerine basılmış tekil çip tasarımlarını neşter yardımıyla dikkatlice kesin.Kanalların kenarları boyunca yaklaşık üç milimetrelik PDMS bırakmaya çalışın. Bir sonraki adım, bu şemada gösterildiği gibi giriş, çıkış ve yan kanal uçlarındaki PDMS'e delikler açmaktır. Delik açmak için, 20 gauge bir luer uçla PDMS'i düz bir şekilde tamamen delin.Stub'ı dışarı çekmeden önce, lure stub içindeki PDMS kolonunu çıkarın. Bu işlem, PDMS kolonunun yeni delinen deliği tıkamasını önlemek içindir. Tüm delikler delindikten sonra, çipin yüzeylerini toz partiküllerinden ve kalıntı PDMS'den temizlemek için üzerine şeffaf bant yapıştırın ve bandı hemen geri çekin.Benzer şekilde, çipin yapıştırılacağı lam camını temizleyin. Çipi ve lam camını, birbirine bağlanması gereken yüzeyleri UV lambasına bakacak şekilde masaüstü bir UV ozon temizleyicinin altına yerleştirin, altı ila sekiz dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve ardından maruz kalan yüzeyleri üst üste koyun. PDMS'in lam camına tutunmasını sağlamak ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için çipin kenarlarına hafifçe vurun.Kanal yapısının üzerine vurmayın, çünkü bu durum mikro pedlerin kapağa yapışmasına neden olabilir. Cam için de aynısı geçerlidir. Yeni hazırlanan mikroakışkan düzeneğini 100 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine bir saat boyunca yerleştirin.Ardından, PDMS çipin kenarlarını hafifçe yukarı kaldırarak lamelin PDMS çipe bağlanma durumunu kontrol edin. Eğer bu mümkün değilse, bağlanma başarılıdır ve çip kullanıma hazırdır. Mikroakışkan çipi hücre yüklemesine hazırlamak için, çipin camı ile tutucunun metal parçaları arasına silikon jel yerleştirerek çipi metal tutucuya yerleştirin.Su sızdırmaz bir mühür oluşturmak için, camın kırılmasını önlemek adına somunları nazikçe sıkın. İnce tüpleri çipin yan kanalına ve çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanmak, tüplerin deliklere yerleştirilmesini kolaylaştırır.50 mililitrelik bir luer lock şırıngayı kültür medyumu ile doldurun. Şırıngadaki havayı tahliye edin ve ardından sırasıyla bir şırıngaya bağlayın. 20 gauge luer stub, kısa kalın bir tüp ve ince bir tüpü filtreleyin.Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve ince tüp tamamen besiyeri ile dolana kadar pompayı hızlıca ilerletin. Şırıngaya bağlı olan ince tüpü giriş kanalına itin ve besiyerinin çip boyunca dakikada 10 µL hızla akmasını sağlayın. Çipten çıkan besiyerini bir Petri kabında toplayın.Büyük, sert etiketten yapılmış yan kanal ile çıkış kanalı arasındaki direnç farkı nedeniyle besiyeri yan kanaldan akacaktır. Çipi mikroskop tablasına yerleştirin ve mikroskobun odağını pedlere ayarlayın.Bu prosedüre başlamak için, beş mililitrelik luer uçlu bir şırıngayı 20 gauge luer konnektöre ve kalın bir tüpe bağlayın. Şırıngaya, çipe yüklenecek yaklaşık bir mililitre hücre süspansiyonu doldurun. Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, mililitre başına bir ile beş x 10⁶ hücre arasındadır.Şırınga pompasının akış hızını 0.5 µL/dakika değerine düşürün. Bu prosedürün en zor kısmı, hücrelerin mikroakışkan çipe yüklenmesidir. Bu işlem genellikle biraz pratik gerektirir.Hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı çıkış kanalının tüpüne bağlayın. Şırınganın pistonuna bastırarak hücreleri yükleyin. Hücrelerin girişini ve mikro pedlerin altına yerleşmesini oküler veya bilgisayar ekranı üzerinden dikkatlice gözlemleyin.Yeterli sayıda hücre pedlerin altına yerleşene kadar piston üzerindeki basınca devam edin. Optimum yükleme miktarı, ped başına bir ila üç hücredir. Hücre yükleme için kullanılan şırıngayı ayırın ve hava kabarcıklarını ve/veya çipten henüz çıkmamış hücreleri uzaklaştırmak için yan kanalı birkaç dakika boyunca daha yüksek akış hızlarında yıkayın.Şırınga pompasının akış hızını tekrar 0,5 µL/dakika seviyesine düşürün ve yan kanalı, ucunda kateter tıpası bulunan kalın bir tüpe bağlayarak kapatın. Şırınga pompasının akış hızını, nihai olarak 1 ila 5 µL/dakika arasına yükseltin. Akış hızları, kullanılan ortama ve maya suşuna bağlı olarak değişiklik gösterebilir.Mikroskop ve kamera ayarlarını deneyin amacına uygun şekilde yaparak çekime başlayın. Bu, YPD ortamında büyüyen tek bir vahşi tip E hücresinin örnek bir zaman atlamalı videosudur. Ortam görüntüleri her 10 dakikada bir alınmıştır ve gösterilen ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir.Hücre, ölmeden önce toplam 30 tomurcuk üretir. Replikatif yaşam süresi, tek bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısı sayılarak belirlenebilir. Bu veriler, canlı hücre yüzdesinin üretilen tomurcuk sayısına veya nesil sayısına karşı grafiğe dökülmesiyle bir yaşam süresi eğrisine dönüştürülür.Bu şekil, yabanıl tip bir maya suşu ve iki mutant suş için elde edilen yaşam süresi eğrilerine bir örnek göstermektedir. SER2 geninin silinmesi daha kısa bir yaşam süresiyle sonuçlanırken, FOB1 geninin silinmesi daha uzun bir yaşam süresiyle sonuçlanır. Yaşa bağlı mitokondriyal morfoloji, mikroakışkan cihaz kullanılarak incelenebilir.Mitokondriyere hedeflenen ILV 3G FP ekspres eden BY 7 42 vahşi tip maya hücreleri ile bir yaşlanma deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, tek bir hücredeki mitokondriyal morfolojide yaşla ilişkili değişikliklerin temsili bir örneği beyaz ok ile gösterilmiştir. Tüm görüntüler aynı ölçeklendirilmiştir ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir.İkinci zaman atlamalı video, mitokondriyal morfolojinin yaşın bir fonksiyonu olarak gözlemlendiği deneyden, ILV 3G FP eksprese eden tek bir hücreye aittir. Görüntüler her 30 dakikada bir alınmıştır ve ölçek çubuğu beş mikrometreyi temsil etmektedir. Bu son şekil, aynı hücre setinde ilk tomurcuklarını oluşturmadan önce, 10 tomurcuktan sonra ve ölümden hemen önce, farklı replikatif yaşlarda gözlemlenen mitokondriyal morfolojileri göstermektedir.Tübüler, fragmante tübüler, benekler ve büyük benekler olmak üzere her morfoloji sınıfına ait bir örnek görüntü eklenmiştir. Orta yaştaki hücrelerde görülen morfolojik değişiklikler, daha önce hücrelerin bölünürken sürekli olarak izlenmesiyle rapor edilenlerle benzerlik göstermektedir. Bu yöntem; bir maya hücresi neden yaşlanır, ne tür fenotipik değişiklikler meydana gelir ve bunlar mayanın replikatif yaşam süresini nasıl etkiler gibi maya replikatif yaşlanmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu videoyu izledikten sonra, temel olarak herhangi bir floresan mikroskop kullanarak kendi mikro çiplerinizi nasıl oluşturacağınızı ve hücrelerdeki replikatif yaşlanmayı nasıl inceleyeceğinizi öğrenmiş olmalısınız.

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için Saccharomyces cerevisiae

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Öğrenin, mikroakışkanlık cihazı kullanarak maya hücrelerinin tüm replikatif yaşam süresi boyunca sürekli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre yaşlanması süreçlerine değerli bilgiler sağlar.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Daha fazla video keşfet