Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Bu prosedürün genel amacı, kriyo-elektron mikroskobisi kullanarak helis şeklinde birleşmiş moleküllerin üç boyutlu bir yapısını elde etmek için bir yöntem sunmaktır. Protokol, dondurulmuş hidrate EM ızgarası hazırlanırken tuz konsantrasyonunu geçici olarak azaltmak için hızlı seyreltme ve arka yüzey kurutma yöntemi kullanılarak yapılan kriyo EM numune hazırlığı ile başlar. Bu işlem, veri toplama işlemini takip eden kriyo EM düşük doz veri toplama sırasında arka plan gürültüsünü azaltıp sinyal-gürültü oranını iyileştirirken protein stabilitesini sağlar.

Kırınım desenlerinin helis indekslemesi tamamlanır. Ardından görüntü işleme gerçekleştirilir ve bunu gerçek uzay 3D rekonstrüksiyonu izler; bu süreç sonucunda HIV-1 kapsidi veya ca tüpünün nihai yoğunluk haritası elde edilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, optimal veri toplama ve analizi için birkaç kritik nokta bulunduğundan zorluk yaşayabilirler.

Örneğin, HIV durumunda, yalnızca 1 molar kaynak çözeltisinde oluşan kapsid tübüler düzenekleri, yapıyı etkilemeden tuz konsantrasyonunun hızla düşürülmesiyle elde edilir. Yüksek kaliteli cryo EM görüntüleri elde etmek kritik öneme sahiptir. Bir tüp görüntüsü verildiğinde, kritik bir tüpü indekslemek için ne yapılacağını öğrenmek ve 3D rekonstrüksiyon için hangi yazılımın değerlendirilebileceğini belirlemek oldukça zordur.

Bu video, fiziksel nesnelerin 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için ayrıntılı ve basit bir yaklaşım sunmaktadır ve deneyiniz için referans olarak kullanılabilir. Prosedürü Dr. Puja ile birlikte gerçekleştireceğim. Her ikimiz de Dr. Laboratuvarı'ndan doktora sonrası araştırmacılarız. Cryo-EM için HIV-1 kapsid proteini düzeneklerini hazırlamak için, önce 200 mesh bakır ızgaraların karbon tarafını 25 mA'da 25 saniye boyunca glow-discharge işlemine tabi ederek başlayın.

Çevresel oda içindeki nemi %80'e getirmek için, el yapımı bir manuel yerçekimi pistonu olan bir nebulizör kullanın. Bu sırada, sıvı etanı bir vitro şişe piston düzeneğinde sıvı azot ile soğutun ve şok dondurma düzeneğini manuel yerçekimi pistonuna monte edin. Ardından, penset kullanarak pensleri ızgara kenarına sabitleyin.

Önceden hazırlanmış protein çözeltisinden 2.5 µL'yi gridin karbon tarafına uygulayın. Ardından, gridin karbon tarafı karşıya bakacak şekilde forsepsi pistonun üzerine yerleştirin. Gridin arka tarafına üç µL düşük tuzlu dilüsyon tamponu ekleyin.

Izgarayı hemen aynı taraftan bir parça filtre kağıdıyla kurulayın. Izgaranın tüm arka yüzeyini yaklaşık altı saniye boyunca filtre kağıdıyla yakın temas halinde tutun. Filtre kağıdını çıkardıktan sonra, ızgarayı hemen sıvı etana daldırın.

Son olarak, forsepsi pistonla temas eden bölgeden çekin ve gridi hızlıca bir grid saklama kutusuna aktarın. Dondurulmuş hidratize gridi, 200 kilovolt'ta çalışan ve gatin 4K by 4K CCD kamera ile donatılmış bir FEI polar G two elektron mikroskobuna yükleyerek kriyoelektron mikroskobisine başlayın.

Düşük doz arama modunda, yaklaşık 200 x büyütme ekleyin. Tüm ızgarayı uygun buz içeren alanlar için tarayın. Bu alanların konumlarını bir sahne dosyasına kaydedin.

Kaydedilen konumları geri çağırın ve bu alanları daha ayrıntılı inceleyin. Düşük doz arama modunda 3.900 x büyütme ekleyin. Veri toplama için, bir delik üzerinde asılı uzun tüpler içermesiyle karakterize edilen, düzgün ince buz tabakasına sahip alanları seçin.

Tüm alanları ikinci aşama dosyasına kaydedin. Pozlama moduna geçin. 59.000 x büyütme ekleyin ve 100 mikrometre objektif açıklığı yerleştirin.

Ardından, pozlama başına angstrom kareye yaklaşık 15 elektron düşecek şekilde objektif stigmatizmini ve demet yoğunluğunu ayarlayın. Düşük doz arama moduna geri dönün ve kaydedilmiş bir konuma gidin. Uygun bir tüp belirleyip merkezleyin.

CCD kamera kullanılarak odaklama moduna geçilir, odak ayarı yapılır ve normalde 0,5 ile 2,5 mikrometre arasında bir defocus değeri belirlenir. Ardından pozlama moduna geçilir ve angstrom kare başına 15 elektronluk bir doz için 0,3 ile 0,5 saniye arasında bir pozlama süresi ayarlanır. Pozlama yapılmadan önce filmlerin 10 saniye boyunca yerleşmesine izin verilerek görüntüler bir plaka kamera ile toplanır.

Görüntülerin toplanmasının ardından, bir sonraki kaydedilmiş konuma geçin ve daha fazla görüntü toplamak için bu işlemi tekrarlayın. Filmleri tam konsantrasyonlu D 19 içinde 12 dakika boyunca banyo edin. Ardından görüntüleri, 6.35 micrometers piksel boyutunda bir Nikon Super cool scan 9, 000 ED tarayıcı kullanarak dijitalleştirin.

Helisel bir nesne iki parametre ile indekslenebilir: Helisel bir nesnenin yüzey kafesinin Fourier dönüşümündeki Bessel mertebesi N ve tabaka çizgisi numarası L. Her tabaka çizgisi N ve L ile karakterize edilir ve H ve K indeksleri ile belirtilen yüzey kafesindeki bir dizi çizgiye karşılık gelir.

Helikal indekslemeye başlamak için, Iman'ın Helix boxer programını kullanarak üniform çapta, nispeten uzun ve düz bir tüp alanını belirleyin ve görüntüyü MRC formatında kaydedin. Ardından, Iman'ın boxer programını kullanarak tüpün yarıçapını ölçün. MRC paketindeki I-M-G-C-C-F gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak HEL tekrar mesafesini belirleyin.

Ardından foyer'i hesaplayın. Tekrar mesafesinin bir katı olan yeni bir kutu uzunluğu ile dönüştürün. Sonra, FFT piksel birimlerinde bir sıfır ve sıfır bir olarak iki temel yüzey örgü vektörünü tanımlayan iki temel katman çizgisi seçin.

Fourier dönüşümündeki iki ana katman çizgisi için katman çizgisi numaralarını ve maksimum genlik yarıçaplarını belirleyin. İki ana katman çizgisi için katman çizgisi numaraları ve Bessel dereceleri değerleri verildiğinde, alt birimler arasındaki rotasyon ve tek yıldızlı helisin aksiyel yükselmesi, yazılı prosedürde açıklanan seçilim kuralı kullanılarak elde edilebilir. Bu iki gerçek sayı, tüpün vida simetrisini tanımlar.

3D yeniden yapılandırma, Iman programı Boxer kullanılarak partikül segmentasyonu ile başlar. Helis partiküller içeren bir mikrograf açıldıktan sonra, Boxer kontrol panelinde bir partikülü örtüşen segmentlere ayırın. Helis modunu seçin ve kutulama parametrelerini ayarlayın.

Kutunun boyutu, partikül çapından daha büyük olmalı ve OLA değeri, kutu boyutunun yaklaşık %90'ı kadar olmalıdır. Sol tarafa tıkladıktan sonra, partikül kutusunun herhangi bir ucuna tıklamak, heliks uzunluğu boyunca otomatik olarak bir dizi partikül kutusu oluşturacak ve kutulanmış segmentleri koordinatlarıyla birlikte kaydedecektir. Bir sonraki adım, I-H-R-S-R ile işlem yapmadan önce, iteratif helikal gerçek uzay yeniden yapılandırma yöntemi I-H-R-S-R'yi kullanarak başlangıç 3D yeniden yapılandırmasını gerçekleştirmektir.

Kriyo-EM görüntülerinin kontrastını tersine çevirin ve LOWPASS filtresi uygulayın. Ardından, generator yazarak I-H-R-S-R programının grafik arayüzünü açın. Grafik arayüzüne, yığın adı ve yolu, yığındaki görüntü sayısı ve simetri parametreleri değerleri dahil olmak üzere, kutulanmış partikül yığınına ait tüm bilgileri sağlayın.

Yeniden yapılandırma betiğini oluşturmak için bitir düğmesine tıklayın. B 25 SP.I başlangıç referansı olarak dolu veya içi boş bir silindir kullanın ve tanımlanan vida simetrisinde herhangi bir değişiklik kalmayana kadarle, genellikle birkaç döngüden sonra gerçekleşir, prosedürün döngüye girmesine izin verin. Sağ el helis simetrisi, kararlı bir şekilde yakınsamış bir yeniden yapılandırma sağlamalıdır.

Son döngüde oluşturulan yeniden yapılandırma, daha ileri rafine etme işlemi için başlangıç referansı olarak kullanılacaktır. Son olarak, I-H-R-S-R tarafından oluşturulan 3D yoğunluk haritasını, rafine etme sırasındaki ek iyileştirmeler için başlangıç referansı olarak kullanarak iteratif rafine etmeli 3D yeniden yapılandırma gerçekleştirin. Helikal simetri, I-H-R-S-R prosedüründen belirlenen alt birimler arasındaki rotasyon ve aksiyel yükselme değerlerinde sabitlenmiştir.

Ardından, CTF find three ve CTF tilt programları ile mikrograftaki defokus ve astigmatizmayı belirleyin; ardından spider programları olan FT ve mu kullanarak partikül segmentlerini kontrast transfer fonksiyonu (CTF) ile çarpın. Çok referanslı hizalama kullanarak, referans hacimlerin projeksiyonlarını CTF ile düzeltilmiş görüntülerle karşılaştırarak projeksiyon eşleştirmesi gerçekleştirin. Düzlem dışı eğim açısındaki varyasyon artı veya eksi 10 derece ile sınırlandırılmış ve bir derecelik adımlarla örneklenmiştir; sıfır veya 180 dereceye yakın düzlem içi açılarda yüksek korelasyon katsayıları ve sınırlı X kaymaları gibi kısıtlamalar tanımlayın.

Her segmentin hizalama parametreleri için, rekonstrüksiyona yalnızca kısıtlamaları karşılayan segmentleri dahil edin. Her iteratif iyileştirme döngüsünden sonra, geri projeksiyon kullanılarak ve CTF karesine bölünerek bir 3D rekonstrüksiyon oluşturulur ve simetrili bir hacim üretmek için helikal simetri uygulanır. İteratif iyileştirme, yeni 3D rekonstrüksiyonun çözünürlüğünde daha fazla iyileşme görülmediğinde sonlandırılır.

Tek bir HIV-1 kapsid montajı, bir 92 e tüpü, kutucuklara ayrıldı ve helis indekslemesi için Fourier dönüşümü hesaplandı; iki yarıçap, katman çizgisi numaraları ve 10 ve 01 katman çizgileri için maksimum genlik yarıçapları belirlendi. Ardından, 5195,48 angstrom tekrarlama mesafesi ile sırasıyla 10 ve 01 için -12 ve 11 negatif uç değerleri hesaplandı. Tüpün vida simetrisi delta Z = 6,81 angstrom ve delta 5 = 328,88 derece olarak belirlendi; I-H-R-S-R kullanılarak delta Z ve delta 5 değerleri sırasıyla 7,13 angstrom ve 328,86 dereceye rafine edildi ve 10 iteratif döngü sonrası başlangıç rekonstrüksiyonu oluşturuldu.

İteratif iyileştirme sonrası nihai rekonstrüksiyon, I-H-R-S-R ile hesaplanan ilk modele kıyasla yoğunluk haritasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Kapsid montaj tüplerinin yoğunluk haritası; tüp eksenine paralel ve yüzeye yakın, tüp eksenine dik ve tüp eksenine paralel ve eksen boyunca üç ortogonal kesit olarak görüntülenmiştir. Görüntülenen yapı, %100 hacmi kapsayan 1.8 Sigma değerinde konturlanmış 3D yoğunluk haritasının yüzey oluşturma (surface rendering) işleminin sonucudur.

Bu videoyu izledikten sonra, kriyojenik elektron mikroskopi kullanarak monte edilmiş bir molekülün 3D yapısının nasıl elde edileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.