Name: Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Öğrenin, kriyojenik elektron mikroskobu kullanarak HIV-1 kapsid montajlarının üç boyutlu yapısını nasıl elde edeceğinizi. Bu yöntem, yapısal biyoloji araştırmalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik destek için Dr. Gongpu Zhao ve Danxia Ke teşekkür etmek istiyorum. Biz Dr teşekkür ederim. Edward ve görüntü işleme yazılımları paylaşmak için Egelman ve Niko Grigorieff. Ayrıca, Yapısal cryo-EM tesis Biyoloji ve University of Pittsburgh Tıp Okulu Beowulf ve ızgara destek personeli kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma GM082251 ve GM085043 tarafından desteklenmiştir.

1. Frozen-sulu EM numune hazırlama HIV-1 kapsid protein (CA) derlemeleri 9 cryo-EM görüntüler güçlü bir arka plan gürültü katkıda bulunan yüksek tuz (NaCl) 1M tampon, sadece kararlı olduğundan, biz geçici tuzu azaltmak için hızlı bir seyreltme ve arka tarafında blot yöntemi kullanın konsantrasyonu dondurulmuş sulu EM ızgara hazırlanıyor. <ol><li> 25 saniye için 200-örgü R2 / 1 Quantifoil bakır ızgaralar 25mA altında Glow deşarj karbon tarafında. </li><li> % 80 nem, ev yapımı bir el yerçekimi piston, çevre odasında getirmek için bir nebülizatör kullanın. </li><li> FEI Vitrobot Piston Dewar, sıvı nitrojen kullanarak serin sıvı etan. Dalma dondurma Dewar manuel yerçekimi piston üzerine monte edin. </li><li> Forseps üzerine monte edilmiş ızgara, karbon yüzüne 2.5 ul önceden monte edilmiş CA çözüm uygulayın ve forseps karbon yüzü size dönük ızgara piston üzerine yük. </li><li> Izgara, arka tarafına, düşük tuz seyreltme tamponu (100 mM NaCl) 3 ul ekleyin ve filtre kağıdı bir parça ızgara arka tarafında hemen kurulayın. Izgara tüm arka yüzeyine filtre kağıdı çıkarmadan önce, yaklaşık 6 saniye filtre kağıdı ile yakın temas halinde olmalıdır. Izgara filtre kağıdı çıkardıktan sonra hemen sıvı etan içine dalıyoruz. </li><li> Piston forseps çıkarın ve ızgara ızgara saklama kutusu içine hızlı bir şekilde aktarmak. </li></ol> 2. CA borulu Cryo-elektron mikroskobu <ol><li> 200kv FEI Polara G2 elektron mikroskobu işletim dondurulmuş sulu ızgara Yük ve Gatan 4Kx4K CCD kamera ile donatılmıştır. </li><li> Düşük doz arama modu, ~ 200x büyütme altında ve bir doz &lt;0.001e - / Å 2, ekran uygun buz ve bir aşama dosyasını bu alanların konumları kaydetmek alanlar için tüm ızgara. </li><li> Düşük doz arama modunda 3900 x büyütme kayıtlı pozisyonları ve bu alanlarda daha fazla ekran hatırlayın. Veri toplama, delik üzerinde iyi ayrılmış, uzun tüpler içeren buz düzgün, ince bir tabaka ile alanları seçin. Ikinci bir aşama dosyasını bu alanların yerleri kaydedin. </li><li> 59.000 x büyütme, içerlek 100 mikron objektif diyafram pozlama modu Switch ve ~ 15 e bir doz için objektif stigmatism ve ışın yoğunluğunu ayarlayın başına / Å 2 poz. </li><li> Düşük doz arama moduna dönün, kayıtlı bir konuma taşımak ve CCD kamera kullanarak iyi bir tüp belirlemek ve merkez. Odak moduna geçer, odak ayarlamak ve bulanıklaştırma değerini ayarlamak, normalde arasında 0,5 - 2,5 mm. Pozlama modu Switch, 15 e bir doz, 0.3-0.5 saniyelik bir pozlama süresi seti - 2 / a, ve bir görüntü toplamak. Bir tabak kamera görüntüleri toplanır ve bir pozlama çekilmeden önce filmler 10 saniye boyunca yerleşmek için izin verilmelidir. </li><li> Sonraki kaydedilen pozisyona taşıyın ve daha fazla görüntü toplamak için 5. adımı yineleyin. </li><li> Filmler, 12 dakika için tam güç D19 geliştirilen ve 6.35 mikron piksel boyutu Nikon Super COOLSCAN 9000 ED, tarayıcı ile dijital. Görüntü dosyalarının formatı TIFF. </li></ol> 3. Helisel indeksleme Sarmal bir nesne iki parametre endeksli olabilir: Bessel sipariş, n, ve katman hattı sayısı, l. Fourier dönüşümü (n, l) ile karakterize Her katman, 2D bir kafes notasyonu kullanarak, (h, k) endeksleri ifade sarmal nesnenin yüzey kafes çizgiler kümesi karşılık gelir. Herhangi bir (h, k), bir (n HK, l HK) katmanı hattı, n ve l değerleri iki temel vektörleri (n = 10, l 10) ve (n = 01, l 01), doğrusal bir kombinasyonu başlıca iki tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) l, Fourier dönüşümü, Z ekseni boyunca ölçülen tabaka satır yüksekliği elde edilebilir. N değeri aşağıdaki denklem 10 kullanılarak tahmin edilebilir πRr ≈ J n ≈ 1.1 | n | -0.9 .....................( 1) J n n'inci katman hattının yoğunluğunu belirleyen Bessel fonksiyonu, nerede, r yarıçapı sarmal nesne ve katman hattının maksimum genlik R yarıçapı. Katman satır numarasını, l, n seçim kuralı 11 ile ilgili l = tn + um ....................( 2) t ve u sarmal sabitler. Herhangi bir sarmal için, (ya da çok yakından) aynen t c tam u birimleri olabiliromplete döner. <ol><li> EMAN programı 12 helixboxer ve MRC formatında görüntü kaydetmek kullanarak düzgün bir çapa ile nispeten düz ve uzun bir tüp dışarı Kutusu. </li><li> MRC paketi 13 'imgccf' gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak sarmal tekrar mesafe, c, belirleyin. </li><li> Fourier dönüşümü, tekrar mesafe, c ayrılmaz yeni bir kutu süresini hesaplayın . </li><li> Iki temel yüzey örgü vektörleri (1,0) ve (0,1) iki temel tabaka hatları seçin. </li><li> Tüp yarıçapı, r, Fourier dönüşümü, l 10, R 10, sırasıyla l 01 R 01, (Şekil 1), iki ana katman hatları yükseklik ve yarıçapı ölçün . </li><li> N 10 ve n 01, denklem (1) 'e göre hesaplayın. </li><li> N değerleri yalnızca tahmin olduğundan, birkaç kombinasyonları n 10 ve n 01 program paketi IHRSR kullanarak doğru sarmal simetri bulmak için (4.2 adım) daha sonraki adımda test edilmektedir . </li><li> Alt birimden (Δφ) ve tek-yıldızlı sarmalın eksenel artış (Δz) (n = 1) arasında rotasyon iki gerçek sayının tarafından açıklanan vida simetri hesaplayın. L 10, 01, l n = 10 ve n 01 değerleri göz önüne alındığında, u, t, m değerleri aralığı (örneğin, -50 &lt;m &lt;50) seçim kuralına göre test elde edilebilir Son olarak, Δφ ve Δz kullanılarak hesaplanmıştır Δφ = 360 t / u ve Δz = c / u. </li></ol> 4. Üç boyutlu rekonstrüksiyon <ol><li> Parçacık segmentasyon <ol><li> EMAN paket bir program grafik programı Boxer, kullanarak, sarmal parçacıklar içeren bir mikrografı açın. </li><li> Sarmal parçacık örtüşen bölümler halinde kesin. Boxer kontrol paneli, Helix modunu seçebilir ve boks için parametreleri ayarlayın: kutusunun boyutu, partikül çapı ve 'Olap' kutusu boyutu ~% 90 olmalıdır değeri daha büyük olmalıdır. </li><li> Sarmal parçacığın her iki uçta da sol tıkladıktan sonra, Boxer sarmalın uzunluğu boyunca bir dizi parçacık kutuları otomatik olarak üretecektir. </li><li> Kutulu segmentleri yanı sıra onların koordinatlarını kaydedin. </li></ol></li><li> İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon IHRSR programları kullanarak <ol><li> Cryo-EM görüntülerin kontrast ters çevirin ve iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi (IHRSR) ile işleme önce 14 (isteğe bağlı) filtreleme alçak geçiren uygulamak. </li><li> "Generator" yazarak grafik arayüzü IHRSR programı açın. Kutulu parçacıklar yığınının adını ve yolunu yığın yığın görüntülerin sayısı da dahil olmak üzere tüm bilgi, grafik arayüzü sağlayın, simetri parametreler için değerler, vb yeniden yapılanma komut dosyası oluşturmak için "Finish" düğmesine tıklayın. b25.spi. </li><li> Katı veya içi boş silindir ilk bir referans olarak kullanın ve genellikle birkaç döngüsünden sonra oluşur tanımlanan vida simetri hiçbir değişiklik olana kadar geçiş yapmak için prosedür izin. Doğru bir sarmal simetri stably bir tümleşik yeniden yapılanma vermelidir. Son döngüsünde oluşturulan yeniden yapılanma için bir başlangıç ​​daha fazla arıtma referans olarak kullanılacaktır. IHRSR ÖRÜMCEK programları kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon gerçekleştirir. </li></ol></li><li> Iteratif arıtma 15 ile İmar IHRSR tarafından oluşturulan 3 boyutlu rekonstrüksiyon artık ek bir arıtma için ilk referans olarak kullanılır. Arıtma sırasında, sarmal simetri Δφ ve Δz, IHRSR prosedürü belirlenir sabittir. <ol><li> Odak ve astigmatizma mevcut programları CTFFIND3 ve CTFTILT 16 mikrografı belirleyin. </li><li> ÖRÜMCEK programları kullanarak 17 CTF parçacık segmentleri çarpın. ÖRÜMCEK suite FT olarak adlandırdığı operasyon 2B görüntü Fourier dönüşümü (FFT) hesaplamak için kullanılır. Bundan sonra, FFT ÖRÜMCEK paketi içinde MU olarak adlandırılan işlemi kullanarak, önceki adımlarda belirlenen, CTF değerleri ile çarpılır. Elde edilen değer, daha sonra ters ÖRÜMCEK işlemi kullanarak gerçek uzayda yeni bir resim (CTF düzeltilmiş) formuna geri dönüştürülmüş, FT tekrar. </li><li> Çok referans hizalama kullanılarak referans hacimleri projeksiyonları, CTF-düzeltilmiş görüntüleri karşılaştırarak projeksiyon eşleşen gerçekleştirin. Düzlem-dışı eğim açısı değişimi + / -10 ° ve 1 ° adımları örneklenir. Her segmentin hizalama parametreler için, bu tür yüksek korelasyon katsayıları gibi sınırlamalar, 0 ° veya 180 °, ve x-vardiya sınırlı yakınında düzlem açıları tanıtın. Kısıtlamaları karşılamak yeniden yapılanma, sadece bu bölümlerini içerir. </li><li> Her arıtma döngüsü yinelemeli sonra, 3D rekonstrüksiyon CTF üzerinden toplamı geri projeksiyon kullanarak üretilen ve bölünmüş.2. </li><li> Sarmal simetri simetrik olmadı hacmi oluşturmak için uygulanmalıdır. Yeni 3 boyutlu rekonstrüksiyon çözünürlükte daha fazla iyileşme meydana geldiğinde iteratif arıtma sonlandırıldı. </li><li> Görüntü işleme paketi ÖRÜMCEK arıtma adımları çoğu için kullanılır. Bir dizi operasyon, operasyon ve parametre değerleri dizileri içeren kullanıcı tarafından oluşturulan toplu denetim dosyaları ÖRÜMCEK scriptleri, tarafından kontrol edilir. Nihai yeniden yapılanma ÖRÜMCEK suite programları kullanılarak hesaplanır. </li></ol></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Tek bir HIV-1 CA A92E tüp (Şekil 1a) kutulu çıkışı ve onun Fourier dönüşümü (Şekil 1b) sarmal indeksleme için hesaplandı. L 10 tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) = 28, 01 L = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. 211.57Å bir tüp yarıçapı göz önüne alındığında, biz yaklaştırılmış n 10 = 12, n 01 = 11 (burada, ellilik önceden belirlenmiş). 5195.48Å tekrar mesafesi ile, tüp vidalı simetri Δz olarak belirlendi = 6.8093Å Δφ = 328,88 °. Δz ve Δφ 7.1321Å ve 328,86 rafine ° IHRSR (Şekil 2a) ve ilk rekonstrüksiyon Şekil kullanarak. 2b. Nihai yeniden yapılanma (Şekil 3), arıtma yinelemeli sonra, IHRSR (Şekil 2b) ile hesaplanan ilk model yoğunluk haritası önemli ölçüde geliştirilmiş. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, HIV-1 CA helisel tüp Endeksleme . (A) tek bir HIV-1 CA A92E tüp görüntü. Ölçeği bar, 30 nm. (B) (A) gösterilen tüp Fourier dönüşümü. Helisel indeksleri (n = 10 = 12, n 01 = 11) gösterilir. 23a çözünürlükte katman çizgiye ok ucu noktaları. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 IHRSR kullanan bir ilk rekonstrüksiyon. (A) her yinelemeli döngüsü için Vida simetri belirlenmesi. 10 arıtma döngüleri iteratif Δφ ve Δz sonra, ilk değerlerinden başlayarak, sabit değerler yakınsar. (B) 10 saniye sonra ilk 3D yoğunluk haritası döngüleri yinelemeli. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Iteratif arıtma sonra 3D yoğunluk haritası. (AC) CA tüplerin yoğunluğu haritası üç ortogonal dilim olarak görüntülenir: tüp eksenine paralel ve dik tüp ekseni (B), yüzey (A) yakın ve paralel olarak tüp ekseni (C) aracılığıyla . Ölçek barlar, 10 nm. (D)% 100 hacim içine 1.8s 3D yoğunluk haritası Yüzey render konturlu.

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li>
<li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+model+of+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li>
<li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li>
<li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li>
<li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li>
<li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li>
<li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li>
<li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li>
<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+electron+cryo-microscopy%3A+towards+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li>
<li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz sarmal nesnelerin 3D yapılar elde etmek için basit bir yaklaşım sağlamak için bir dizi protokoller mevcut. Açıklanan prosedürleri kullanarak, tek bir tüp görüntü (176 parça), HIV-1 kapsid montaj 3 boyutlu bir yapı elde etti. Yüksek çözünürlüklü yapıları, daha fazla görüntü verilerinin de dahil elde edilebilir. En uygun veri toplama ve analiz için pek çok kritik nokta vardır: Birincisi cryo-EM örneğinin hazırlanması sırasında, örnek çözümü örneklem büyüklüğü biraz daha kalın bir çözüm üniforma, ince bir tabaka bırakarak uzakta, lekelenen olmalıdır. Örnek blot için birkaç farklı yolu vardır. Bakteri hücreleri ve HIV-1 CA montaj gibi borulu örnekler, özellikle arka-yan, bir tarafı blot için çok uygundur. İkincisi, sarmalın ellilik bu sarmal indeksleme ya da yeniden yapılamaz olarak tespit edilmesi gerekiyor. Döner ellilik belirlemek için 18 gölgeleme takip dondurma yakma, ortak bir uygulama kullanmak için. Ellilik, yoğunluk haritası çözünürlük yeterince yüksek olduğunda da yeniden yapılandırma sonrası tespit edilebilir, doğru bir ellilik varsayılır bileşenleri tek tek 3 boyutlu atom modelleri de yoğunluk haritasına uygun olmalıdır. Aksi takdirde, bunun tam tersi ellilik kabul edilmelidir. Üçüncü olarak, Wiener filtresi, gürültüyü amplifikasyon azaltmak için, her iki faz ve genlik düzeltme için görüntü işleme sırasında kullanılan olmalıdır. Tek bir görüntü CTF her zaman sıfır geçişleri bu yana, karşılıklı alan bilgilerin bir kısmını kaybetmiş. Bu nedenle, farklı odak dışı değerleri 3D rekonstrüksiyon, her görüntülü dahil birden fazla projeksiyon veri setleri için gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Kaynak </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 100X Kızdırma deşarj </td><td> 100X Kızdırma deşarj </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara Field Emission Gun F30 mikroskop </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K CCD kamera </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Dalma-donma cihaz </td><td></td><td> Ev yapımı el yerçekimi piston </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-karbon, bakır ızgaralar </td><td> Quantifoil Micro Araçlar, Jena, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> EM yazılımı EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM yazılımı IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Edward H. Egelman Programlar </td></tr><tr><td> EM yazılımı Örümcek </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC merkezli helisel işleme yazılımı </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Koji Yonekura Programlar </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT ve Gerçek uzay sarmal arıtma yazılımı </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-elektron mikroskopi tarafından hiv-1 kapsid meclisleri yapısı ve iteratif helisel gerçek uzay İmar

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Görüntü işleme ile birlikte Cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM), makromoleküler protein kompleksleri ve meclislerinin yapısı tayini için giderek daha güçlü bir araç. Aslında, tek parçacık elektron mikroskobu (2D) iki boyutlu elektron kristalografisi 2 nispeten rutin metodolojileri ve çok sayıda yapılar haline gelmiştir 1 ve bu yöntemler kullanılarak çözüldü. Aynı zamanda, görüntü işleme ve helis nesneleri üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu, özellikle sarmal sarmal simetri ile birlikte tek parçacık analiz araçları kullanır gerçek-uzay rekonstrüksiyon (IHRSR) yöntemiyle 3, iteratif hızla gelişmiştir. Sarmal bir varlık 3D yoğunluk haritası, tek bir projeksiyon elde edilebilir, çünkü pek çok biyolojik varlıklar, ipliksi ya da sarmal formları da dahil olmak üzere aktin filamentler 4, mikrotüplerin 5, amiloid lifleri 6, tütün mozaik virüsü 7, ve bakteri kamçısı 8, ve fonksiyon IHRSR yöntemi ile sarmal olmayan bir nesnenin 3D yeniden inşası için gerekli olan çok sayıda resim, esnek ve düzensiz sarmal meclislerinin yapısal analizi ile karşılaştırıldığında görüntü, şimdi ulaşılabilir. Bu video makalede, cryo-EM cryo-EM numune hazırlama, düşük doz veri toplama protokoller de dahil olmak üzere bir sarmal protein montaj 3D yoğunluk haritası (HIV-1 kapsid 9 bizim örneğimizde), indeksleme elde etmek için detaylı protokolleri sarmal kırınım desenleri ve IHRSR kullanarak görüntü işleme ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, cryo-EM yakın doğal koşullar altında en iyi örnek koruma sunar. Örnekleri vitreus buz ince bir tabaka halinde hızlı dondurma, gömülü ve radyasyon hasarı en aza indirmek için düşük doz koşulları altında, sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskopları imaged. Örnek görüntüler, düşük sinyal ve düşük kontrast kaydedilen mikrograflar pahasına yakın yerli koşullar altında elde edilir. Neyse ki, helisel yeniden yapılanma sürecini büyük ölçüde sarmal kırınım endeksleme dışında, otomatik olmuştur. Burada bir yaklaşım anasayfası sarmal yapısını tanımlamak ve sayısallaştırılmış mikrograflar, 3D helisel yeniden inşası için önemli bir adım sarmal simetriler (helisel parametreleri) belirlemek. Kısaca, biz IHRSR yöntemi uygulayarak ilk 3D yoğunluk haritası edinin. Bu ilk harita sonra iteratif böylece özgürlük derece kontrol, her segment hizasını parametreleri için kısıtlamalar getirerek rafine edilir. Elektron mikroskobu (genlik ve faz düzeltme) kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzelterek ve montaj sarmal simetri optimize ederek daha da iyileştirilmesi sağlanır.

Bu makale kriyo-elektron mikroskobu ile helisel monte moleküllerin üç boyutlu (3D) yapısı elde etmek için bir yöntem açıklanır. Bu protokol, HIV-1 kapsid meclisleri iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi ile bir yoğunluk haritası ulaşmak için ayrıntılı 3 boyutlu rekonstrüksiyon prosedürü göstermek için kullanın.

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Görüntü işleme ile birleştirilen kriyoelektron mikroskobu (cryo-EM), makromoleküler proteinlerin yapı belirlemesi için giderek daha güçlü bir araç haline gelmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, kriyo-elektron mikroskobisi kullanarak helis şeklinde birleşmiş moleküllerin üç boyutlu bir yapısını elde etmek için bir yöntem sunmaktır. Protokol, dondurulmuş hidrate EM ızgarası hazırlanırken tuz konsantrasyonunu geçici olarak azaltmak için hızlı seyreltme ve arka yüzey kurutma yöntemi kullanılarak yapılan kriyo EM numune hazırlığı ile başlar. Bu işlem, veri toplama işlemini takip eden kriyo EM düşük doz veri toplama sırasında arka plan gürültüsünü azaltıp sinyal-gürültü oranını iyileştirirken protein stabilitesini sağlar.Kırınım desenlerinin helis indekslemesi tamamlanır. Ardından görüntü işleme gerçekleştirilir ve bunu gerçek uzay 3D rekonstrüksiyonu izler; bu süreç sonucunda HIV-1 kapsidi veya ca tüpünün nihai yoğunluk haritası elde edilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, optimal veri toplama ve analizi için birkaç kritik nokta bulunduğundan zorluk yaşayabilirler.Örneğin, HIV durumunda, yalnızca 1 molar kaynak çözeltisinde oluşan kapsid tübüler düzenekleri, yapıyı etkilemeden tuz konsantrasyonunun hızla düşürülmesiyle elde edilir. Yüksek kaliteli cryo EM görüntüleri elde etmek kritik öneme sahiptir. Bir tüp görüntüsü verildiğinde, kritik bir tüpü indekslemek için ne yapılacağını öğrenmek ve 3D rekonstrüksiyon için hangi yazılımın değerlendirilebileceğini belirlemek oldukça zordur.Bu video, fiziksel nesnelerin 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için ayrıntılı ve basit bir yaklaşım sunmaktadır ve deneyiniz için referans olarak kullanılabilir. Prosedürü Dr. Puja ile birlikte gerçekleştireceğim. Her ikimiz de Dr. Laboratuvarı'ndan doktora sonrası araştırmacılarız. Cryo-EM için HIV-1 kapsid proteini düzeneklerini hazırlamak için, önce 200 mesh bakır ızgaraların karbon tarafını 25 mA'da 25 saniye boyunca glow-discharge işlemine tabi ederek başlayın.Çevresel oda içindeki nemi %80'e getirmek için, el yapımı bir manuel yerçekimi pistonu olan bir nebulizör kullanın. Bu sırada, sıvı etanı bir vitro şişe piston düzeneğinde sıvı azot ile soğutun ve şok dondurma düzeneğini manuel yerçekimi pistonuna monte edin. Ardından, penset kullanarak pensleri ızgara kenarına sabitleyin.Önceden hazırlanmış protein çözeltisinden 2.5 µL'yi gridin karbon tarafına uygulayın. Ardından, gridin karbon tarafı karşıya bakacak şekilde forsepsi pistonun üzerine yerleştirin. Gridin arka tarafına üç µL düşük tuzlu dilüsyon tamponu ekleyin.Izgarayı hemen aynı taraftan bir parça filtre kağıdıyla kurulayın. Izgaranın tüm arka yüzeyini yaklaşık altı saniye boyunca filtre kağıdıyla yakın temas halinde tutun. Filtre kağıdını çıkardıktan sonra, ızgarayı hemen sıvı etana daldırın.Son olarak, forsepsi pistonla temas eden bölgeden çekin ve gridi hızlıca bir grid saklama kutusuna aktarın. Dondurulmuş hidratize gridi, 200 kilovolt'ta çalışan ve gatin 4K by 4K CCD kamera ile donatılmış bir FEI polar G two elektron mikroskobuna yükleyerek kriyoelektron mikroskobisine başlayın.Düşük doz arama modunda, yaklaşık 200 x büyütme ekleyin. Tüm ızgarayı uygun buz içeren alanlar için tarayın. Bu alanların konumlarını bir sahne dosyasına kaydedin.Kaydedilen konumları geri çağırın ve bu alanları daha ayrıntılı inceleyin. Düşük doz arama modunda 3.900 x büyütme ekleyin. Veri toplama için, bir delik üzerinde asılı uzun tüpler içermesiyle karakterize edilen, düzgün ince buz tabakasına sahip alanları seçin.Tüm alanları ikinci aşama dosyasına kaydedin. Pozlama moduna geçin. 59.000 x büyütme ekleyin ve 100 mikrometre objektif açıklığı yerleştirin.Ardından, pozlama başına angstrom kareye yaklaşık 15 elektron düşecek şekilde objektif stigmatizmini ve demet yoğunluğunu ayarlayın. Düşük doz arama moduna geri dönün ve kaydedilmiş bir konuma gidin. Uygun bir tüp belirleyip merkezleyin.CCD kamera kullanılarak odaklama moduna geçilir, odak ayarı yapılır ve normalde 0,5 ile 2,5 mikrometre arasında bir defocus değeri belirlenir. Ardından pozlama moduna geçilir ve angstrom kare başına 15 elektronluk bir doz için 0,3 ile 0,5 saniye arasında bir pozlama süresi ayarlanır. Pozlama yapılmadan önce filmlerin 10 saniye boyunca yerleşmesine izin verilerek görüntüler bir plaka kamera ile toplanır.Görüntülerin toplanmasının ardından, bir sonraki kaydedilmiş konuma geçin ve daha fazla görüntü toplamak için bu işlemi tekrarlayın. Filmleri tam konsantrasyonlu D 19 içinde 12 dakika boyunca banyo edin. Ardından görüntüleri, 6.35 micrometers piksel boyutunda bir Nikon Super cool scan 9, 000 ED tarayıcı kullanarak dijitalleştirin.Helisel bir nesne iki parametre ile indekslenebilir: Helisel bir nesnenin yüzey kafesinin Fourier dönüşümündeki Bessel mertebesi N ve tabaka çizgisi numarası L. Her tabaka çizgisi N ve L ile karakterize edilir ve H ve K indeksleri ile belirtilen yüzey kafesindeki bir dizi çizgiye karşılık gelir.Helikal indekslemeye başlamak için, Iman'ın Helix boxer programını kullanarak üniform çapta, nispeten uzun ve düz bir tüp alanını belirleyin ve görüntüyü MRC formatında kaydedin. Ardından, Iman'ın boxer programını kullanarak tüpün yarıçapını ölçün. MRC paketindeki I-M-G-C-C-F gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak HEL tekrar mesafesini belirleyin.Ardından foyer'i hesaplayın. Tekrar mesafesinin bir katı olan yeni bir kutu uzunluğu ile dönüştürün. Sonra, FFT piksel birimlerinde bir sıfır ve sıfır bir olarak iki temel yüzey örgü vektörünü tanımlayan iki temel katman çizgisi seçin.Fourier dönüşümündeki iki ana katman çizgisi için katman çizgisi numaralarını ve maksimum genlik yarıçaplarını belirleyin. İki ana katman çizgisi için katman çizgisi numaraları ve Bessel dereceleri değerleri verildiğinde, alt birimler arasındaki rotasyon ve tek yıldızlı helisin aksiyel yükselmesi, yazılı prosedürde açıklanan seçilim kuralı kullanılarak elde edilebilir. Bu iki gerçek sayı, tüpün vida simetrisini tanımlar.3D yeniden yapılandırma, Iman programı Boxer kullanılarak partikül segmentasyonu ile başlar. Helis partiküller içeren bir mikrograf açıldıktan sonra, Boxer kontrol panelinde bir partikülü örtüşen segmentlere ayırın. Helis modunu seçin ve kutulama parametrelerini ayarlayın.Kutunun boyutu, partikül çapından daha büyük olmalı ve OLA değeri, kutu boyutunun yaklaşık %90'ı kadar olmalıdır. Sol tarafa tıkladıktan sonra, partikül kutusunun herhangi bir ucuna tıklamak, heliks uzunluğu boyunca otomatik olarak bir dizi partikül kutusu oluşturacak ve kutulanmış segmentleri koordinatlarıyla birlikte kaydedecektir. Bir sonraki adım, I-H-R-S-R ile işlem yapmadan önce, iteratif helikal gerçek uzay yeniden yapılandırma yöntemi I-H-R-S-R'yi kullanarak başlangıç 3D yeniden yapılandırmasını gerçekleştirmektir.Kriyo-EM görüntülerinin kontrastını tersine çevirin ve LOWPASS filtresi uygulayın. Ardından, generator yazarak I-H-R-S-R programının grafik arayüzünü açın. Grafik arayüzüne, yığın adı ve yolu, yığındaki görüntü sayısı ve simetri parametreleri değerleri dahil olmak üzere, kutulanmış partikül yığınına ait tüm bilgileri sağlayın.Yeniden yapılandırma betiğini oluşturmak için bitir düğmesine tıklayın. B 25 SP.I başlangıç referansı olarak dolu veya içi boş bir silindir kullanın ve tanımlanan vida simetrisinde herhangi bir değişiklik kalmayana kadarle, genellikle birkaç döngüden sonra gerçekleşir, prosedürün döngüye girmesine izin verin. Sağ el helis simetrisi, kararlı bir şekilde yakınsamış bir yeniden yapılandırma sağlamalıdır.Son döngüde oluşturulan yeniden yapılandırma, daha ileri rafine etme işlemi için başlangıç referansı olarak kullanılacaktır. Son olarak, I-H-R-S-R tarafından oluşturulan 3D yoğunluk haritasını, rafine etme sırasındaki ek iyileştirmeler için başlangıç referansı olarak kullanarak iteratif rafine etmeli 3D yeniden yapılandırma gerçekleştirin. Helikal simetri, I-H-R-S-R prosedüründen belirlenen alt birimler arasındaki rotasyon ve aksiyel yükselme değerlerinde sabitlenmiştir.Ardından, CTF find three ve CTF tilt programları ile mikrograftaki defokus ve astigmatizmayı belirleyin; ardından spider programları olan FT ve mu kullanarak partikül segmentlerini kontrast transfer fonksiyonu (CTF) ile çarpın. Çok referanslı hizalama kullanarak, referans hacimlerin projeksiyonlarını CTF ile düzeltilmiş görüntülerle karşılaştırarak projeksiyon eşleştirmesi gerçekleştirin. Düzlem dışı eğim açısındaki varyasyon artı veya eksi 10 derece ile sınırlandırılmış ve bir derecelik adımlarla örneklenmiştir; sıfır veya 180 dereceye yakın düzlem içi açılarda yüksek korelasyon katsayıları ve sınırlı X kaymaları gibi kısıtlamalar tanımlayın.Her segmentin hizalama parametreleri için, rekonstrüksiyona yalnızca kısıtlamaları karşılayan segmentleri dahil edin. Her iteratif iyileştirme döngüsünden sonra, geri projeksiyon kullanılarak ve CTF karesine bölünerek bir 3D rekonstrüksiyon oluşturulur ve simetrili bir hacim üretmek için helikal simetri uygulanır. İteratif iyileştirme, yeni 3D rekonstrüksiyonun çözünürlüğünde daha fazla iyileşme görülmediğinde sonlandırılır.Tek bir HIV-1 kapsid montajı, bir 92 e tüpü, kutucuklara ayrıldı ve helis indekslemesi için Fourier dönüşümü hesaplandı; iki yarıçap, katman çizgisi numaraları ve 10 ve 01 katman çizgileri için maksimum genlik yarıçapları belirlendi. Ardından, 5195,48 angstrom tekrarlama mesafesi ile sırasıyla 10 ve 01 için -12 ve 11 negatif uç değerleri hesaplandı. Tüpün vida simetrisi delta Z = 6,81 angstrom ve delta 5 = 328,88 derece olarak belirlendi; I-H-R-S-R kullanılarak delta Z ve delta 5 değerleri sırasıyla 7,13 angstrom ve 328,86 dereceye rafine edildi ve 10 iteratif döngü sonrası başlangıç rekonstrüksiyonu oluşturuldu.İteratif iyileştirme sonrası nihai rekonstrüksiyon, I-H-R-S-R ile hesaplanan ilk modele kıyasla yoğunluk haritasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Kapsid montaj tüplerinin yoğunluk haritası; tüp eksenine paralel ve yüzeye yakın, tüp eksenine dik ve tüp eksenine paralel ve eksen boyunca üç ortogonal kesit olarak görüntülenmiştir. Görüntülenen yapı, %100 hacmi kapsayan 1.8 Sigma değerinde konturlanmış 3D yoğunluk haritasının yüzey oluşturma (surface rendering) işleminin sonucudur.Bu videoyu izledikten sonra, kriyojenik elektron mikroskopi kullanarak monte edilmiş bir molekülün 3D yapısının nasıl elde edileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Taç bölgesi yüzeyinde HIV-1 zarf glikoprotein (gp120) farklı V3 döngü dizilerinin yapısal pozisyonları siliko katlama birçok durumda karakterize edilebilir bir state-of-the-art kullanarak döngü 10 ila...

HIV-1 V3 döngü Taç R2 Sıra immünolojik İlgili Dinamik Tersiyer Yapısal Özellikler Değerlendirilmesi Ab initio Katlanır

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Jsubtomo hesaplama paketi ile elektron kriyo-tomografisi ve alt tomogram ortalamasının bir kombinasyonu kullanılarak viral membran glikoprotein komplekslerinin yapılarını belirlemek için bir yaklaşım sunulmuştur.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Bu makale, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak görüntülenen influenza virüslerinin veri işlemesi ve ardından hemaglutinin glikoproteininin subtomogram ortalaması için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, görüntü ön işlemeden son model iyileştirmeye kadar adım adım veri işlemeyi kapsar.

İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Öğrenin, kriyojenik elektron mikroskobu kullanarak HIV-1 kapsid montajlarının üç boyutlu yapısını nasıl elde edeceğinizi. Bu yöntem, yapısal biyoloji araştırmalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Daha fazla video keşfet