Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Bu prosedürün genel amacı, kriyo-elektron mikroskobu kullanarak heli montajlı moleküllerin üç boyutlu bir yapısını elde etmek için bir yöntem sağlamaktır. Protokol, donmuş hidratlı EM ızgarasını hazırlarken tuz konsantrasyonunu geçici olarak azaltmak için hızlı bir seyreltme ve arka taraf lekeleme yöntemi kullanılarak kriyo EM numune hazırlama ile başlar. Bu işlem, veri toplamayı takip eden kriyo EM düşük doz veri toplama sırasında arka plan gürültüsünü azaltırken ve sinyal-gürültü oranını iyileştirirken protein stabilitesini sağlar.

Kırınım desenlerinin sarmal indekslemesi tamamlandı. Daha sonra görüntü işleme gerçekleştirilir, ardından gerçek alan 3D rekonstrüksiyonu yapılır, bu da HIV bir kapsid veya ca tüpünün nihai yoğunluk haritası ile sonuçlanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi mücadele edecektir çünkü optimum veri toplama ve analizi için birkaç kritik nokta vardır.

Örneğin, HIV durumunda, yapıyı etkilemeden tuz konsantrasyonunu hızla azaltan yalnızca bir molar kaynak çözeltisinde oluşan bir kapsid boru şeklindeki düzenekler. Yüksek kaliteli kriyo EM görüntüleri elde etmek çok önemlidir. Bir tüp görüntüsü verildiğinde, kritik bir tüpü indekslemek için ne yapılacağını ve hangi yazılımın 3D rekonstrüksiyon yapmak için düşünülebileceğini öğrenmek çok zordur.

Bu video, fiziksel nesnelerin 3B rekonstrüksiyonunu elde etmek için ayrıntılı ve basit bir yaklaşım sağlar ve deneyiniz için bir referans olarak kullanılabilir. Dr.Puja ile prosedürü göstereceğim. İkimiz de Dr.Laboratory'den doktora sonrası HIV'i hazırlamak için kriyo em için bir kapsid protein düzeneği, 200 gözenekli bakır ızgaranın karbon tarafını 25 saniye boyunca 25 miliamperin altında boşaltarak parlayarak başlar.

Ev yapımı bir manuel yerçekimi pistonu olan çevre odasında nemi %80'e getirmek için bir nebulizatör kullanın. Bu arada, sıvı nitrojen içeren bir vitro şişe piston dozunda sıvı etanı soğutun, daldırmalı dondurma çözücüsünü manuel yerçekimi pistonuna monte edin. Ardından, ızgara kenarına kapalı kıskaçları sıkıştırmak için forseps kullanın.

Izgaranın karbon tarafına 2,5 mikrolitre önceden monte edilmiş bir protein çözeltisi uygulayın. Ardından forsepsleri, ızgaranın karbon tarafı uzağa bakacak şekilde pistona yükleyin. Izgaranın arka tarafına üç mikrolitre düşük tuz seyreltme tamponu ekleyin.

Izgarayı hemen aynı tarafta bir parça filtre kağıdı ile kurulayın. Izgaranın tüm arka yüzeyini yaklaşık altı saniye boyunca filtre kağıdı ile yakın temas halinde tutun. Filtre kağıdını çıkardıktan sonra, ızgarayı hemen sıvı etan içine daldırın.

Son olarak, forsepsleri pistondan çıkarın ve ızgarayı hızlı bir şekilde bir ızgara saklama kutusuna aktarın. Donmuş hidratlı ızgarayı bir FEI polar G iki elektron mikroskobuna yükleyerek kriyo-elektron mikroskobuna başlayın. 200 kilovoltta çalışıyor ve bir gatin 4K by 4K CCD kamera ile donatılmış.

Düşük doz arama modunda, yaklaşık 200 x'lik bir büyütme ekleyin. Uygun buzlu alanlar için tüm ızgarayı tarayın. Bu alanların konumlarını bir sahne alanı dosyasına kaydedin.

Kaydedilen pozisyonları geri çağırın ve bu alanları daha fazla tarayın. Düşük doz arama modunda 3.900 x büyütme ekleyin. Veri toplama için, bir delik üzerinde asılı uzun tüpler içermesi ile karakterize edilen tek tip ince tabaka buzlu alanları seçin.

Tüm alanları ikinci aşama dosyasına kaydedin. Pozlama moduna geçin. 59.000 x büyütme ekleyin ve 100 mikrometre objektif açıklığı ekleyin.

Ardından, maruziyet başına angstrom kare başına yaklaşık 15 elektronluk bir doz için objektif damgalamayı ve ışın yoğunluğunu ayarlayın. Düşük doz arama moduna dönün ve kaydedilmiş bir konuma geçin. İyi bir tüpü tanımlayın ve ortalayın.

CCD kamerayı kullanarak odak moduna geçin, odağı ayarlayın ve normalde 0,5 ile 2,5 mikrometre arasında bir odak bozma değeri ayarlayın. Ardından pozlama moduna geçin ve angstrom kare başına 0.3 elektronluk bir doz için 0.5 ila 15 saniyelik bir maruz kalma süresi ayarlayın. Görüntüleri bir plaka kamerada toplayın ve pozlama yapılmadan önce filmlerin 10 saniye boyunca oturmasına izin verin.

Görüntüleri topladıktan sonra, kaydedilen bir sonraki konuma geçin ve daha fazla görüntü toplamak için bu işlemi tekrarlayın. Filmleri 12 dakika boyunca tam güçte D 19'da geliştirin. Ardından, 6,35 mikrometre piksel boyutunda bir Nikon Super cool scan 9.000 ED tarayıcı kullanarak görüntüleri dijitalleştirin.

Sarmal bir nesne iki parametre ile indekslenebilir. Bessel mertebesi N ve katman çizgi numarası L, sarmal bir nesnenin yüzey kafesinin forer dönüşümünde. Her katman çizgisi N ve L ile karakterize edilir ve H ve K indeksleri ile gösterildiği gibi yüzey kafesi üzerindeki bir dizi çizgiye karşılık gelir.

Sarmal indekslemeye başlamak için, düzgün çapa sahip nispeten uzun ve düz bir tüpü kutulamak ve görüntüyü MRC formatında kaydetmek için Iman'ın Helix boxer programını kullanın. Ardından Iman'ın program boksörünü kullanarak tüpün yarıçapını ölçün. MRC paketinde I-M-G-C-C-F gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak HEL tekrarlama mesafesini belirleyin.

Sonra fuayeyi hesaplayın. Tekrarlama mesafesinin integrali olan yeni bir kutu uzunluğuyla dönüştürün. Ardından, FFT piksel birimlerinde biri sıfır diğeri sıfır olmak üzere iki temel yüzey kafes vektörünü tanımlayan iki temel katman çizgisi seçin.

Fourier dönüşümündeki iki temel katman çizgisi için katman çizgi numaralarını ve maksimum genlik yarıçaplarını belirleyin. Katman çizgi numaraları ve iki temel katman çizgisi için Bessel siparişlerinin değerleri göz önüne alındığında, alt birimler arasındaki dönüş ve bir yıldız sarmalının eksenel yükselişi, yazılı prosedürde açıklandığı gibi seçim kuralı kullanılarak elde edilebilir. Bu iki gerçek sayı, tüpün vida simetrisini tanımlar.

3D rekonstrüksiyon, Iman programı kullanılarak parçacık segmentasyonu ile başlar. Boksör. Sarmal parçacıklar içeren bir mikrografı açtıktan sonra, boxer'ın kontrol panelinde bir parçacığı üst üste binen segmentlere kesin. Sarmal modunu seçin ve boks için parametreleri ayarlayın.

Kutunun boyutu, partikülün çapından daha büyük olmalı ve OLA değeri, kutu boyutunun yaklaşık% 90'ı olmalıdır. Soldan sonra, parçacık boxer'ın herhangi bir ucuna tıklamak, sarmal uzunluğu boyunca otomatik olarak bir dizi parçacık kutusu oluşturacak, kutulu segmentleri ve koordinatlarını kaydedecektir. Bir sonraki adım, I-H-R-S-R ile işlemeden önce yinelemeli sarmal gerçek alan yeniden yapılandırma yöntemi I-H-R-S-R kullanarak ilk 3B rekonstrüksiyonu gerçekleştirmektir.

Cryo-EM görüntülerinin kontrastını tersine çevirin ve LOWPASS filtreleme uygulayın. Ardından jeneratör yazarak I-H-R-S-R programının grafik arayüzünü açın. Yığının adı ve yolu, yığındaki görüntü sayısı ve simetri parametrelerinin değerleri dahil olmak üzere kutulu parçacık yığını için tüm bilgileri içeren grafik arabirimini sağlayın.

Yeniden yapılandırma komut dosyasını oluşturmak için bitir düğmesine tıklayın. B 25 SP. İlk referans olarak katı veya içi boş bir silindir kullanıyorum ve genellikle birkaç döngüden sonra meydana gelen tanımlanmış vida simetrisinde herhangi bir değişiklik olmayana kadar prosedürün dönmesine izin veriyorum. Sağ sarmal simetri, kararlı bir şekilde yakınsak bir rekonstrüksiyon sağlamalıdır.

Son döngüde oluşturulan rekonstrüksiyon, daha fazla iyileştirme için ilk referans olarak kullanılacaktır. Son olarak, iyileştirme sırasında ek iyileştirme için ilk referans olarak I-H-R-S-R tarafından oluşturulan 3B yoğunluk haritasını kullanarak yinelemeli iyileştirme ile 3B yeniden yapılandırma gerçekleştirin. Sarmal simetri, I-H-R-S-R prosedüründen belirlenen alt birimler arasındaki dönüşte ve eksenel yükselmede sabitlenir.

Daha sonra, FT olarak adlandırılan örümcek programlarını kullanarak CTF find three ve CTF tilt programlarını kullanarak mikrografta bulunan odak bozukluğunu ve astigmatizmayı belirleyin ve kontrast transfer fonksiyonu ile parçacık segmentlerini mu çarpın. Kısaltılmış CTF, çoklu referans hizalaması kullanarak referans hacimlerinin projeksiyonlarını CTF düzeltilmiş görüntülerle karşılaştırarak projeksiyon eşleştirmesi gerçekleştirir. Düz eğim açısının dışındaki varyasyon artı veya eksi 10 derece ile sınırlıdır ve bir derecelik adımlarla örneklendiğinde, sıfır dereceye veya 180 dereceye yakın düz açılarda yüksek korelasyon katsayıları ve sınırlı X kaymaları gibi kısıtlamalar getirir.

Her segmentin hizalama parametreleri için, rekonstrüksiyona yalnızca kısıtlamaları karşılayan segmentleri dahil edin. Her yinelemeli iyileştirme döngüsünden sonra, geri projeksiyon kullanılarak bir 3D rekonstrüksiyon oluşturulur ve bir simetri hacmi oluşturmak için sarmal simetriyi empoze eden CTF karesi üzerinde bazılarına bölünür. Yinelemeli iyileştirme, yeni 3D rekonstrüksiyonun çözünürlüğünde daha fazla iyileştirme meydana gelmediğinde sonlandırılır.

Tek bir HIV bir kapsid düzeneği, bir 92 e tüpü kutulandı ve Fourier dönüşümü, iki yarıçapın sarmal indekslenmesi için hesaplandı, katman çizgi numaraları ve bir sıfır ve sıfır bir katman çizgileri için maksimum genlik yarıçapları belirlendi. Negatif 12 ve 11'in uç değerleri daha sonra sırasıyla bir sıfır ve sıfır bir için 5195.48 angstrom tekrar mesafesi ile hesaplandı. Tüpün vida simetrisi, delta Z'nin 6.81 angstrom'a eşit olduğu ve delta beşin 328.88 dereceye, delta Z'ye eşit olduğu ve delta beşin I-H-R-S-R kullanılarak 7.13 angstrom ve 328.86 dereceye eşit olduğu belirlendi ve 10 yinelemeli döngüden sonra bir ilk rekonstrüksiyon oluşturuldu.

Yinelemeli iyileştirmeden sonraki son rekonstrüksiyon, yoğunluk haritasını I-H-R-S-R ile hesaplanan ilk modelden önemli ölçüde iyileştirdi. Kapsid montaj tüplerinin yoğunluk haritası, tüp eksenine paralel ve yüzeye yakın, tüp eksenine dik ve tüp eksenine paralel ve tüp ekseni boyunca üç ortogonal dilim olarak görüntülenir. Görüntülenen yapı, %100 hacmi kapsayan 1,8 Sigma'da şekillendirilmiş 3B yoğunluk haritasının yüzey işlemesinden kaynaklanır.

Bu videoyu izledikten sonra, karga elektron mikroskobu kullanılarak müttefik olarak birleştirilmiş molekülün 3 boyutlu yapısını nasıl elde edeceğinizi çok iyi anlamış olmalısınız.