Beyin Lizatında Hedef Protein Seviyelerinin Ölçülmesi için Elektrokemilüminesans Testi

Elektrokemilüminesans, ECL, immünoassay kullanılarak fare beyin lizatında spesifik bir proteinin kantitatif tespiti için, çok kuyulu bir tahlil plakası ile başlayın.

Kuyular, elektrik devresini tamamlayan iletken çalışma ve karşı elektrotlardan oluşur. Bir dielektrik tabaka elektrotları ayırarak tahlil hassasiyetini artırır.

Kuyucuklara hedef proteine karşı birincil fare monoklonal antikorları ekleyin. Daha fazla bağlanma kapasitesine sahip çalışma elektrotları, antikorların üzerlerinde hareketsiz hale gelmesini kolaylaştırır.

Protein içeren bir çözelti ile inkübe edin, kuyucuğun kalan bağlanma yüzeylerine bağlanın ve arka plan girişimini azaltın.

Fare beyni nükleer fraksiyon lizatı ekleyin. Lizattaki hedef protein, spesifik olarak monoklonal antikorlara bağlanır.

Elektrot üzerindeki primer monoklonal antikorlara bağlı olan protein üzerindeki epitopları tanıyan ve bunlara bağlanan etiketlenmemiş poliklonal antikorlar ekleyin. Etiketlenmemiş antikorlara bağlanan rutenyum kompleksi ile etiketlenmiş spesifik ikincil antikorlar ekleyin. Uygun bir ECL üretim ortamı sağlayan yüzey aktif madde ve tripropilamin, TPA içeren uygun bir tampon ekleyin.

Çok kuyulu plakayı ECL algılama sistemine yerleştirin. Elektrotlar boyunca potansiyelin uygulanması üzerine, antikorlara bağlı rutenyum kompleksi oksitlenir. Aynı zamanda, TPA oksitlenir ve kendiliğinden bir proton kaybeder.

Elde edilen TPA radikali, oksitlenmiş rutenyum kompleksini uyarılmış durumuna indirger. Temel durumuna gevşetildikten sonra, rutenyum kompleksi fotodetektör tarafından algılanan bir foton yayar.

Ölçülen ışık yoğunluğu, lizatın spesifik protein konsantrasyonunu temsil eder.

96 oyuklu plakayı buzdolabından alın ve folyoyu çıkarın. Antikor kaplama solüsyonunu bir atık kabına iterek kuyulardan çıkarın. Ardından, kalan çözeltiyi çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya vurun.

Daha sonra, her kuyucuğa 125 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı tekrar yapışkan folyo ile kapatın. Plakayı 800 RPM'ye ayarlanmış bir orbital mikro plaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.

Buz, bir şişe MeCP2 veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi, fare beyni lizatları ve HDF lizatları üzerinde çözdürün. Protein stok çözeltisini, el yazmasının Tablo 2'sinde açıklandığı gibi temiz tüplerde seyreltin.

Ardından, lizat örneklerini seyreltin. Fare beyni lizatları için, 25 mikrolitre lizis tamponu başına 1 ila 20 mikrogram kullanın. HDF lizat için, 25 mikrolitre lizis tamponu başına 0.25 ila 1 mikrogram ekleyin.

96 oyuklu plaka 90 dakika inkübe edildikten sonra, bloke edici çözeltiyi bir atık kabına iterek kuyucuklardan çıkarın. Ardından, kalan çözeltiyi çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya vurun. Daha sonra plakayı 150 mikrolitre yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkayın, yıkama solüsyonunu ekleyip hemen çıkarın.

96 oyuklu plakanın kuyucuklarına 25 mikrolitre standart ve numune ekleyin. Plakayı kapatın ve sabit 800 RPM çalkalama ile oda sıcaklığında dört saat daha inkübe edin.

Etiketlenmemiş tespit antikoru olan poliklonal tavşan anti-MeCP2'yi buz üzerinde çözün. Tahlil seyreltici çözeltisi kullanarak, antikoru 1:6000 oranında seyreltin. 96 oyuklu plaka, çalkalayıcı üzerinde inkübe etmeyi bitirdiğinde, plakayı bir atık kabına iterek standartları ve numuneleri çıkarın. Ardından, kalan çözeltiyi çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya vurun.

Plakayı 150 mikrolitre yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkayın, yıkama solüsyonunu ekleyin ve hemen çıkarın. Çok kanallı pipetleyici ile her bir oyuğa 25 mikrolitre etiketsiz tespit antikoru çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın ve 800 RPM'de sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.

Buzdolabından spesifik ikincil antikoru alın ve buzun üzerine yerleştirin. İkincil antikoru tahlil seyreltici solüsyon içinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.

Serbest etiketlenmemiş tespit antikorunu 96 oyuklu plakadan çıkarmak için, atık kabına hafifçe vurun ve ardından plakayı bir kağıt havluya hafifçe vurun. Plakayı daha önce tarif edildiği gibi 3 kez yıkadıktan sonra, çok kanallı pipetleyici ile her bir oyuğa 25 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Plakayı kapatın ve 800 RPM'de sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.

Serbest ikincil antikoru atık kabına iterek ve plakayı bir kağıt havluya vurarak çıkarın ve ardından plakayı daha önce tarif edildiği gibi üç kez yıkayın.

Plakanın her bir oyuğuna, ışık üretimi için bir koreaktan olarak tripropilamin içeren yüzey aktif madde içeren 150 mikrolitre 1X tris bazlı Altın okuma tamponu ekleyin.

Hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için ters pipetleme tekniklerini kullanın. 96 oyuklu plakayı bir elektrokemilüminesans algılama sistemi ile mikroplaka platformuna yerleştirin.

Dahili CCD kamerayı kullanarak hemen veri yakalamaya başlayın. Göreceli ışık birimlerine karşılık gelen ve ışığın yoğunluğu ile doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin.