Farklı Dolaşım B Hücre Popülasyonları için Akış Sitometrisi Tabanlı Hücre Sınıflandırması

Hücre yüzeyi reseptörlerine dayanarak, insan dolaşımındaki B hücreleri, CD19 pozitif naif B hücreleri, CD19 ve CD27 pozitif bellek B hücreleri ve CD19, CD27 ve CD38 pozitif plazma hücreleri olarak sınıflandırılır.

Bu hücre popülasyonlarını sıralamak için saflaştırılmış bir B hücresi süspansiyonu alın. İnsan immünoglobulin G antikorları ile inkübe edin. Antikorlar, B hücrelerinin Fc reseptörlerini bloke ederek spesifik olmayan antikor bağlanmasını önler.

CD19, CD27 ve CD38'i hedefleyen floresan işaretli antikorlar ekleyin.

Anti-CD19 antikorları, B hücrelerinde her yerde eksprese edilen CD19 reseptörlerine bağlanır.

Anti-CD27 antikorları, bellek B hücreleri ve plazmablast plazma hücreleri üzerinde eksprese edilen CD27 reseptörlerine bağlanır.

Anti-CD38 antikorları, plazmablast plazma hücrelerinde eksprese edilen CD38 reseptörlerine bağlanır.

Ölü hücre işaretleyicisi olarak floresan DNA bağlayıcı bir boya ekleyin.

Ölü hücreler, boyanın hücresel girişine ve çift sarmallı DNA'ya bağlanmasına izin veren bir zar bütünlüğü kaybı sergiler; canlı hücreler boyanmadan kalır.

Bağlanmamış antikorları ve boyaları çıkarmak için santrifüjleyin ve hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Homojen bir süspansiyon elde etmek ve topakları ortadan kaldırmak için hücreleri bir süzgeçten süzün.

Bir akış sitometresi kullanarak, ölü hücreleri canlı olanlardan ayırın. Canlı hücreler içinde, CD19, CD27 ve CD38 ekspresyonu, saf B hücrelerini, hafıza B hücrelerini ve plazmablast plazma hücrelerini ayırt eder.

Spesifik olmayan bloklama yaptıktan sonra, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için hafifçe karıştırarak tüpe 1 x 10⁶ hücre başına her seçim antikorundan 1 mikrogram ekleyin. İnkübasyonun son beş dakikasında, hücrelere 5 mikrolitre 7-AAD ekleyin. Ardından, hücrelere 2 mililitre taze PBS ekleyin ve santrifüjlemeden önce girdap yapın.

Peletleri mililitre konsantrasyonunda 1 ila 5 x 10⁷ hücrede taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 5 mililitrelik polistiren tüpe süzün. Daha sonra, hücreleri akış sitometrisine göre, saf B hücrelerini, bellek B hücrelerini ve plazmablast plazma hücrelerini toplamak için 5 mililitre taze RPMI ortamı içeren üç adet 15 mililitrelik tüpe sıralayın.