Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Bu spektral sitometri tekniğinin genel amacı, tüm emisyon spektrumlarını kullanarak farklı florokromları ayırt etmektir. Dahası, bu protokol, otofloresansın bağımsız bir parametre olarak uygulanmasını sağlar ve katı organlardan izole edilen hücrelerin uygun bir analizine izin verir. Bu yöntem, nadir hücre popülasyonlarının nasıl tanımlanacağı gibi immünoloji ve kök hücre biyolojisinin geliştirilmesi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, aynı anda çok sayıda parametreyi analiz etmek ve katı dokuların otofloresansını yönetmek için benzersiz kapasitesidir. Bu yöntem bağırsak ve kalpten elde edilen tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için kullanılsa da, akciğer, iskelet, kas, karaciğer, yağ ve böbrek gibi diğer organlara da uygulanabilir. Başlamak için, ince bağırsağı yetişkin bir fareden izole edin ve yıkayın.

Ardından, mendili bir kağıt havlu üzerine koyun ve keskin bir makas kullanarak Peyer'in yamalarını dikkatlice çıkarın. Bağırsağı uzunlamasına keserek açın ve bir santimetrelik parçalara bölün. Daha sonra, dokuyu yüzde on FCS ile desteklenmiş 30 mililitre HBSS ile doldurulmuş bir behere aktarın ve 30 dakika boyunca sürekli karıştırarak 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca kuvvetlice girdap haline getirin. Ardından, büyük, ayrışmamış parçaların tortulaşmasına izin vermek için süspansiyonu on dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri yedi dakika boyunca 120 kez G'de döndürün.

Peletlendikten sonra, hücreleri HBSS'de yüzde bir FCS'nin on mililitresinde süspanse ediyoruz ve bunları bir Neubauer odası kullanarak sayıyoruz. Hücre boyamadan önce, negatif bir kontrol hazırlamak için altıncı bağırsak hücrelerine bir kez on kez beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir numune hazırlamak için, bağırsak hücrelerinin altıda birine bir kez on ekleyin, ardından yeni bir beş mililitrelik tüpe yüzde bir FCS ile iki mililitre HBSS ekleyin ve süspansiyonu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 120 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 50 mikrolitre antikor çözeltisinde askıya alırız. Tüpü alüminyum folyoya sarın ve hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, numuneye HBSS'de iki mililitre yüzde bir FCS ekleyin ve beş dakika boyunca 120 kez G, dört santigrat derece sıcaklıkta santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve peleti mililitre propidyum iyodür çözeltisi başına 200 mikrolitre 0.5 mikrogram içinde yeniden süspanse edin. Bir fare embriyosunun başını kestikten sonra, vücudunu bir petri kabına batırın, önceden ıslatılmış bir kağıt havluyla kaplayın ve HBSS'de 50 mililitre yüzde bir FCS ile doldurun. Stereomikroskop altında, embriyonun göğsünün sağ tarafında bir kesi yapın ve kalbe zarar vermekten kaçınarak göğüs kafesi dikkatlice açın.

Büyük damarları yakalayın ve akciğerlere ve timusa bağlı kalbi çıkarın. Organları, HBSS'de iki mililitre yüzde bir FCS ile doldurulmuş 35 mililitrelik bir petri kabına aktarın. Ardından, kalbi çevredeki organlardan ve bağ dokusundan izole edin.

Kalbi yıkadıktan sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış enzimatik çözeltiye batırın ve ince forseps ve bir neşter kullanarak, organı stereomikroskop altında bir milimetreküp parçaya bölün. Bir mililitre önceden ısıtılmış enzimatik çözelti ekleyin ve parçalanmış dokuyu beş mililitrelik kapaklı bir tüpe aktarın. Numuneyi 37 santigrat derecede yatay konumda 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, süspansiyonu bir P1000 pipeti ile tekrar tekrar pipetleyerek dokuyu homojenize edin. Ardından, dikey olarak yerleştirilmiş numuneleri, sindirilmemiş dokuların parçaları çökene kadar bir kenara koyun. Süpernatanı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

HBSS'ye iki mililitre yüzde on FCS ekleyin ve izole edilen hücreleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, sindirilmemiş doku tortusunu içeren beş mililitrelik tüpe iki mililitre önceden ısıtılmış enzimatik çözelti ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi doku kalıntısı gözlenene kadar dokuyu sindirmeye devam edin. Elde edilen hücre süspansiyonunu on dakika boyunca 120 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı atın ve hücreleri, kalsiyum ve magnezyum katyonları içermeyen HBSS'de yüzde bir FCS'nin bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Kardiyak hücreleri boyamak için, hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Plakayı bir dakika boyunca 480 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra, kalp hücrelerini 100 mikrolitre antikor çözeltisinde yeniden süspanse edin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kardiyak hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'de 200 mikrolitre yüzde bir FCS ile yıkayın ve süspansiyonu bir dakika boyunca 480 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonu içermeyen HBSS'de yüzde bir FCS'nin 200 mikrolitresinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'de 200 mikrolitre yüzde bir FCS ile önceden doldurulmuş beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Son olarak, mililitre propidyum iyodür başına 0.5 mikrogram içeren kalsiyum ve magnezyum katyonları içermeyen HBSS'ye 400 mikrolitre yüzde bir FCS ekleyin ve hücre süspansiyonunu 70 mikro naylon ağdan süzün. Hücreleri görselleştirmek için lekeli numuneyi bir akış sitometrisine yükleyin ve önizlemeye tıklayın, ardından al'a tıklayarak numunedeki iki kere on ila altıncı olayı kaydedin.

Analiz sekmesinde, renk paleti penceresini açın ve florokromlu ile birlikte ilgili işaretleyiciyi ekleyerek incelenen tüm parametreleri kaydedin. Otofloresan ve canlılık parametrelerini eklediğinizden emin olun. Kontrol penceresinde, tüp listesi içinde, kompanzasyon boncukları içeren ilk tek lekeli numuneyi analiz edin.

Ardından, çalışma sayfasında çokgen tasarım aracına tıklayın ve FSC SSC grafiğindeki boncuk popülasyonunu geçit edin. Kapılı boncukların bir kız çizimini oluşturmak için kapıya çift tıklayın. Ve sonra pozitif ve negatif boncukları ayrı ayrı kapılayın.

Seçilen yavru popülasyonu, her pozitif ve negatif fraksiyonda ardışık geçit ve aykırı değerlerin ortadan kaldırılmasıyla doğrulayın. Ardından, negatif ve pozitif kapıları karıştırmayı kaldırma penceresine yükleyin. Ardından, tüp listesinden lekelenmemiş hücre örneğini seçin ve otofloresan ve otofloresan olmayan hücreler için ayrı kapılar tasarlayın.

Otofloresan ve canlılık dahil olmak üzere tüm parametreler için negatif ve pozitif kapılar tanımlandıktan sonra hesapla'ya tıklayın. Ardından, analiz edilen numunelere karıştırma işlemini uygulayın. Verileri analiz etmek için, hücreleri FSC'ye karşı SSC'nin bir grafiğinde geçit ve propidyum iyodür lekeli ölü hücreleri hariç tutun.

Son olarak, ilgili tüm popülasyonlar için kapıları belirleyin. Fetal kalpten izole edilen ve anti-TER119, anti-CD45 ve anti-Sca-1 antikorları ile boyanan hücrelerin akım sitometrisi ve spektral sitometri analizlerinin sonuçları sunulmuştur. Otofloresan hücrelerin bir alt kümesi iki konvansiyonel sitometre ile tespit edilirken, spektral sitometride bu hücreler otofloresan olarak tanımlanmadı ve CD45 TER119 negatif popülasyonunda yer aldı.

Konvansiyonel akış sitometrisi ile otofloresan olarak tanımlanan, ancak CD31 pozitif hücreler olmayan hücreler daha sonra kardiyomiyositlere özgü transkriptlerin ekspresyonu için analiz edildi. Otofloresan hücre popülasyonunda yüksek seviyelerde kardiyak troponin ve tren transkriptleri gibi atriyal miyositler bulundu ve bu da geleneksel akış sitometrisinde büyük bir kardiyo miyosit alt kümesinin gözden kaçırıldığını doğruladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde oluşturulmuşsa, yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hücrelerin canlı kalmasını sağlamak için tüm adımların buz üzerinde ve zamanında bir malikanede gerçekleştirilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, spesifik moleküler yolaklarla ilgili soruları yanıtlamak için hücre içi proteinler ve ek yüzey belirteçlerinin analizleri hazırlanabilir. Bu teknik, immünoloji ve gelişimsel veya kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların farklı organlardan nadir popülasyonları keşfetmesinin ve izole etmesinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin hücresel dokulardan nasıl izole edileceğini ve boyanacağını ve hücre otofloresansından kaynaklanan sınırlamaların üstesinden gelen spektral akış sitometrisi ile yüzey işaretleyici ekspresyonunun nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Probidyum iyodür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman KKD kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.