Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Bu spektral sitometri tekniğinin genel amacı, farklı florokromları tüm emisyon spektrumlarını kullanarak ayırt etmektir. Dahası, bu protokol otofloresansın bağımsız bir parametre olarak uygulanmasına olanak tanıyarak, katı organlardan izole edilen hücrelerin uygun bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Bu yöntem, nadir hücre popülasyonlarının nasıl tanımlanacağı gibi immünoloji ve kök hücre biyolojisinin gelişimi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda parametreyi eş zamanlı olarak analiz edebilme ve katı dokuların otofloresansını yönetebilme yönündeki benzersiz kapasitesidir. Bu yöntem, bağırsak ve kalpten türetilen tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması için kullanılsa da akciğer, iskelet kası, karaciğer, yağ ve böbrek gibi diğer organlara da uygulanabilir. Başlamak için, yetişkin bir fareden ince bağırsağı izole edin ve yıkayın.

Ardından, dokuyu bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve keskin bir makas kullanarak Peyer plaklarını dikkatlice çıkarın. Bağırsağı boylamasına keserek açın ve bir santimetrelik parçalara bölün. Daha sonra dokuyu, yüzde on FCS ile desteklenmiş 30 mililitre HBSS ile doldurulmuş bir behere aktarın ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta, sürekli karıştırarak 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandığında, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, büyük ve ayrışmamış fragmanların çökmesini sağlamak için süspansiyonu on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Sonrasında, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri 120 ×g'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin.

Pelletleme işleminden sonra, hücreleri HBSS içinde yüzde bir FCS içeren on mililitre çözeltide süspanse ederiz ve bir Neubauer kamarası kullanarak sayarız. Hücre boyama işleminden önce, negatif kontrol hazırlamak için 1x10⁶ bağırsak hücresini beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir örnek hazırlamak için, 1x10⁶ bağırsak hücresini, ardından iki mililitre yüzde bir FCS'li HBSS'yi yeni bir beş mililitrelik tüpe ekleyin ve süspansiyonu 4 °C'de, 120 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, hücreleri 50 µL antikor çözeltisi içerisinde süspanse ederiz. Tüpü alüminyum folyo ile sarın ve hücreleri 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, örneğe HBSS içerisinde %1 FCS içeren 2 mL ekleyin ve örneği 4 °C'de, 120 ×g'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve pelletini 200 µL 0.5 µg/mL propidyum iyodür çözeltisinde yeniden süspande edin. Bir fare embriyosunun başı kesildikten sonra, vücudunu önceden ıslatılmış kağıt havlu serilmiş ve 50 mL %1 FCS içeren HBSS ile doldurulmuş bir petri kabında bekletin. Bir stereomikroskop altında, embriyonun göğsünün sağ tarafında bir kesi yapın ve kalbe zarar vermemeye dikkat ederek toraksı dikkatlice açın.

Büyük damarları kavrayın ve akciğerlere ve timusa bağlı olan kalbi dışarı çıkarın. Organları, 2 ml %1 FCS içeren HBSS ile doldurulmuş 35 mililitrelik bir petri kabına aktarın. Ardından, kalbi çevreleyen organlardan ve bağ dokusundan ayırın.

Kalbi yıkadıktan sonra, önceden ısıtılmış bir mililitre enzimatik çözelti içinde bekletin ve ince pens ile neşter kullanarak organı bir stereomikroskop altında bir kübik milimetrelik parçalara ayırın. Bir mililitre daha önceden ısıtılmış enzimatik çözelti ekleyin ve parçalanmış dokuyu kapaklı beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Numuneyi yatay konumda 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, süspansiyonu bir P1000 pipet ile tekrarlayan pipetleme işlemi yaparak dokuyu homojen hale getirin. Ardından, sindirilmemiş doku parçaları çökelene kadar dikey konumlandırılmış örnekleri kenara alın. Süpernatantı 50 milliliters tüpe aktarın.

HBSS içinde yüzde on FCS'den iki mililitre ekleyin ve izole edilen hücreleri buz üzerinde tutun. Ardından, sindirilmemiş doku tortusunu içeren beş mililitrelik tüpe önceden ısıtılmış enzimatik çözeltiden iki mililitre ekleyin ve kalan doku gözlemlenmeyene kadar dokuyu daha önce gösterildiği gibi sindirmeye devam edin. Elde edilen hücre süspansiyonunu 120 ×g'de on dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum katyonları içermeyen HBSS içindeki %1 FCS'nin 1 mL'si ile yeniden süspanse edin. Kardiyak hücreleri boyamak için, hücre süspansiyonunun 200 µL'sini yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Plakayı 480 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Ardından, kalp hücrelerini 100 µL antikor solüsyonu içinde yeniden süspande edin. Plakayı alüminyum folyo ile sarın ve 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, kalp hücrelerini kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içinde %1 FCS içeren 200 µL solüsyon ile yıkayın ve süspansiyonu 480 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonu içermeyen HBSS içinde %1 FCS'nin 200 µL'sinde yeniden süspande edin ve süspansiyonu, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içinde %1 FCS'nin 200 µL'si ile önceden doldurulmuş beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Son olarak, kalsiyum ve magnezyum katyonları içermeyen HBSS içinde %1 FCS'nin, 0,5 µg/mL propidyum iyodür içeren 400 µL'sini ekleyin ve hücre süspansiyonunu 70 µm naylon mesh üzerinden süzün. Hücreleri görüntülemek için boyanmış örneği bir akış sitometrisine yükleyin ve önizleme (preview) seçeneğine tıklayın, ardından edin (acquire) seçeneğine tıklayarak örnekteki 2 × 10⁶ olaya kadar kayıt yapın.

Analiz sekmesinde, renk paleti penceresini açın ve ilgili markörüyle birlikte florokromu ekleyerek çalışılan tüm parametreleri kaydedin. Otofloresans ve canlılık parametrelerini eklediğinizden emin olun. Kontrol penceresindeki tüp listesi içinde, kompanzasyon boncukları içeren ilk tek renkli boyanmış örneği analiz edin.

Ardından, çalışma sayfasında çokgen tasarım aracına tıklayın ve FSC SSC grafiğindeki boncuk popülasyonunu kapılayın. Kapılan boncukların bir alt grafiğini oluşturmak için kapıya çift tıklayın. Daha sonra pozitif ve negatif boncukları ayrı ayrı kapılayın.

Seçilen yavru popülasyonu, her bir pozitif ve negatif fraksiyondaki aykırı değerlerin ardışık kapılama (gating) ve elenmesi yoluyla doğrulayın. Ardından, negatif ve pozitif kapıları un-mixing penceresine yükleyin. Sonrasında, tüp listesinden boyanmamış hücre örneğini seçin ve otofloresan ile otofloresan olmayan hücreler için ayrı kapılar tasarlayın.

Otofloresans ve canlılık dahil tüm parametreler için negatif ve pozitif geçitler tanımlandıktan sonra hesapla (calculate) düğmesine tıklayın. Ardından, analiz edilen örneklere ayrıştırma (un-mixing) işlemini uygulayın. Verileri analiz etmek için, hücreleri SSC'ye karşı FSC grafiğinde geçitleyin ve propidyum iyodür ile boyanmış ölü hücreleri hariç tutun.

Son olarak, ilgilenilen tüm popülasyonlar için kapılamaları (gate) belirleyin. Burada, fetal kalpten izole edilen ve anti-TER119, anti-CD45 ve anti-Sca-1 antikorları ile boyanan hücrelerin akım sitometrisi ve spektral sitometri analizlerinin sonuçları sunulmuştur. İki geleneksel sitometre ile otofloresan hücrelerin bir alt kümesi tespit edilirken, spektral sitometride bu hücreler otofloresan olarak tanımlanmamış ve CD45 TER119 negatif popülasyon içerisinde yer almışlardır.

Konvansiyonel akış sitometrisi ile otoflüoresan olarak tanımlanan ancak CD31 pozitif olmayan hücreler, ardından kardiyomiyositlere özgü transkriptlerin ekspresyonu açısından analiz edildi. Otoflüoresan hücre popülasyonunda yüksek seviyelerde kardiyak troponin ve atriyal miyosit benzeri train transkriptleri saptandı; bu durum, kardiyomiyositlerin büyük bir alt kümesinin konvansiyonel akış sitometrisinde gözden kaçtığını doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin canlılığını korumak için tüm adımların buz üzerinde ve zamanında gerçekleştirilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, belirli moleküler yolaklarla ilgili soruları yanıtlamak amacıyla hücre içi proteinler ve ek yüzey belirteçlerinin analizleri gerçekleştirilebilir. Bu teknik, immünoloji ile gelişimsel veya kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların farklı organlardan nadir popülasyonları keşfetmelerinin ve izole etmelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, hücresel dokulardan hücrelerin nasıl izole edileceği ve boyanacağı ile hücre otofloresansından kaynaklanan sınırlamaları ortadan kaldıran spektral akış sitometrisi ile yüzey belirteç ekspresyonunun nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Propidyum iyodür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken KKD kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.