Vitronektinin Bakteri Yüzeylerine Bağlanmasının Flow Sitometri Kullanılarak Tespiti

Haemophilus influenzae'nin vahşi tip ve mutant suşlarını içeren akış sitometresi tüplerini alın, tip f.

Bloke edici proteinler ve vitronektin içeren bir tampon pipetleyin. Kuluçkaya yatmak.

Bloke edici proteinler, bakteri yüzeyindeki spesifik olmayan etkileşimleri azaltırken, vitronektin molekülleri, vahşi tip bakteri yüzeylerinde vitronektin bağlayıcı bir protein olan protein H'ye bağlanır. Mutant suşta, vitronektin, protein H'nin yokluğundan dolayı bağlanmaz.

merkezkaç. Bağlanmamış vitronektini ve bloke edici proteinleri çıkarın.

Vahşi tip bakteri yüzeylerine bağlı vitronektine spesifik olarak bağlanan birincil anti-vitronektin antikorlarını içeren bir tampon ekleyin.

Daha sonra, vitronektin üzerindeki birincil antikorlara bağlanan ve vitronektin tespitini kolaylaştıran florofor konjuge ikincil antikorları tanıtın.

merkezkaç. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarın. Tampondaki bakterileri yeniden askıya alın.

Vitronektinin bakteri yüzeyine bağlanmasını belirlemek için akış sitometrisi yapın.

Vahşi tip ve mutant suşların floresan sinyallerini karşılaştırın. Yabani tip bakterilerde floresan sinyalindeki bir kayma, vitronektinin bakteri yüzeyine bağlandığını doğrular.

Akış sitometrisine hazırlanmak için, bakteri peletlerini 250 nanomolar vitronektin içeren 50 mikrolitre bloke edici tampon ile yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneleri çalkalamadan oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bakterileri 5 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Ardından peletleri PBS ve benzeri santrifüjleme adımlarını kullanarak üç kez yıkayın.

Yıkamanın ardından, PBS / BSA'da 1 ila 100 seyreltmede bakteri peletine 50 mikrolitre birincil koyun anti-insan vitronektin poliklonal antikoru ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Ardından, bağlanmamış antikorları çıkarmak için bakterileri PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, pelete floresein izotiyosiyanat konjuge eşek anti-koyun poliklonal antikorları içeren 50 mikrolitre PBS / BSA ekleyin. Karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Son olarak, üç yıkama adımından sonra, bakteri peletini 300 mikrolitre PBS ile yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.