Name: Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Öğrenin, çoklu-spektral görüntüleme akım sitometrisiyle makrofajların nanopartikül ve bakteri içselleştirmesini nasıl analiz edeceğinizi. RAW 264.7 hücreleri kullanılarak aktin polimerizasyonunun rolü değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar için mali ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum destekliyoruz.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li>
<li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. Arkadaş ImageStream X sistem üretmektedir Amnis Corporation tarafından istihdam edilmektedir.

Çalışmalar poli (laktik-co-glikolik asit (PLGA) veya polyanhydrides dayalı biyolojik olarak parçalanabilir nanopartiküller Hedef hücrelere kapsüllenmiş antijenler ya da ilaçlar sağlamak için de kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Fagositik hücreleri tarafından bu Nanopartiküllerin Uptake böylece niceliksel verme, etkinliğinin için önemlidir . roman nanoparçacık dağıtım sistemlerinin tasarımında kritik içselleştirme analizi bu yöntemi kullanarak, çeşitli hücre tipleri tarafından nanopartiküllerin diferansiyel alımı kol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RAW 264.7 hücre hattı </td><td> American Type Culture Collection&#39;dan (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Premium Grade </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı</td><td> DYP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü şişeler </td><td> DYP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kazıyıcı </td><td> DYP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Elektro Hücre Manipulator </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat (PBS) tamponlu </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasonik sıvı işlemci </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Sitokalazin-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon yıkayın </td><td> % 2 ısı inaktive FBS, PBS içerisinde% 0,1 sodyum azid. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon yıkama / Perm </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Ek kap mikrotüplerdeki Temizle-görüntülemek </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor Phalloidin 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis CorporaTION </td><td> 100200 </td><td> Seçenekler: 658nm lazer, otosampler&#39;li </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

Çoklu-spektral görüntüleme akım sitometri tarafından nanopartiküller ve bakterilerin hücresel İçselleştirilmesi analizi

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanopartikül sistemleri antijen sunan hücreler 1-5, verimli proteinler de dahil olmak üzere kargo, sağlama yeteneklerine aracılığıyla aşı teslim değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Antijen sunan hücreler tarafından nanopartiküllerin içselleştirilmesi (NP) kapsüllü antijen için etkin bir bağışıklık yanıtı elde edilmesinde kritik bir adımdır. Nanoparçacık formülasyon etkisi işlevi nasıl değişiklikleri belirlemek için, biz içselleştirilmiş nanopartiküller yanı sıra bakteri tespit ile uyumlu olan bir yüksek verimlilik, nicel deneysel protokol geliştirmeye çalıştılar. Bugüne kadar, iki bağımsız teknikleri, mikroskobu ve akım sitometri, nanopartiküllerin fagositoz incelemek için kullanılan yöntemler olmuştur. Flow sitometri ile yüksek verimlilik doğa sağlam istatistiki veriler üretir. Ancak, düşük çözünürlük nedeniyle, doğru bir hücre bağlı nanopartiküller karşı içselleştirmiş ölçmek için başarısız olur. Mikroskopi yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntü üretir; however, zaman alıcı ve küçük örneklem büyüklüğü 6-8 içerir. Çoklu-spektral görüntüleme akım sitometri (MIFC) laminar çekirdek ile eş zamanlı olarak çoklu renk spektral floresans ve parlak saha görüntüleme gerçekleştirir mikroskobu ve akım sitometri hem de yönlerini birleştiren yeni bir teknolojidir. Bu yetenek floresan sinyal yoğunluğu ve değişik yapıda ve yüksek hızda cep telefonu özellikleri arasındaki mekansal ilişkilerin doğru bir analizi sunar. Bu yazıda, polianhidrid nanopartiküller veya Salmonella enterica serovar Typhimurium içselleştirmiş olmaları hücre popülasyonu karakterize etmek MIFC kullanan bir metodu tanımlar. Ayrıca nanoparçacık süspansiyonları, hücre etiketleme, bir ImageStream X sistemi üzerinde elde edilmesi ve IDEAS uygulamasını kullanarak veri analizi hazırlanmasını açıklar. Ayrıca interne p ayırt etmek için kullanılan bir tekniği uygulaması gösterilmektediraktin-aracılı fagositozunu bir inhibitörü olarak Sitokalazin-D kullanılarak nanopartiküller ve bakteriler için athways.

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanopartikül sistemler, proteinler dahil olmak üzere kargoları verimli bir şekilde iletme yetenekleri sayesinde aşı iletiminde değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır...

Nanopartiküllerin ve bakterilerin hücre içi alma mekanizmalarını multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile analiz etmek için. Makrofajlar, aktin polimerizasyonunu inhibe etmek amacıyla önce cyto klain D ile ön işlemden geçirilir. Nanopartiküller veya salmonella, makrofaj monotabakasına eklenir ve inkübe edilir.Ardından makrofajlar hasat edilir, fikse edilir ve bir görüntü akışı kullanılarak analiz için işaretlenir. Multispektral görüntüleme akış sitometresi, nanopartikülleri ve/veya salmonella'yı internalize etmiş hücreleri, yüzeyine nanopartiküller ve/veya salmonella bağlanmış olanlardan ayırt eder. Elde edilen veriler, hem salmonella'nın hem de nanopartiküllerin yalnızca cyto klain ile işlem görmemiş hücreler tarafından internalize edildiğini göstermektedir.D, internalizasyonun aktin bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, floresan sinyal yoğunluklarının ve farklı hücresel özellikler arasındaki uzamsal çözünürlüğün yüksek hızda doğru bir ölçümünü sağlar.Bu yöntem, hem biyomalzeme aşı ve ilaç iletimi araştırmaları hem de konakçı-patojen etkileşimi çalışmalarındaki

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Zhang, Y., et al. Hücre içi bakteriler tarafından endo-lizozomal sistemin yeniden şekillenmesini incelemek için floresan nanopartiküllerin uygulanması. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre içi bakteriler tarafından enfekte edilmiş insan epitel hücrelerinde endo-lizozomal yeniden şekillenmeyi görselleştirmek için floresan nanopartiküllerin kullanımını göstermektedir. Bakteri istilasını takiben, patojenler konak hücre iskeletini ve endo-lizozomal sistemi manipüle ederek, vezikül taşınmasını...

Bakteriyel Enfekte Hücrelerde Endo-Lizozomal Yeniden Şekillenmenin Nanopartikül Aracılı Görselleştirilmesi

Biz kompakt ve maliyet-etkin opto-akışkan ekleri kullanarak bir cep telefonu üzerinde floresan mikroskop ve görüntüleme flow sitometri araçlarının entegrasyonu bizim son sonuçlarını gözden geçirin. Bu cep telefonu tabanlı mikro-analiz cihazları gibi kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda, örneğin su örneklerinin yüksek verimli tarama yanı sıra çeşitli hücre sayım görevleri yapmak gibi, sitometrik analizi için yararlı olabilir.

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Bu çalışmada temel amaç, karbon nanotüplerin (CNT'ler) hücresel alımını ve nihai ekzositozunu izlemekti. Bu perspektiften bakıldığında, burada multispektral görüntüleme akış sitometrisini kullanan, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede CNT'lerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin veren benzersiz bir yöntem önerdik.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Bu yöntem, bakterilerin fagositozunu ve oksidatif patlamayı aynı anda ölçerek granülosit fonksiyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi, hepsi göreceli fonksiyonel kapasitelerinde farklılık gösteren üç farklı aktive granülosit alt kümesinin tanımlanmasına izin verdi.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

İn vitro mikronükleus tahlil genotoksisite ve sitotoksisite değerlendirmek için iyi kurulan bir yöntemdir ama manuel mikroskobik kullanarak tahlil Puanlama zahmetli ve subjektif ve inter-scorer değişkenlik muzdariptir. Bu yazıda, multispektral görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak testin tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.

Multimodal Doğrusal Olmayan Optik Mikroskopi Kullanılarak Nanopartiküllerin Hücresel Alımının Biyomoleküler Görüntülenmesi

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Bu çalışma, memeli hücrelerinde Godanti Bhasma (GB) parçacıklarının fagositik işlenmesini, hücresel alımlarını, vakuol dinamiklerini, asitleşmelerini ve bozunmalarını karakterize ederek aydınlatmaktadır. Bu bulgular sadece temel fagositoz mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda GB'yi yeni terapötik stratejiler geliştirmek için umut verici bir model sistem olarak kurar.

Memeli Hücrelerinde Godanti Bhasma Tarafından Tetiklenen Fagositozun Sıralı Hücresel Olaylarının Araştırılması

Öğrenin, çoklu-spektral görüntüleme akım sitometrisiyle makrofajların nanopartikül ve bakteri içselleştirmesini nasıl analiz edeceğinizi. RAW 264.7 hücreleri kullanılarak aktin polimerizasyonunun rolü değerlendirilir.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Daha fazla video keşfet