Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile nanopartiküllerin ve bakterilerin içselleştirilmesinin hücresel mekanizmalarını analiz etmek. Makrofajlar ilk olarak aktin polimerizasyonunu inhibe etmek için cyto klain D ile ön işleme tabi tutulur. Nanopartiküller veya salmonella makrofaja, tek tabakaya eklenir ve inkübe edilir.

Daha sonra makrofajlar toplanır, sabitlenir ve bir görüntü akışı kullanılarak analiz için etiketlenir. İçselleştirilmiş nanopartiküllere ve/veya salmonella'ya sahip multispektral görüntüleme akış sitometresi hücreleri, yüzeye bağlı nanopartiküller ve/veya salmonella'ya sahip olanlardan ayırt edilir. Elde edilen veriler, hem salmonella hem de nanopartiküllerin yalnızca cyto klain ile tedavi edilmemiş hücreler tarafından içselleştirildiğini göstermektedir.

D, içselleştirmenin aktin bağımlı olduğunu düşündürmektedir. Bu tekniğin, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, yüksek hızda farklı hücresel özellikler arasında floresan sinyal yoğunluklarının ve uzamsal çözünürlüğün doğru bir ölçümünü sağlar.

Bu yöntem, hem biyomalzemeler, aşı hem de ilaç dağıtım araştırmalarının yanı sıra patojen etkileşim çalışmalarının yanı sıra anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, poli anhidrit, nanopartiküller ve bakteriler tarafından kullanılan içselleştirme yollarının tanımlanmasını içerir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler genellikle mücadele eder.

Optimum floresan sinyallerini elde etmek için boyaları titre etmek için zaman harcamak önemlidir. Ayrıca, yazılımı tanımak ve analiz şablonları oluşturmak zaman alır. Bu yöntem için ilk olarak, poli hidro nanopartiküllerin mikroskopi ve diğer teknikleri kullanırken patojen taklit etme özellikleri sergilediğini bulduğumuzda aklımıza geldi.

Daha sonra, testi gerçekleştirmeden önce salmonella ve polen hidrit nanopartikülleri tarafından kullanılan içselleştirme süreçlerini karşılaştırmak için yüksek verimli bir sistem istedik. Tüm memeli ve bakteri hücre kültürleri hasat edilmeli ve nanopartikül süspansiyonları hazırlanmalıdır. Bir hücre kazıyıcı kullanarak birleşen RA W2 64.7 hücrelerini hasat ederek başlayın.

Bir hemo sitometre kullanarak hücre numarasını belirleyin. Daha sonra hücreleri, 0.5 mililitrede oyuk başına beş kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda 24 oyuklu bir kültür kabına yerleştirin. Tam DMEM inkübatörünü gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.

Salmonella'yı hazırlamak için, 16 x 125 milimetrelik bir otoklav vidalı kapaklı cam kültür tüpünde RA W2 64.7 hücre başına yüz enfeksiyon çokluğu elde etmek için salmonella'yı C-D-M-E-M'de seyreltik olarak dönüştürün. Daha sonra, sterilize peynir altı suyu kağıdı kullanarak, rean meslektaşları tarafından 2009 yayınlarında ve 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde farmasötik araştırmalarında açıklandığı gibi üretilen beş miligram% 1 FITC yüklü poli anhidrit nanopartiküllerini tartın. Nanopartikülleri 0.5 mililitre soğuk fosfat tamponlu tuzlu suya ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.

Tüpü buz üzerinde tutmak. Süspansiyonu dört ila altı joule'de yaklaşık 25 saniye boyunca sonikasyon yapmak için mikro uçlu bir ultrasonik sıvı işlemcisi kullanın. Artık gerekli tüm hücreler ve reaktifler hazır olduğuna göre, fagositoz testi yapılabilir.

Etiket 24, ilk plaka üzerindeki tahlil için hazırlık olarak kültürlenmiş RA W2 64.7 hücreleri içeren kuyu doku kültürü plakaları. Aşağıdaki numunelerin her biri üç kopya halinde test edilecektir, sito ve D nanopartiküllerle, sito ve D ile salmonella, orta nanopartiküllerle, orta sadece salmonella nanopartikülleriyle, sadece salmonella ile ve AF altı 60 leke hücresi sadece dört santigrat derece kontroller ikinci plaka üzerinde test edilecek ve orta artı nanopartiküller ve orta artı salmonella inkübasyonunu içerecektir, indüksiyondan bir saat önce fagositoz gibi yavaş hücresel süreçler. Uygun kuyucuklara mililitre cyto ve D ve C-D-M-E-M başına beş mikrogram ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, nanopartikül süspansiyonunu girdaplayın ve uygun kuyucuklara 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra salmonella'yı girdaplayın ve 100 MOI'de uygun kuyucuklara ekleyin. Karıştırmak için plakaya birkaç kez dokunun.

Daha sonra numune plakalarını 37 santigrat dereceye ve negatif kontrol plakalarını 45 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. İnkübasyonun ardından, plakaları buzun üzerine yerleştirin, hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın, bağlanmamış parçacıkları, salmonellayı ve ölü veya ayrılmış hücreleri çıkarmak için eski ortamı aspire edip atın. Petal magnezyum kullanımı.

Bu aşamada ön PBS önemlidir çünkü hücrenin substrattan ayrılmasını kolaylaştırır Hücreleri hasat etmek için 250 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve kuyuları nazikçe kazıyın, hasat edilen hücreleri silikonlu geçmeli kapaklı mikro santrifüj tüplerine pipetleyin ve buz üzerinde tutun. Hücreleri bir mililitre soğuk yıkama tamponu ekleyerek yıkayın, ardından dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, ters çevrilmiş mikro santrifüj tüpünü kağıda vurarak kalan tamponu çıkarın.

Havlu, mikro santrifüj tüpünü bir test tüpü rafı boyunca nazikçe tırmıklayarak hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri sabitlemek için PBS'ye 100 mikrolitre %4 para formaldehit ekleyin ve hücrelerin 15 dakika bekletilmesine izin verin. Oda sıcaklığında, bir mililitre perma yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın, ardından dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, kalan tamponu daha önce olduğu gibi çıkarın. Daha sonra RA W2 64.7 hücrelerini boyamak için. Aktin için, 15 dakika boyunca altı 60'ta Alexa Fluora foid içeren 100 mikrolitre perma yıkama tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında, lekelenmemiş numuneler perma ile inkübe edilmeli, phin'siz yıkama tamponu ile inkübe edilmelidir. Boyamadan sonra, hücreleri tekrar yıkayın ve santrifüjleyin, daha sonra% 1 PFA içeren 50 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve elde edilene kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Gücü açın, görüntü akışı yapın ve başlatın.

Dosya menüsünde fluidics'i ilham verin ve başlatın. Varsayılan şablonu yükle'yi seçin. Görüntü galerisinde, görünüm menüsünde, tümünü seçin ve gerekirse boncukları görüntülemeye başlamak için kurulumu çalıştır'a basın, çekirdek izlemeyi görüntüleri yanal olarak ortalayacak şekilde ayarlayın.

Parlak alan kanalını seçin ve yoğunluğu ayarla'ya tıklayın. Akış hızı değişim katsayısı sürekli olarak %0,2'den az olana kadar bekleyinYardım sekmesinde, kalibrasyonları ve testleri çalıştırmak için tümünü başlat'a tıklayın ve yazılımda hepsinin geçtiğini doğrulayın. Örnek yükle'ye tıklayın.

Daha sonra talimat verildiğinde, en parlak numuneyi içeren şişeyi yerleştirin. Numune yükleyicideki tüm florokromlarla 40 x büyütmeyi seçin. Cihaz ayarları oluşturulduktan sonra, tüm deney için bunları değiştirmeyin.

Yazılımdaki lazer simgelerine tıklayarak deneydeki her lazeri açın ve lazer gücünü, her bir florokromun dağılım grafiklerinde ölçüldüğü gibi 104.000 sayım arasında maksimum piksel değerlerine sahip olacak şekilde ayarlayın. İstenmeyen nesnelerin toplanmasını ortadan kaldırmak için, yazılımdaki hücre sınıflandırıcı penceresine tıklayın. Ardından, yalnızca hücre verilerini toplamak için, parlak alan için alan alt limit kanalı bir seçin ve değeri 50 mikrometre olarak ayarlayın, alanı 50 mikrometreden az olan nesneler enkaz olarak kabul edilecek ve edinilmeyecektir.

Buradaki yazılımda uygun kanal simgelerine tıklayarak toplanacak kanalları seçin. Kurulum sekmesi altında 1, 2, 3, 4, 5 ve altıncı kanallar seçilir. Dosya numarasını ve hedef klasörü girin.

Sıra numarasını bir olarak ve alınacak olay sayısını 5.000 olarak ayarlayın. İlk deney veri dosyasını toplamak ve kaydetmek için çalıştır, al'a tıklayın. FLL'ye tıklayın ve sonraki deneysel örneği çalıştırın.

Tüm deneysel örnekler toplanana kadar tekrarlayın. Ardından, kontrolleri çalıştırmak için comp ayarlarına tıklayın. Bu, parlak alanı ve saçılma lazerini kapatacak ve tüm floresan kanallarının edinme sekmesi altında toplanmasını sağlayacaktır.

Giriş değerini 500 olarak değiştirin. Ardından kontrol tüpünü yerleştirin ve çalıştır'a tıklayın. Tek lekeli kontrollerde 500 pozitif hücre toplamak için elde edin.

Bir kompanzasyon matrisi geliştirmek için deneydeki her florokrom için tekrarlayın. Tüm örnek görüntüler elde edildikten sonra, masaüstündeki fikirler simgesine çift tıklayarak fikir analizi yazılımını ayrı bir analiz bilgisayarında başlatın. İçselleştirme sihirbazına çift tıklayın ve test örneği RIF dosyalarından birini yükleyin.

Bir açılır pencere, test dosyalarının yüklenmesi için talimatlar sağlayacaktır. Talimatları izleyin ve ileri düğmesine tıklayın. Ardından, yeni matrise tıklayın.

Bu, tazminat sihirbazını başlatacaktır. İstendiğinde, eklemek için tek renk denetimlerinin veri dosyalarını seçin. Telafi matrisi dosyası kaydedilene ve içselleştirme sihirbazının ikinci adımındaki kutuya yüklenene kadar yönergeleri izleyerek sihirbazda sonraki öğesine tıklayın.

İleri'ye tıklayın ve bir DAF dosyası oluşturulana kadar yönergeleri izleyin. Alma sırasında kullanılan görüntü kanallarını seçerek görüntü görüntüleme özelliklerini ayarlayın. FITC için ikinci kanala ve AF six 60 için beşinci kanala tıklayın.

Parlak alan ve yan saçılma varsayılan olarak seçilidir. Hücre sınırını oluşturmak için Brightfield kanal O'yu ve tek hücre popülasyonunu tanımlamak için içselleştirme probu için nanopartiküllerin veya bakterilerin toplandığı kanal O2'yi seçin, tüm hücrelerin parlak alan alanına karşı parlak alan en boy oranına karşı bir dağılım grafiği oluşturulur. Birden çok veri dosyasının yüksek aktarım hızı analizi bir şablon dosyası gerektirir ve bu nedenle bir şablon dosyası oluştururken geçitleri dikkatli bir şekilde tanımlamak kritik öneme sahiptir.

Her nokta, tek bir hücre görüntüsünün değerlerini temsil eder. Bir teke tıklayın. Görüntü galerisinde söz konusu hücrenin görüntüsünü seçmek için bir grafikte.

Ardından, tek hücre olaylarına karşılık gelen alan ve en boy oranına sahip hücrelerin etrafına bir geçit çizin. Tek hücrelerin en boy oranı birinci tur ve çiftlerdir. Yaklaşık 0.5 en boy oranına sahip olun.

Tek hücreler içeren bölge ile çiftler veya döküntüler arasında ayrım yapmak için birden çok hücreye tıklayın. Parlak alan gradyanının histogramını oluşturmak için, kök parlak alan görüntüsünün karesi anlamına gelir. İleri düğmesine tıklayın.

Ardından, seçilen bölmeyi görüntülemek için nüfus sekmesi altında bölme seçeneğini belirleyin. Hücrelerin nerede olduğunu belirlemek ve en iyi odaklanmak için bölmelere tıklayın. Odaklanmış hücreleri yürümeye başlamak için bir çizgi bölgesi çizin.

Gradyan RMS ne kadar yüksek olursa, o kadar iyi odaklanır, üzerinde geçilecek başka lekeler olmadıkça bir sonraki adımı atlayın. X eksenindeki ikinci kanalın yoğunluğunun yeni bir dağılım grafiği ile Y eksenindeki ikinci kanalın maksimum pikselinin karşılaştırılması oluşturulur. Nanopartiküller veya bakteriler için pozitif olan hücrelerin etrafında çizilecek bölgeyi belirlemeye yardımcı olmak için noktalara tıklayın ve görüntüleri görüntüleyin.

İçselleştirme özelliğinin bir histogramı, sıfırdan başlayan ve görüntüler gözlemlenerek ayarlanması gereken bir bölge ile oluşturulur. İçselleştirme özelliği, hücre içindeki yoğunluğun tüm hücrenin yoğunluğuna oranıdır. Sıfır değerinde yoğunluğun yarısı içeride olacak şekilde ölçeklendirilir.

Sihirbaz, hücre yüzeyini bulmak için hücre görüntüsü girişi olan bir maske yaparak her hücrenin içini belirleyen bir bölge oluşturmuş ve bunu dört piksel aşındırmıştır. Bu maskenin, önce parlak alan görüntüsünde bir nesne maskesi oluşturularak ve bunu daha fazla veya daha az piksel aşındırarak gerektiğinde farklı hücre türleri için manuel olarak ayarlanabileceğini unutmayın. İçselleştirme özelliği, yazılımdaki bir algoritma kullanılarak bu aşınmış nesne maskesine dayalı olarak hesaplanır.

Bu özellik, floresan sinyallerinin çoğunluğu maske sınırı içinde olan içselleştirilmiş parçacıkları ve bakterileri, bu örnekte gösterildiği gibi floresan sinyallerinin çoğunluğu maske sınırının dışında olan yüzeye bağlı parçacıklardan ve bakterilerden ayırt etmemizi sağlar, aşınmış nesne maskesine dayalı yeni bir içselleştirme özelliğine sahip yeni bir histogram oluşturur. Görüntüleri seçilen bölme modunda görüntüleyerek içselleştirilmiş hücrelere geçit vermek için bir bölge çizin. Kapıyı 0.3'e ayarlayın.

0.3'ten düşük puana sahip hücreler, yüzeye bağlı parçacık pozitif hücreler olarak kabul edilir. Arka plan etiketlemeli hücreleri ortadan kaldırmak ve belirli içselleştirilmiş nanopartikülleri veya bakterileri tanımlamak için analiz menüsünden özellikleri seçin. Analiz menüsüne tıklayın.

Ardından, ortalama nokta sayısını istatistik raporuna eklemek için yanındaki nokta sayımı özelliğine tıklayın. Raporlar menüsünde, raporlar simgesine tıklayın. Ardından istatistik raporunu tanımlayın, ardından sütunlar ekleyin, ardından uygun hücre popülasyonunu seçin.

Tamam'a tıklayın. İçselleştirme sihirbazı, veri dosyasını tüm deneysel dosyaların toplu analizi için kullanılacak şablon dosyası olarak kaydetmek için bu rapora otomatik olarak istatistikler ekleyecektir. Dosya menüsüne tıklayın ve şablon olarak kaydet'i seçin.

Şablon dosyaları. Fikir yazılımındaki birden fazla veri dosyasını analiz etmek için nokta AST uzantısına sahip olun. Araçlara tıklayın ve toplu veri dosyalarını seçin ve tüm RIF dosyalarını girin.

Toplu işlemi işlenmek üzere göndermek için tazminat matrisi dosyasını ve şablon dosyasını ilgili bölümlere ekleyin, gönder'e tıklayın. İşleme adımından sonra, tüm RAF dosyaları analiz edilir ve her bir ham dosya için DAF dosyaları oluşturulur. Aktin inhibisyonunun ve düşük sıcaklığın salmonella ve nanopartiküllerin fagositozu üzerindeki etkisini karşılaştırmak için tüm numuneler için istatistiklerle birlikte nihai bir rapor oluşturulur.

RA W2 64.7 hücreleri, sito klain D ile veya sito klain D olmadan ortamda 37 santigrat derecede inkübe edildi veya dört santigrat derecede ortamda inkübe edildi. Hem sıcaklık hem de aktin manipülasyonları, hem nanopartiküllerin hem de salmonella'nın içselleştirilmesini azalttı. Bununla birlikte, hücrelerin sito ve D'de inkübe edilmesi, yüzeye bağlı nanopartiküllere sahip hücrelerin yüzdesini arttırırken, yüzeye bağlı salmonellalı hücrelerin yüzdesini azaltır.

Yüzeye bağlı nanopartiküller için pozitif hücrelerin yüzdesi, 37 santigrat derecede yaklaşık% 8'den, sito ve D veya dört santigrat derece muameleden sonra% 35'in üzerine çıkar. Buna karşılık, yüzeye bağlı salmonellalı hücrelerin yüzdesi %35'ten %15'e düşürüldüCyto ve D tedavisinin ardından, RA W2 64.7 hücrelerinin salmonella ile dört santigrat derecede inkübe edilmesi, 37 santigrat derece kontrolüne kıyasla yüzeye bağlı bakteri miktarında belirgin bir artış olmadan içselleştirmeyi azalttı. Birlikte, bu veriler salmonella ve nanopartiküllerin, aktin gerektiren ve sıcaklığa bağlı olan benzer bir hücresel süreçle içselleştirildiğini göstermektedir.

Ayrıca, veriler salmonella'nın makrofajlara sürekli bağlanmasının aktin polimerizasyonu gerektirdiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile nanopartiküllerin ve bakterilerin hücresel içselleştirilmesinin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, inhibitörlerin sitotoksik olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, kullanılacak optimal konsantrasyonları belirlemek için önceki sitotoksisite profilleme deneyleri gereklidir. Salmonella ile çalışmanın tehlikeli önlemler olabileceğini unutmayın, örneğin uygun kişisel koruyucu ekipman giymek ve bu prosedürü gerçekleştirirken aerosol oluşumundan kaçınmak gibi önlemler alınmalıdır.