SIV'e Özgü CD8⁺ Bellek T Hücrelerini Analiz Etmek için Bir Peptit-MHC-I Tetramer Boyama Tekniği

Simian immün yetmezlik virüsüne veya SIV'e karşı CD8 ⁺ bellek T hücreleri içeren insan olmayan primat periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri alın.

T hücresi reseptörünün içselleştirilmesini veya sonraki stimülasyon üzerine TCR'yi önlemek için bir protein kinaz inhibitörü ekleyin.

Peptit-majör histouyumluluk kompleksi sınıf I'i veya pMHC-I tetramerleri, SIV'e özgü peptitlere bağlı dört MHC-I molekülü içeren florofor-konjuge kompleksleri tanıtın. Bu peptitler, T hücrelerinin yüzeyindeki TCR'lere bağlanır.

CD8, CD28 ve CCR7'ye bağlanan florofor konjuge antikorlar içeren bir karışım ekleyin - bellek T hücresi alt kümelerini tanımlayan belirteçler - ve CD8 ⁺ olmayan hücreleri etiketleyen antikorlar.

Bir floresan canlılık boyası ölü hücreleri etiketler.

Hücreleri düzeltin. Hücre içi hedeflere erişmek için onları geçirgen hale getirin.

Bir T hücresi markörü olan CD3'ü ve aktive edilmiş bir CD8 ⁺ T hücresi markörü olan hücre içi granzim B'yi bağlayan florofor konjuge antikorları ekleyin.

Akış sitometrisi kullanarak, CD8 ⁺ olmayan T hücrelerini ve ölü hücreleri dışlayın.

Granzim B, CD28 ve CCR7 seviyelerine dayalı olarak farklı bellek CD8⁺ T hücresi alt kümelerini karakterize etmek için pMHC-I tetramer pozitif CD8 ⁺ T hücrelerini kapılayın.

Rhesus PBMC'leri R-10 ortamında mililitre konsantrasyonunda 1.6 kez 10 ila yedinci hücrelerde yeniden süspanse ederek başlayın. Uygun sayıda akış sitometri tüpüne 50 mikrolitre hücre ekleyin ve her tüpe 50 mikrolitre protein kinaz inhibitörü ekleyin. Her tüpü vorteksleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Doğru miktarda titre edilmiş peptit MHC tetramer, tüm deney tüplerini lekelemek için yeterince ana karışım seyreltilmelidir. Bu nedenle, pipetleme hatalarını hesaba katmak için ana karışımdan %15 fazla hazırlamak önemlidir.

Hücreler inkübe edilirken, arka plan lekelenmesini en aza indirmek için protein agregatlarını ve tetramer çözeltisini santrifüjleme yoluyla peletleyin. Daha sonra, tetramerleri yeterli leke tamponunda seyreltin, böylece her bir akış sitometri tüpüne 25 mikrolitre tetramer ana karışımı eklenebilir. Daha sonra, numune tüplerini girdaplayın ve PBMC tetramer çözeltilerini karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonunda uygun numune tüplerine 50 mikrolitre boyama mastermiksi ilave ediniz ve tüpler vorteksleme yaparak karıştırılır.

Oda sıcaklığında karanlıkta 25 dakika sonra, hücreleri yıkama tamponu ile yıkayın, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve peletleri bozmadan süpernatanı dikkatlice boşaltın. Her tüpte kalan tampondaki hücreleri vorteksleyin ve numuneleri tüp başına 250 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin. Tüpleri hemen girdaplayın ve karanlıkta 4 santigrat derecede inkübe edin. 20 dakika sonra, hücreleri taze yıkama tamponunda yıkayın, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve peleti bozmadan süpernatanı boşaltın.

Hücreleri 500 mikrolitre geçirgenlik tamponu, girdap içinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkayın ve peletleyin. Ardından, daha önce açıklandığı gibi süpernatanları boşaltın. Uygun tüplere 50 mikrolitre hücre içi leke ana karışımı eklemeye devam edin. Her numuneyi vorteksleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon yapıldıktan sonra, hücreleri yıkayın ve peletleyin. Numuneler artık bir akış sitometresinde alınmaya hazırdır.