İmmün kompleksler kullanılarak dendritik hücre aktivasyonunun akış sitometrisi tabanlı analizi

Kimyasal olarak sabitlenmiş bir tümör hücresi süspansiyonu ile başlayın.

Tümör hücresi yüzey antijenlerine bağlanan, bağışıklık kompleksleri veya IC'ler oluşturan optimum bir tümör bağlayıcı immünoglobulin G konsantrasyonu ekleyin.

IC'leri, yapışmış dendritik hücreler içeren bir kültür plakasına aktarın. Kuluçkaya yatmak.

Dendritik hücre IC'yi tanır, içselleştirir ve onu peptit parçalarına dönüştürür.

Fragmanlar, majör histokompatibilite kompleksi sınıf II veya MHC-II moleküllerine yüklenir ve kostimülatör molekül CD86 ile birlikte hücre yüzeyinde sunulur.

Medyayı çıkarın. Bir hücre ayrışma tamponu ekleyin ve hücreleri ayırmak için kuvvetlice pipetleyin.

Hücreleri bir tüpe aktarın.

Spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için hücreleri bir bloke edici solüsyonda santrifüjleyin ve yeniden askıya alın.

MHC-II ve CD86'yı hedefleyen florofor etiketli bir antikor kokteyli ile kaplayın.

DNA bağlayıcı bir boya ekleyin ve ölü hücre çekirdeklerini boyamak için kısa bir süre inkübe edin.

Akış sitometrisini kullanarak, IC aracılı dendritik hücre aktivasyonunu doğrulayarak MHC-II ve CD86'yı birlikte eksprese eden canlı hücreleri tanımlayın.

İlk olarak, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1.8 tamponlu paraformaldehit içinde sabitleyin. Hücre süspansiyonunu U şeklinde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tohumlayın. Daha sonra, her bir oyuğa değişen tümör bağlayıcı antikor dilüsyonları ekleyin. Daha sonra, hücreleri 15 ila 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri 150 mikrolitre fosfat tamponlu salin ile yıkayın, daha sonra 4 santigrat derecede 5 ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı dışarı atın ve hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri, florofor konjuge ikincil antikor içeren 100 mikrolitre FACS tamponunda çözün. Daha sonra, plakayı 15 ila 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.

15 ila 20 dakika sonra, hücreleri yıkamak için 200 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. Plakayı 5 ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın. Tümör bağlanmasını analiz etmek ve hücreleri kaplamak için gereken minimum immünoglobulin G konsantrasyonunu belirlemek için akış sitometrisi yapın.

Hücreler minimal immünoglobulin G konsantrasyonu ile kaplandıktan sonra, CFSE etiketli tümör bağışıklık kompleksini monosit türevli dendritik hücrelere 1: 5 oranında ekleyin. Ardından, karışımı gece boyunca tam ortamda 12 ila 16 saat inkübe edin. Monosit kaynaklı dendritik hücre aktivasyonunun FACS analizini gerçekleştirin.