İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi

CD34 ⁺ hematopoietik kök hücreler veya HSC'ler dahil olmak üzere insan göbek kordonu kan hücreleri ile başlayın.

Hücresel Fc reseptörlerini bloke etmek için antikorlar ekleyin, HSC'ye özgü manyetik boncukların spesifik olmayan bağlanmasını önleyin.

CD34 ⁺ HSC'leri hedefleyen antikor kaplı manyetik boncukları tanıtın. Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Hücreleri bir tamponda yeniden askıya alın. Boncuk bağlı HSC'leri tutmak için bunları manyetik bir ayırıcıdan geçirin; İlişkisiz hücreler akar.

HSC'leri toplamak için manyetik alanı çıkarın.

Hücreleri bir büyüme ortamında santrifüjleyin ve yeniden askıya alın. Hücreleri plakalayın ve inkübe edin.

Ortam, HSC'nin hayatta kalmasını ve genişlemesini destekleyen büyüme faktörleri ve sitokinler içerir.

Hücreleri hasat edin. Bir dondurma ortamı ekleyin, bir kriyoviyal aktarın ve dondurun.

Bir insan bağışıklık sistemi veya HIS, fare modeli oluşturmak için HSC'leri çözün. Önceden ısıtılmış bir ortama ekleyin.

Hücreleri bir tamponda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.

Hücreler, HIS modeli üretimi için immün yetmezliği olan bir fare yavrusuna enjekte edilmeye hazırdır.

Başlamak için, kordon kanından izole edilen CD34 pozitif hücre peletini 1 x 10⁸ hücre başına 300 mikrolitre manyetik hücre ayırıcı tamponunda yeniden süspanse edin. 1 x 10⁸ hücre başına 100 mikrolitre FcR bloke edici reaktif ekleyin, ardından 1 x 10⁸ hücre başına 100 mikrolitre CD34 pozitif manyetik boncuk ekleyin ve 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, 1 x 10⁸ hücre başına 5 mililitre manyetik hücre ayırıcı tampon ekleyin ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 360 g'da döndürün. Yıkama adımını tekrarlayın ve peleti, 'fraksiyonsuz' etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpte 100 milyon manyetik hücre ayırıcı tampon hücresi başına 500 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin. CD34 negatif ve CD34 pozitif olmak üzere iki adet 15 mililitrelik tüpü daha etiketleyin. Üç tüpü bir soğutma rafına yerleştirin.

Bir biyogüvenlik kabinindeki otomatik manyetik hücre ayırıcı üzerindeki iki sütunlu pozitif seçim programını kullanarak hücreleri ayırın. Daha sonra, CD34 pozitif insan kök hücrelerini genişletmek ve dondurmak için, el yazmasında tarif edildiği gibi kordon kanı veya CB ortamı hazırlayın ve 0.22 mikronluk bir filtreden geçirin. CD34 pozitif hücreleri mililitre CB ortamı başına 100.000'de yeniden süspanse edin ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

Üçüncü günde, şişeye sitokin içermeyen eşit hacimde CB ortamı ekleyin. Beşinci günde, genişlemiş CD34 pozitif hücreleri hasat edin. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Şişenin altını kaplayacak kadar CB ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin tüm tabanını kazıyın. Tüm ortamı aynı 50 mililitrelik tüpe ve santrifüje toplayın.

Hücreleri 2 mililitre CB ortamında yeniden süspanse edin ve santrifüjleyin. Ortamı pelete kadar aspire edin ve peleti dondurucu bir ortamda yeniden süspanse edin. Ardından, yavru ışınlamasından üç saat sonra CD34 pozitif hücre hazırlığına başlayın. 10 mililitrelik CB ortamını 50 mililitrelik bir tüpte ısıtın.

Enjekte edilecek her dört ila altı yavru için in vitro genişletilmiş ve donmuş CD34 pozitif hücrelerden oluşan bir şişe alın. 50 ila 55 santigrat derecede, sadece az miktarda buz görünene kadar hızla çözün ve hücreleri ısıtılmış CB ortamına ekleyin. Her bir şişeyi durulamak için 1 mililitre ortam kullanın ve hücreleri 360 g'da 4 santigrat derecede 12 dakika döndürün.

Ortamı dikkatlice aspire edin. Peleti 2 mililitre CB ortamında tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın. Yine, hücreleri santrifüjleyin, ortamı aspire edin ve peleti n başına 100 mikrolitre steril PBS artı enjekte edilecek 1 yavru içinde yeniden süspanse edin, bu da fare başına 250.000 ila 450.000 CD34 pozitif hücre ile sonuçlanır.