Fare Hipokampal Nöronlarını Kültürlemek İçin Bir Teknik

Bir tamponda hasat edilmiş bir fare yavrusu hipokampusu alın.

Hipokampusu daha küçük parçalara ayırın ve bunları konik bir tüpe aktarın.

Dokuyu tampon ile yıkayın. Parçalar yerleştikten sonra tamponu çıkarın. Şimdi, taze tampon ve tripsin ekleyin.

Kuluçka sırasında, proteolitik bir enzim olan tripsin, dokunun hücre dışı matrisini sindirerek hipokampal nöronları gevşetir.

Sindirilmiş dokuyu tampon ile yıkayın.

Parçalar yerleştikten sonra tamponu çıkarın. Taze tampon ekleyin ve dokuyu mekanik olarak ayırmak için tekrar tekrar pipetleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edin.

Sindirilmemiş doku çöktüğünde, hücre süspansiyonunu, ortam içeren bir kültür plakası içinde balmumu destekleri olan poli-L-lizin kaplı lamellere aktarın.

Hücreler, elektrostatik etkileşimler yoluyla poli-L-lizin kaplı yüzeylere bağlanır.

Şimdi, nöron yapışık lamelleri aşağı bakacak şekilde serumsuz ortamda kortikal glial veya nöronal olmayan hücreler içeren bir tabağa yerleştirin.

Kültürde, balmumu destekleri, nöronlar ve glial hücreler arasındaki doğrudan teması önleyerek, glial hücre tarafından salgılanan faktörlerin nöronal sağkalımı ve olgunlaşmayı teşvik ettiği bir mikro ortam yaratır.

Başlamak için, bir Petri kabında HBSS besiyeri olan doğum sonrası, bir günlük yavrulardan altı ila sekiz hipokampusu inceleyin. Hipokampusu diseksiyon makasıyla daha küçük parçalar halinde doğrayın ve bunları tabaktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hipokampusları 5 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın ve yıkamadan sonra 4,5 mililitre HBSS'de bırakın.

4,5 mililitre HBSS'ye 0,5 mililitre% 2,5 tripsin ekleyin ve tüpü her 5 dakikada bir ters çevirerek 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin. İyi sindirilmiş hipokampus yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır. Gerekirse, sindirimi 5 dakika daha uzatın.

Hipokampusu HBSS ile yıkama başına 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra 2 mililitre HBSS ekleyin ve hipokampusu bir Pasteur pipeti ile 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Dokuyu ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile 10 kez ezin ve tüm parçalar dibe oturana kadar tüpü beş dakika dinlendirin. Çoğu kaybolana kadar kalan parçalarla ezmeyi tekrarlayın.

Ardından, ayrışmış nöronları içeren süpernatanı kaplama kaplarına nazikçe aktarmak için 1 mililitrelik bir pipet ucu kullanın. Doğrudan önceden inkübe edilmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın. Tohumlamadan 2 ila 4 saat sonra, kaplama kaplarını ışık mikroskobu ile kontrol edin. Nöronların çoğunluğu lamel üzerine yapışmış olmalıdır.

İnce uçlu bir forseps kullanarak, lamelleri, balmumu nokta tarafı aşağı bakacak şekilde önceden koşullandırılmış nöronal kültür ortamı içeren glial hücre besleyici kaplarına çevirin. Nöronlar, glia hücre besleyici kaplarında bir aya kadar büyüyebilir. Nöronları her yedi günde bir 1 mililitre taze nöronal kültür ortamı ile besleyin.