Genetiği Değiştirilmiş Drosophila Beyinlerinde Protein Agregatlarının Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Genetiği değiştirilmiş Drosophila beyinleri ile başlayın. Bu beyinler, nöronda kırmızı floresan etiketli bir mutant proteini ifade eder ve çevredeki glial hücreye yayılabilir ve sarı floresan etiketli normal proteini ifade ederek agregasyonlarına neden olur.

Hücresel bütünlüğü koruyan fiksatif bir çözelti ekleyin.

Sabitleyiciyi çıkarın ve bir tamponla yıkayın.

Bir antifade reaktifi ekleyin ve floresan sinyallerin solmasını önlemek için inkübe edin.

Beyinleri bir slayta aktarın ve fazla sıvıyı çıkarın.

Beyinlerin slayta yapışmasına izin verin.

Bir lamel parçalarını ara parça olarak kullanarak, üzerlerine bir lamel yerleştirin. Antifade reaktifi ekleyin ve kapatın.

Konfokal mikroskop altında, kırmızı ve sarı floresan için farklı uyarma dalga boylarını kullanarak görüntüler yakalayın.

Görüntü analiz yazılımını kullanarak protein agregatlarını ölçün.

Kırmızı ve sarı floresanın birlikte lokalizasyonu, mutant proteinlerin yayılmasını gösterir.

Tüm beyinler diseke edildikten sonra, toplama tüpünü oda sıcaklığında bir nutatora aktarın ve yaklaşık 5 dakika sallayın. Fiksasyon süresinden sonra, fiksatif solüsyonun çoğunu bir P1000 pipeti kullanarak çıkarın ve beyinleri tüplerde bırakmaya çok dikkat ederek atın. Bu, nazik emme ve dikkatli gözlem gerektirir.

Ardından, beyinlere 1 mililitre taze PBST ekleyin. Tüpü örtün ve kalan sabitleyiciyi yıkamak için yaklaşık bir dakika nutatör üzerinde sallanmasına izin verin. Ardından solüsyonu çıkarın ve bu kısa yıkama adımını tekrarlayın.

İki kısa yıkamayı 5 dakikalık bir yıkama, ardından 20 dakikalık üç yıkama ve son olarak 1 saatlik tek bir yıkama ile takip edin. Son yıkamadan sonra, PBST'nin çoğunu dikkatlice çıkarın ve beyinleri 30 mikrolitre gliserol bazlı solma önleyici reaktife batırın. Ardından, beyinleri karanlıkta 4 santigrat derecede 1 ila 24 saat boyunca hareket etmeden kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, körelmiş bir pipet ucu kullanarak beyinleri toplama tüpünden çıkarın ve bunları bir mikroskop lamına aktarın. Ardından, forseps kullanarak görüntüleme için beyinleri gerektiği gibi nazikçe yönlendirin. Birden fazla numune aynı kızağa ayrı sıralar halinde monte edilebilir.

Ardından, katlanmış bir laboratuvar dokusunun köşesini kullanarak fazla solma önleyici reaktifi slayttan çıkarın. Dokunun beyinle temas etmesine izin vermeyin. Ardından, beynin slayta yapışmasını sağlamak için örnekleri 5 ila 10 dakika karanlıkta bırakın.

Daha sonra, kırık kapak camından küçük parçalar alın ve bunları yaklaşık 19 milimetre karelik bir alanı kaplayacak şekilde beynin etrafına yerleştirin. Ardından, bir köprü montajı yapmak için 22 milimetre karelik bir kapak camını beyin ve cam mozaiğinin üzerine yavaşça indirin. Ardından, boş alanları doldurması için lamel altına taze solma önleyici reaktifi yavaşça dağıtın. Bunu çok dikkatli bir şekilde yapın, böylece beyin ve cam yerinde kalır. Ardından, lameli oje ile kapatın. İlk olarak, sadece köşelere uygulayın. Kenarlar boyunca sızdırmazlığı tamamlamadan önce köşe lekelerinin 5 ila 10 dakika kurumasını bekleyin. Beyinler mümkün olan en kısa sürede görüntülenmelidir.

Transgenlerin ifade edildiği beyin bölgesinde z-dilimlerini toplamak için 40x veya 63x yağ objektifi ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak monte edilmiş beyinleri görüntüleyin. Ardından, tek tek z dilimlerindeki punktayı ölçerek veya alternatif olarak dilimleri üç boyutlu olarak oluşturduktan sonra verileri analiz edin.

İyi ayrılmış ve çok az arka plan sinyaline sahip mutant Huntington agregalarını ölçmek için, konfokal z serisini 3D Görüntüleme Modunda açın. Ardından, seçili bir kanaldaki tek tek noktaları belirlemek için Çözümleme Sihirbazı'nı kullanın.

Ayarlarda, görüntüdeki tek tek nesneler olarak tüm heterojen boyutlu toplamaları doğru bir şekilde temsil etmek için eşiği ve filtreleri ayarlayın. Ardından, yakından ilişkili toplamaları ayırmak için İkili İşleme Ön Filtresi altında Nesneleri Böl'ü etkinleştirin. Yazılım tarafından tanımlanan nesnelerle ilgili nicel bilgiler, Ölçümler altında raporlanır.

Punktaları saydıktan sonra, bunları görüntü analiz yazılımında daha fazla karakterize edin. Örneğin, agrega çapı, hacmi veya yoğunluk bilgilerini elde etmek için noktaların veya yüzeylerin ilgili ölçümlerini yapın. Bazı vahşi tip Huntington agregaları, z-yığını boyunca manuel olarak hareket ettirilerek ve çevredeki dağınık sinyalden ayırt edilebilen yeşil punktalar sayılarak ölçülebilir.

Birden fazla dilimde göründüklerinde tek agregaları iki kez saymaktan kaçınmaya dikkat edin. İlgilenilen bir başka analiz, Huntington Q25-YFP ve Huntington Q91-mCherry agregaları arasındaki ortak lokalizasyon sıklığının belirlenmesidir. Bunu, konfokal bir z yığını boyunca dilim dilim hareket ettirerek manuel sayma kullanarak yapın.