Transmisyon Elektron Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyin Bölümünün Ultrastrüktürel Analizi

Bir reçine bloğuna gömülü osmiyum tetroksit ile sabitlenmiş bir fare beyni bölümü alın.

Bir kesit görüntüsü elde edin ve ilgilenilen bölgeyi belirlemek için önceden hazırlanmış bir atlas görüntüsüyle hizalayın.

Bu bölgenin sınırlarını blok üzerinde işaretleyin.

Reçineyi yumuşatmak için ısıtın ve işaretli bölgeyi çıkarın.

Numuneyi bir cam tutma çubuğuna yapıştırın ve kesin.

Bir ultramikrotom kullanarak yarı ince ve ultra ince bölümler hazırlayın.

Yarı ince ve ultra ince bölümleri sırasıyla cam taşıyıcılara ve nikel ızgaralara aktarın.

Yarı ince bölümleri nükleik asitlere, ribozom açısından zengin sitoplazmaya ve hücre dışı matrise bağlanan bir boya ile boyayın.

Bölümleri yıkayın ve hedef alanın varlığını doğrulamak için ışık mikroskobu altında inceleyin.

Transmisyon elektron mikroskobu altında ultra ince kesitleri gözlemleyin.

Osmiyum tetroksit, hücresel ve organel zarlarının elektron yoğunluğunu arttırır, daha az elektron yoğun sitoplazmaya karşı yüksek kontrast sağlar ve hücresel üst yapının görselleştirilmesini sağlar.

Bir ilgi alanını eşlemek için, daha önce hazırlanmış görüntü atlasından ilgi alanını içeren bir görüntü seçin. İlgilenilen alanın kenarlıklarını bölümlere ayrılmış görüntünün üzerine çizin. Bu sınırları mikroskop altında gömülü numunenin üzerine optik olarak yerleştirin ve bu bölge kenarlıklarını reçine numunesi üzerine çizmek için bir inçlik 26 gauge iğne kullanın. Ardından, reçineyi yumuşatmak için numuneleri 95 santigrat dereceye ısıtın.

Daha sonra, ılık reçine örneklerini fırından çıkarın ve ilgi alanlarını çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Numuneleri uygun kalibreli akrilik cam tutma çubuklarına yapıştırın ve monte edilen numuneleri yarı ve ultra ince kesitler için kesin. Yarı ince 0.7 mikrometre ve ultra ince 70 nanometre kesitler elde etmek için bir ultramikrotom kullanın, yarı ince kesitleri cam taşıyıcılar üzerinde ve ultra ince kesitleri nikel ızgaralar üzerinde toplayın.

Yarı ince bölümleri PBS'de dört dakika boyunca% 1 toluidin mavisi ile boyayın, ardından bölümleri ışık mikroskobu ile incelemeden önce deiyonize suda birkaç yıkama yapın. Ultra ince kesitler daha sonra daha fazla değişiklik yapılmadan 180 kilovoltta transmisyon elektron mikroskobu ile doğrudan değerlendirilebilir.