Name: Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin kalın biyolojik örnekler için tarama transmisyon elektron tomografi hazırlama protokolünü. Bu yöntem, derinlik odak kurtarma ile üç boyutlu yeniden yapılandırma sağlar ve yapısal biyoloji araştırmalarına katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma iki ANR hibesi (ANR-11-BSV8-016 ve ANR-10-IDEX-0001-02) tarafından finanse edilmiştir. Ayrıca, kimyasal görüntüleme ekipmanlarına erişim sağladığı için PICT-IBiSA'ya da teşekkür ederiz.

Dikkat: kullanmadan önce çeşitli reaktif malzeme güvenliği veri sayfaları (MSDS) başvurun. Numune hazırlama sırasında kullanılan kimyasalların çeşitli ve / veya üreme için, toksik, kanserojen, mutajen bulunmaktadır. örnek işlerken davlumbaz altında kişisel koruyucu donanım (eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayak ayakkabılar) ve çalışmayı kullanma. Ultramikrotomla örnek kesit keskin aletlerin kullanımını gerektirir ve bu araçların dikkatli kullanılması zorunludur. Aşağıdaki açıklanan adımların, yazarlar örnek, bir hücre kültürü örneği olduğu varsayılmaktadır. Protokol örnek tipi, özellikle santrifüj adımlarına göre modifiye edilmesi gerekebilir. Tamponlar ve Karışımların hazırlanması 1. <ol><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4 ve 1.76 mM KH 2 PO 4). </li><li> % 30,% 50 ve% 70 et içeren çözümleri hazırlayınNumune dehidrasyon için PBS içinde HANOL. yavaş yavaş etanol konsantrasyonları artan inkübe edilmesiyle örnek dehidratasyon gerçekleştirin. </li><li> (Süksinik anhidrür (9 mL), metil-5-norbornen-2,3-dikarboksilik (11 ml) ve 2,4,6-tris dodesenil bisfenol-A- (epiklorohidrin) (20 mL) karıştırılarak epoksi reçine hazırlanması dimetilaminometil) fenol (0.7 mL); Diğer karışım oranları reçine arzu edilen sertliğine bağlı kullanılabilir. </li><li> Örnek yerleştirilmesi için etanol içinde% 30,% 50, ve% 70 epoksi reçine içeren çözeltiler hazırlayın. yavaş yavaş reçine artan konsantrasyonlarda ile inkübe edilmesiyle reçine katıştırma gerçekleştirin. NOT: Bu şekilde hazırlanan solüsyonlardan hacimleri incelenmiştir numune tipine bağlıdır. Daha çözeltileri hücre kültürleri için daha dokular için ihtiyaç vardır. </li></ol> Örnek 2. Fiksasyon ve Renklendirme <ol><li> x g 5,000 5 dakika boyunca hücre kültürü santrifüj. aynı koşullar kullanılarak, aşağıdaki santrifüj tümünü gerçekleştirebilir.</li><li> Süpernatant atılır ve% 4 paraformaldehid ve% 2 glutaraldehid ile, PBS (1 mL) içinde yeniden süspanse hücre pelletini düzeltin. 30 dakika (Şekil 1A), oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, bir gecede ya da hafta sonu 4 ° C&#39;de hücreleri saptamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak tespit edici maddeler uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (1 mL) içinde% 1 OsO 4 örnek sonrası düzeltin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak OsO 4 kaldırmak için, PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. Petrol ve ıskarta olarak OSO 4 devre dışı bırakın. </li><li> Bir kontrast maddesi olarak PBS (1 mL) içinde% 2&#39;lik üranil asetat ilave edilir ve oda sıcaklığında (Şekil 1B), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve bağlanmamış uranil ac uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kere yıkayınasetatın; uranil asetat radyoaktif elementler içerir ve radyoaktif atık adanmış bir bin atılmalıdır. Not: Örnek ölçülerine uygun bir bekleme süresi değiştirilebilir. örneğin tespit ve doku örnekleri gibi kalın örneklerde, boyama için, uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Daha uzun inkübasyon süreleri de dehidrasyon ve katıştırma adımlar için daha iyi olabilir. Uranil asetat Gadolinyum tuzlar içeren bir &quot;uranil-az&quot; bir çözüm ile değiştirilebilir. </li></ol> 3. Numune Dehidrasyon <ol><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve% 30 etanol ile PBS içinde 4 ° C&#39;de (1 mL) içinde (Şekil 1C), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> giderek artan etanol konsantrasyonları ile (% 50,% 70, ve% 100&#39;e kadar) çözümlerini kullanarak adımı tekrarlayın 3.1. Bu dehidrasyon adımları sırasında, numune saklama amaçlı 4 ° C &#39;de örnek muhafaza. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, supernat atmakAnt ve saf etanol (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; 4 ° C&#39;de bir gece inkübe edilir. </li></ol> 4. Reçine Gömme <ol><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve oda sıcaklığında (Şekil 1D) 30 dakika boyunca% 30 epoksi reçine (1 mL) ile etanol içinde pelletini. </li><li> giderek artan epoksi reçine konsantrasyonları ile çözümlerini kullanarak adımı yineleyin 4,1 (% 50,% 70, ve% 100&#39;e kadar). </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve saf epoksi reçinesi (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. reçine polimerizasyonu tetikleyebilir DMP-30 sertleşme varlığı; Bu olursa, epoksi reçine iki toplu, ile bir ve DMP-30 olmadan birini hazırlamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, saf epoksi reçinesi 200 uL plastik bir kapsül içinde (bir sertleştirici içeren) pelet tekrar süspansiyon; Numune plastik kapsül altında olmalıdır. </li></ol> 5. Reçine Polimerizasyon <ol><li> ben48 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ayarlanmış bir inkübatörde örneği içeren plastik kapsül ncubate; reçine diğer tür farklı ayarlarla polimerize olabilir. </li><li> inkübatör kapsülü çıkartın ve reçine polimerize olduğunu doğrulamak; Sert bir yüzeye bastırılır eğer reçine zor olmalı. </li><li> örnek içeren polimerize reçinenin üzerine (sertleştirici ihtiva eder) saf epoksi reçinesi ekleme; reçine bu ekstra katman daha kolay örnek kesmek için yapacaktır. 48 saat boyunca 60 ° C &#39;de kapsül inkübe edin. </li></ol> 6. Numune Kesit <ol><li> Numune üste doğru olacak şekilde numune tutucu örnek ters monte edin ve ultramicrotome kırpma blok üzerine sabitleyin. Sıkıca ultramicrotome için düzeltme bloğu sabitlemek için kolu kilitleyin. </li><li> Bir jilet veya benzeri keskin kesme aleti kullanılarak, polimerize reçine ayırmak için plastik kapsül kesip. örnek içeren böylece reçinenin kesinbir piramit yaklaşık şeklindeki reçine Ed. Tüm plastik kapsül kaldırmak için gerek yoktur; Sadece polimerize örnek kaplayan kısmını kaldırın. </li><li> kapsül ve kırpma blok kapalı numune tutucu alın ve ultramicrotome hareketli koluna monte edin. </li><li> bıçak blokta bir düzeltme bıçağı takın ve doğru bir piramit yüzleri kırpın. dürbün kullanımı piramit için mükemmel bir şekil vermek için tavsiye edilir; piramit daha iyi bölümler olacak. </li><li> kırpma bıçağı çıkar ve daha kalın 0.5 mikron olan bölümleri kesmek için kullanılabilecek bir histoloji bıçakla değiştirin. </li><li> uygun miktarda su ile histolojik bıçağının küvet doldurduktan sonra, numunenin yüzeyine bıçağın kesici kenar getirmek ve bıçak piramit dik dilim böylece kapsülün hatve açısını ayarlamak için dürbün kullanın. </li><li> İstenilen göre kesme hızını ayarlayınkesit kalınlığı homojen bölümleri kurtarmak için. </li><li> su üzerinde bölüm şamandıra edelim ve bir döngü ile balık. </li><li> filtre kağıdı üzerine yerleştirilmiş olan bir elektron mikroskobu bakır ızgara doğru döngü hareket ettirin. NOT: Izgara onun hydrophilicity artırmak için önceden tedavi edilmiş olması gerekirdi. Bu ızgara kaplama kalem ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Nedeniyle filtre kağıdı su emilimi, bölüm ızgara dönelim. Elektron mikroskobu yerleştirmeden önce birkaç dakika kurumaya bırakın. </li></ol> Through-odak Tilt-serisi 7. Tasarım <ol><li> sabit odak aralıklarla aracılığıyla odak görüntüleri toplayın. NOT: aracılığıyla odak tilt serisi tilt-serisi her eğim açısı toplanır aracılığıyla odak görüntülerin bir dizi oluşur. Bütün odaklama genliği, tüm numune kalınlığının karşılamak için yeterli olmalıdır. </li><li> Odak aralığı değerini belirler. aralığı d eşitseepth-of-field, odak tüm örnek toplamak; Bu ayar mümkün olan en yüksek örnekleme temsil eder. aralık derinliği alanında büyükse, numunenin bazı bölümleri numunenin bazı kısımları odak tahsil edilmeyecektir, yani odak elde edilmeyecektir. </li><li> derinliğini alan elektronun dalga boyu arasında bir elektron ışını ve elektron ışını yakınsama yarı açısı hesaplanır. Elektronların dalga boyu doğrudan ivme gerilimine bağlı iken, elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan yakınsama yarı açı kullanmak veya bilinen numune 16 kırınım deseninden deneysel olarak belirler. Elektronlar bir dalga boyu l hızlandırılmış Çünkü bir elektron mikroskobu a bir yakınsama yarı açı ile örnek vurmak, derinliği alanını (DOF) belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> dizaynBütün odak genlik maksimal belirgin kalınlıkta örnek kapsayacak şekilde odak serisi (yani en yüksek hızıyla). NOT: Odak genlik fazla 2.19 mikron olmalı böylece A 0,75 mikron kalınlığında numune, 70 ° hızıyla 2.19 mikron belirgin bir kalınlığa sahip olacak. Yukarıda belirlenen odak aralığı 50 nm&#39;ye eşit ise, bu örnek için, bu maksimum belirgin kalınlıkta örnek kapak 44 görüntü (2.19 um / 50 nm) gerektirecektir. Bütün odak genlik odak adım sayısı ile çarpılır odak aralığının değerine eşittir. En yüksek eğim (θ) &#39;de, örnek görülür kalınlığı şu şekilde tanımlanır: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. Örnek Görüntüleme NOT: KÖK modunda bir elektron mikroskobu kurmak için nasıl açıklamak için bu protokol kapsamı dışındadır; Bu bilgilerin çoğunu bulunabilir in referans el kitabı elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan. Ancak, aşağıdaki noktalara dikkat edin: i) spot büyüklüğü istenen büyütme göre seçilmelidir; ii) Ronchigram iyi hizada olmalıdır; ve iii) BF modunda, kamera uzunluğu dedektörün iyi aydınlatma korurken unscattered elektronları seçmek için ayarlanması gerekir. elektron mikroskobu bakır ızgaralar üzerinde biriken reçine bölümleri küçülmesini önlemek için görüntü alımı öncesinde ışıklı olmalıdır. Reçine büzülme ve şarj etkileri görüntü alımı sırasında eleştirilmiştir olabilir. Şarj etkiler ortaya çıktığında bir objektif lens açıklığı kullanımı örnek istikrarı geliştirmek olabilir. Ancak, KÖK kurulumları özelinde, objektif diyafram HAADF görüntüleme modu ile uyumlu değildir ve çok küçük objektif delikler BF görüntüleme modu ile uyumlu değildir. <ol><li> Düşük büyütme (STEM olarak 20,000X civarında) kullanılarak, numune göz atabilir ve ilgi bölgeyi bulun. </li><li> t ayarlayınörnek dönerken ilgi bölge sürüklenip kalmaması o yüksekliği (Z ekseni) eucentric. </li><li> ilgi nesnesi tüm eğim aralığı boyunca görünür kalacaktır emin olun. </li><li> Çünkü içinden odak tilt-serisi sırasında elde edilen görüntü önemli sayıda, otomatik toplama yazılımı kullanın. Ya bir ticari çözüm kullanmak ya da istenirse özel bir veri toplama yazılım tasarımı. yazılım programı üç aşağıdaki adımları gerçekleştirmek mümkün olduğundan emin olun: <ol><li> Parça ve standart eğim serisi toplama düzeni olarak odaklanır. </li><li> ile odak görüntüler numunenin Z-pozisyonunda örtüşüyor emin olun. </li><li> Otomatik olarak her eğim açısında aracılığıyla-fokal görüntüleri bir dizi kazanır. </li></ol></li><li> Yazılım programı aracılığıyla odak tilt-serisinin ana parametreleri vermek (yani, odak aralıkları, fokal adım, asgari eğim açısı, maksimum eğim açısı, eğim adım ve tarama hızı). </li><li> BaşlamaYazılım programı bitirmek için görüntü toplama süreci ve bekleyin. </li></ol> 9. Görüntü İşleme NOT: Bu protokol, through-fokal tilt serisi işleme ImageJ eklentileri 17 kullanılarak gerçekleştirilir. Ek Veriler 1 hizalama adım (Turboreg) ve üç odak değerleri ile tasarlanmış aracılığıyla odak tilt-serisi için de odak bilgisini (Alan Genişletilmiş Derinliği) birleştirmek için bir ImageJ makro gösterir. <ol><li> Aynı eğim açısı (yani yoluyla-odak görüntüler) toplanan görüntüleri hizalayın. görüntüler aynı olarak odak bilgiye sahip olmadığı için, onlar uyum için aynı özellikleri liman yok; komşu görüntüleri ikişer ikişer hizalayarak hizalama işlemini (yani, ilk yakın odak değerleri ile bir piramidal hiyerarşi, aşağıdaki) Turboreg 18, bir ImageJ eklentisi kullanarak. </li><li> Sürekli her eğim açısında aracılığıyla odak görüntülerin uyum doğrulayın.görsel denetim geliştirmek için hizalanmış aracılığıyla odak görüntüleri Stack. NOT: yığının üzerinden tarama yaparken sadece bölge odakta hareket etmelidir. Bir sonraki adım, farklı görüntüleri odak bilgilerin geri kazanımı oluşur çünkü doğru hizalama, en önemli şeydir. </li><li> Alan 19, bir ImageJ eklentisi Genişletilmiş derinliği kullanarak odakta olan bilgileri birleştirmek; Bu sonuçta görüntüleri yığından tek bir görüntü oluşturur. Çeşitli ayarlar derinliği alanında kurtarma sırasında kullanılan, ancak görüntü bilgilerini korumak için en yüksek ayarlarını kullanmak olabilir. NOT: tilt-serisi şimdi eğim açısı başına tek bir görüntü oluşur, içinde odak bilgilerini içeren her bir görüntü ile odak görüntüleri kurtarıldı. </li><li> veri işlemek. NOT: Veri artık standart eğim serisi azaltılmış beri uyum ve yeniden inşası için standart araçlar kullanılabilir. Bu protokolde, TomoJ bizized veri hizalama ve veri yeniden 20, 21. TomoJ nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla detay orijinal yayın 22 bulunabilir. </li><li> tilt-serisi ince ayarı gerçekleştirin. NOT: İyi bir strateji doğru görüntüler arasında vardiya izlemek için referans belirteç olarak altın boncuk kullanmaktır. altın boncuk örnek eklenemez halinde, yerel minimum de kullanılabilir. </li><li> hizalanmış verilerin 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin; çeşitli algoritmalar gerçek uzayda veya Fourier uzayında, avantaj ve sınırlamaları ile her rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir. </li><li> tilt-serisi son hizalama kötüyse, ilk adımları optimize ederek bazı iyileştirmeler yapmak. Nihai 3D rekonstrüksiyon bulanık ya da deforme görünüyorsa hizalama adımlarını yinelemek; Uygulamada, toplanan odak düzlemleri daha fazla sayıda, daha iyi kontrast ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon ayrıntıları. NOT: SeVeral yazılım programları aracılığıyla odak tilt-serisi işlemek için kullanılabilir. Ancak, bu protokolde kullanılan araçlar seçildi çünkü, bizim deneyim, onlar en iyi performansı. Turboreg 18 odak gradyanı mevcut olduğu zaman görüntüleri hizalama açısından iyi performans gösterdi. Daha fazla bilgi adanmış web sitesinde 23 bulunabilir. Diğer araçlar görünür piksel değişiklikler sonuçlandı oysa Alan eklentisi 19 Genişletilmiş Derinlik, farklı görüntüleri de-odak bilgileri kurtarma açısından çok iyi bir performans. Daha fazla bilgi, özellikle ilgili senaryo yazma, bu adanmış web sitesinde 24 bulunabilir. </li></ol>

<ol><li>De Rosier, D. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+three+dimensional+structures+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs.</a> Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2491709/">Electron tomography of cells.</a> Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).</li>
<li>Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).</li>
<li>Koguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+STEM+for+observing+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional STEM for observing nanostructures.</a> J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).</li>
<li>Midgley, P. A., Weyland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+electron+microscopy+in+the+physical+sciences%3A+the+development+of+Z-contrast+and+EFTEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).</li>
<li>Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+electron+tomography+of+biological+specimens%3A+Extending+the+limits+of+specimen+thickness+with+bright-field+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging.</a> J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).</li>
<li>Sousa, A. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+STEM+for+the+biological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Development and application of STEM for the biological sciences.</a> Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).</li>
<li>Ercius, P., Muller, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/239633484_Incoherent_Bright_Field_STEM_for_Imaging_and_Tomography_of_Ultra-Thick_TEM_Cross-sections">Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections.</a> Microsc Microanal. 15, (2009).</li>
<li>Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+spreading+and+spatial+resolution+in+thick+organic+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">STEM tomography for thick biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition--a+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Hovden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Crowther+limit%3A+combining+depth-sectioning+and+tilt+tomography+for+high-resolution%2C+wide-field+3D+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions.</a> Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+transmission+electron+microscopy+tilt-+and+focal+series%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series.</a> Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Weyland, M., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://muller.research.engineering.cornell.edu/sites/WEELS/summer06/FEI%20nanoSolutions%20Muller.pdf">Tuning the convergence angle for optimum STEM performance.</a> FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+wavelets+for+extended+depth-of-field%3A+a+new+method+for+the+fusion+of+multichannel+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images.</a> Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).</li>
<li>Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+image+registration+of+electron+tomography+tilt-series%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Marker-free image registration of electron tomography tilt-series.</a> BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).</li>
<li>Messaoudi, C. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ">http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ</a> (2016).</li>
<li>Thevenaz, P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg ">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg </a> (2016).</li>
<li>Forster, B. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/">http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/</a> (2016).</li>
<li>Kohl, L., Bastin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+of+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The flagellum of trypanosomes.</a> Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).</li>
<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+Transmission+Electron+Microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ettention+software+package%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li>
<li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041(2016).</li>
</ol>

Açıklayacak herhangi bir çıkar çatışmamız yok.

Bu makalede, biz aracılığıyla odak tomografi STEM kullanarak kalın biyolojik örnekler üzerinde 3D analizlerini gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuz ile birlikte geleneksel numune hazırlama protokol mevcut. Biyolojik örneklerin reçine gömme yıllardır 26 için kullanılır olmuştur, ve örneklerin farklı uyarlanmış alternatif protokoller literatürde 27 boyunca bulunabilir. Bunun aksine, STEM görüntüleme kalınlıkta numuneler yeni bir teşebbüse odak-boyunca yöntemleri kullan...

1970&#39;lerin başından beri, tomografi yaygın biyolojik örneklerin 1, 2, 3 yapısal karakterizasyonu için kullanılmıştır transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yaklaşımları. Transmisyon elektron tomografi Temyizinizi hücre mimarisi ve makromoleküler kompleksler ve proteinlerin yapı organellerin ultrastrüktürü arasında, nanometre ölçeğinde biyolojik yapıların geniş bir çalışma için kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, elektron tomografisi çok kalın örnekleri (daha büyük 0,5 um) incelemek için kullanılabilir olabilir. Nitekim, kalın örnekleri düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) görüntüler oluşturmak, çok dağınık elektronlar üretir. Buna ek olarak, tomografi eğim açısı ile artan numunenin belirgin kalınlıkta, eğimli örneklerin görüntüleri koleksiyonu içerir. Hatta inelastik saçılma filtre edilebilir olsa daEnerji filtreleri kullanarak, yüksek SNR görüntüler için gerekli elektron kritik miktarı ancak TEM ulaşılır. Bu nedenle, kalın biyolojik örnekler sadece 4 kesit kullanılarak incelenmiştir. onlar kesilir bazı düşürebilir, ve diğerleri kendi karmaşıklığını anlamak için kendi bütünlüğü içinde çalışılması gereken: Bazı numuneler dilimlenmiş edilemez. Alternatif bir yaklaşım, tarama modu 5, 6, 7, 8 TEM kullanmaktır. transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tarayarak olarak, elektronların optik yol, geleneksel TEM farklıdır. Elastik dağılmış olan koyu alan (DF) detektörü ile optik eksenden belirli bir açı ile toplanabilir ise saçılma olmadan örnek geçen elektronlar, parlak-alan (BF) detektörü 9 optik eksen üzerinde toplanabilir.KÖK diğer avantajı odaklanmış bir elektron ışını görüntüleri piksel-piksel toplama sağlayan numunenin yüzeyi taranır olmasıdır. Numune 10 geçerken elektron ışını genişletir olsa da, bu özel koleksiyon düzeni geleneksel TEM daha esnek olmayan dağınık elektron daha az duyarlıdır. Ayrıca, bu suretle TEM oluşabilir kromatik sapmaları kaçınarak STEM hiçbir objektif sonrası numune vardır. BF detektörü esas unscattered elektronlar algılaması için Kamera boyu ayarlanabilir. Kalın örnekleri incelemek için DF dedektörü kullanılarak, çünkü yanlış görüntüler üretir çoklu saçılma, tavsiye edilmez. Bunun yerine, BF detektörü 11 kullanılabilir. KÖK yüksek SNR görüntüler üretmek mümkün olmakla birlikte, kalın elde edilebilir derinlemesine bilgi miktarını azaltarak, çünkü TEM kıyasla nispeten yüksek ışın yakınsama nispeten düşük derinliği-of-field vardırnumuneler. odakta bilgi sadece birkaç nanometre bir odak düzlemi kaynaklanan şekilde yakınsama açısı 30 Mrad kadar yüksek olabilir sapmaları düzeltilmiş KÖK mikroskobu, durumunda, derinliği alanı kadar düşük olabilir . Paralel mod elektron ışını ayarlama derinliğini alan elektron ışınının çözünürlüğü 12 zararına artırır. Bununla birlikte, bu kurulum her zaman mümkün değildir. Bir yakınsak elektron demeti kullanımı için gerekli olan zaman, tek bir kalın örnekleri incelenirken derinliğini alan elektron ışını arttırmak teknikleri kullanmak gerekir. Son çalışmalar içinde odak bilgileri 13, 14 maksimum miktarda kurtarmak için numune boyunca çeşitli odak düzlemleri birden fazla görüntü alımını bildirdi. İki çalışmalar, farklı odak düzlemleri bilgi işlemek için farklı yolları açıklanmaktadır. Hovden ve diğ.Çeşitli odak düzlemleri toplanmıştır görüntüleri Fourier uzayında birleştirildi ve nihai imar 13 dönüşümü 3D ters Fourier doğrudan elde edilmiştir. Bunun aksine, Dahmen ve ark. Gerçek uzayda çeşitli odak düzlemleri 14 3D hacmini yeniden bir yakınsak ışın yeniden motorunu geliştirdi. Laboratuvarımız ayrıca kalın biyolojik örneklerin görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Bizim stratejimiz, biz çeşitli odak düzlemleri içinde odak olan bilgileri birleşti ve bir paralel ışın projektörü 15 kullanarak gerçek uzayda son 3D hacmini yeniden ki yukarıda anlatılan iki yöntemden farklı oldu. Amacımız, kolaylıkla bir elektron mikroskobu laboratuarda yapılabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, geleneksel tomografi deneylerin zaman çerçevesi ile karşılaştırılabilir zaman sınırlı bir miktarda, odak görüntüleri toplamak amaçlanmıştır. Ayrıca, önerilen yöntem chizalama ve yeniden yazılım farklı tipleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir ould. 2015 15 bizim yayın bağlamda, görselleştirmek ve derinliği alanının kurtarma karakterize etmek istedim, bu yüzden biz 25 mrad büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. Burada, 2015 yılında 15 laboratuvarda geliştirilen yönteme göre STEM yoluyla odak görüntüleme gerçekleştirmek için bir adım-adım protokolü mevcut ve biz 2015 verileri işlendi nasıl sunuyoruz. Bu yöntem kalın (750 nm) biyolojik numune boyunca birçok odak düzlemleri gelen odak bilgileri kurtarır ve yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon sağlar. Uygun durumlarda, diğer gruplar tarafından kullanılan yöntemlerden karşı bu metodoloji farklılıklar da sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Salamin Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Yaklaşık 60 ° C. 'de ısıtılan PBS'ye paraformaldehit tozu ekleyin PFA tozu görünmeyene kadar 1 N NaOH ekleyerek pH'ı artırın.</td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin Kapsül</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Kırpma ve Histo bıçakları</td><td>LFG Dağıtım</td><td>Diatom elmas bıçaklar</td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu bakır ızgara</td><td>LFG Dağıtım</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Izgara Kaplama Kalemi</td><td>LFG Dağıtım</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Numune Tutucu</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

tarama transmisyon elektron tomografi ile hazırlanması ve kalın biyolojik Örneklerinin gözlem

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Bu rapor, bir taramalı transmisyon elektron mikroskobu kullanarak daha fazla gözlem için kalın biyolojik örneklerin hazırlanmasına yönelik bir protokolü açıklar. Ayrıca, transmisyon elektron tomografisini tarayarak kalın biyolojik örneklerin 3D yapısını incelemek için bir görüntüleme yöntemini de açıklar. Numune hazırlama protokolü, numunenin kimyasal ajanlar kullanılarak sabitlendiği, ağır atom tuzu kontrast yapıcı bir ajan ile muamele edildiği, bir dizi etanol banyosunda dehidre edildiği ve reçineye gömüldüğü geleneksel yöntemlere dayanmaktadır. Transmisyon elektron mikroskobu taranarak kalın numuneleri gözlemlemek için özel görüntüleme koşulları daha sonra açıklanır. Numunenin bölümleri, çeşitli odak düzlemlerinde birkaç görüntünün toplanmasını içeren bir odak yöntemi kullanılarak gözlemlenir. Bu, numune boyunca çeşitli yüksekliklerde odak içi bilgilerin kurtarılmasını sağlar. Bu özel toplama modeli, tomografi verilerinin toplanması sırasında her eğim açısında gerçekleştirilir. Ardından, tüm farklı odak düzlemlerinden gelen odak içi bilgileri birleştiren tek bir görüntü oluşturulur. Daha sonra klasik bir eğim serisi veri kümesi oluşturulur. Yöntemin avantajı, eğim serisi hizalama ve rekonstrüksiyonun standart aletler kullanılarak gerçekleştirilebilmesidir. Odak içi görüntülerin toplanması, odaktaki numunenin tüm yapısal ayrıntılarını içeren bir 3D hacmin yeniden yapılandırılmasına olanak tanır.

Bizim çalışmamızda, elektronlar alan emisyon silah transmisyon elektron mikroskobu 200 kV hız verilmiştir. Görüntüler 20 uS bekleme süresi kullanılarak KÖK BF modunda toplanmıştır. ile odak tilt-serisinin tasarımı ile ilgili olarak, biz bir 750 nm kalınlığında biyolojik numune bile elektron ışınının derinliği alan olmasına rağmen sadece ultrastrüktürel çalışma için tatmin edici sonuçlar verdi nm 150 o odak aralıkları bulundu 3 nm beri 25 mrad çok büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. ...

Bu rapor, kalın biyolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron tomografisini gerçekleştirmek için bir numune hazırlama protokolünü ve özel görüntüleme koşullarını açıklar.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Bu prosedürün genel amacı, yakınsak ışın taramalı transmisyon elektron tomografisi kullanılarak kalın bir biyolojik numunenin alan derinliği geri kazanımı ile üç boyutlu bir rekonstrüksiyon elde etmektir. Bu yöntem, yapısal biyoloji alanında kalın biyolojik örneklerin elektron tomografisi ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, görüntülerin yakınsak bit modunda elde edilebilmesi ve veri işlemenin tomografiye adanmış çoğu yazılımda gerçekleştirilebilmesidir.Hücre kültürü numunesini hazırlamaya başlamak için, numuneyi 5000 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Numune hazırlama boyunca bu santrifüj parametrelerini kullanın. Süpernatanı atın ve hücreleri% 4 paraformaldehit ve% 2 gluteraldehit ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Süspansiyonu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Karışımı santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Aynı inkübasyon koşullarını ve yıkama prosedürünü kullanarak, peleti% 1 osmiyum tetroksit ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de ve% 2 uranil asetat ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de inkübe edin.Ardından, numuneyi dört santigrat dereceye kadar soğutun. Giderek daha konsantre etanol çözeltilerinde ardışık inkübasyonlarla peleti kurutun. İnkübasyon, santrifüjleme ve yıkama boyunca numune sıcaklığının dört santigrat derece olarak korunması.Susuz peleti bir mililitre saf etanol içinde yeniden süspanse edin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin ve numuneyi santrifüjleyin. Peletleri oda sıcaklığında giderek daha konsantre epoksi reçine çözeltileri içinde inkübe edin.Son yıkamadan sonra, peleti bir mililitre saf epoksi reçine içinde tekrar süspanse edin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın ve ardından peleti 200 mikrolitre epoksi reçine ve sertleştirici içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu kapsülün içine aktarın.Reçineyi polimerize etmek için plastik kapsülü 60 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. Kapsülü inkübatörden çıkarın ve reçine polimerizasyonunu doğrulayın. Gömülü numunenin üzerine bir epoksi reçine ve sertleştirici tabakası ekleyin ve kapsülü aynı koşullar altında tekrar inkübe edin.Reçineye gömülü numuneyi baş aşağı bir numune tutucuya monte edin. Numuneyi bir ultramikrotomun düzeltme bloğuna güvenli bir şekilde sabitleyin. Plastik kapsülü reçinedeki numuneden kesin.Açıkta kalan reçineyi bir piramit şeklinde şekillendirin. Daha sonra kapsülü ve numune tutucuyu ultramikrotomun hareketli koluna aktarın. Bir kırpma bıçağı takın ve bir mikroskop tarafından yönlendirilen piramit şeklini düzeltin.Düzeltme bıçağını bir histoloji bıçağıyla değiştirin. Mikroskop altında, kapsül eğim açısını, piramit bıçak kenarına dik olacak şekilde ayarlayın. Kesme hızını ayarlayın ve numuneyi bölümlere ayırın.Numuneyi bölümlere ayırdıktan sonra, seçilen bölümü filtre kağıdı üzerinden işlenmiş bir bakır ızgaraya aktarın. Numunenin kurumasını bekleyin ve ardından numuneyi elektron mikroskobuna yükleyin. Odak eğimi serisini tasarlamak için önce elektron ışını alan derinliğini ve numunenin maksimum görünür kalınlığını hesaplayın.Bu değerlere dayanarak, bir odak aralığı seçin ve numunenin tamamını maksimum görünür kalınlıkta görüntülemek için gereken odak adımlarının sayısını belirleyin. Ardından, düşük büyütme oranında, numune içindeki ilgilenilen bölgeyi bulun. Ötesantrik yüksekliği, numune döndürüldüğünde ROI hareket ediyormuş gibi görünmeyecek şekilde ayarlayın.ROI'nin eğim aralığı boyunca görünür kaldığını doğrulayın. Otomatik görüntü toplama için odak eğimi serisi parametrelerini doldurun ve görüntüleri alın. Görüntü serisini bir görüntü işleme programına aktarın ve aynı eğim açısında toplanan görüntüleri piramidal bir hiyerarşide hizalayın.Hizalanmış görüntüleri üst üste koyarak her eğim açısında hizalamayı bulun. Görüntüden görüntüye yalnızca odaklanılan bölgenin hareket ettiğinden emin olmak için yığına göz atın ve görüntüleri gerektiği gibi yeniden hizalayın. Örnek boyunca hizalama doğrulandıktan sonra, eğim açısı başına tek bir görüntü elde etmek için odak bilgilerini yüksek ayarlarda birleştirin.Yerel minimuma veya referans işaretleyicilere dayalı olarak eğim serisinin bul hizalamasını gerçekleştirin. 3 boyutlu bir rekonstrüksiyon gerçekleştirin ve ortaya çıkan görüntüyü inceleyin. Rekonstrüksiyon bulanık veya deforme görünüyorsa, orijinal görüntü serisini yeniden hizalayın.Bir T. brucei örneği bu yöntem kullanılarak görüntülendi ve analiz edildi. Sıfır derece eğim açısında, kamçı cebinin birkaç detayı görülebilir.70 derecelik daha yüksek eğim açısında, odak serisinde toplanan her görüntünün yalnızca bir kısmı odaktadır. Bu konum seri boyunca değişir. Odak içi bölümler birleştirilerek, daha büyük bir odak içi alana sahip tek bir görüntü üretilir.Bu etki, odak eğimi serisinin yüksek frekans alanları vurgulandığında daha da belirgindir. Yüksek frekans bilgisi, birleştirilmiş görüntünün çoğunu kapsar ve bu da odak eğimi serisinin iyi işlendiğini gösterir. Mastering yapıldıktan sonra, görüntü işleme kısmı, seçilen hizalama ve yeniden yapılandırma parametrelerine bağlı olarak yaklaşık üç ila dört saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, son rekonstrüksiyonun kalitesinin büyük ölçüde önceki hizalama testlerinin kalitesine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, odak üzerinden eğilme serisinin koleksiyonunu ve görüntü işlemesini nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Öğrenin kalın biyolojik örnekler için tarama transmisyon elektron tomografi hazırlama protokolünü. Bu yöntem, derinlik odak kurtarma ile üç boyutlu yeniden yapılandırma sağlar ve yapısal biyoloji araştırmalarına katkıda bulunur.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Daha fazla video keşfet