Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Bu prosedürün genel amacı, yakınsak ışın taramalı transmisyon elektron tomografisi kullanılarak kalın bir biyolojik numunenin alan derinliği geri kazanımı ile üç boyutlu bir rekonstrüksiyon elde etmektir. Bu yöntem, yapısal biyoloji alanında kalın biyolojik örneklerin elektron tomografisi ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, görüntülerin yakınsak bit modunda elde edilebilmesi ve veri işlemenin tomografiye adanmış çoğu yazılımda gerçekleştirilebilmesidir.

Hücre kültürü numunesini hazırlamaya başlamak için, numuneyi 5000 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Numune hazırlama boyunca bu santrifüj parametrelerini kullanın. Süpernatanı atın ve hücreleri% 4 paraformaldehit ve% 2 gluteraldehit ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Karışımı santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Aynı inkübasyon koşullarını ve yıkama prosedürünü kullanarak, peleti% 1 osmiyum tetroksit ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de ve% 2 uranil asetat ile zenginleştirilmiş bir mililitre PBS'de inkübe edin.

Ardından, numuneyi dört santigrat dereceye kadar soğutun. Giderek daha konsantre etanol çözeltilerinde ardışık inkübasyonlarla peleti kurutun. İnkübasyon, santrifüjleme ve yıkama boyunca numune sıcaklığının dört santigrat derece olarak korunması.

Susuz peleti bir mililitre saf etanol içinde yeniden süspanse edin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin ve numuneyi santrifüjleyin. Peletleri oda sıcaklığında giderek daha konsantre epoksi reçine çözeltileri içinde inkübe edin.

Son yıkamadan sonra, peleti bir mililitre saf epoksi reçine içinde tekrar süspanse edin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın ve ardından peleti 200 mikrolitre epoksi reçine ve sertleştirici içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu kapsülün içine aktarın.

Reçineyi polimerize etmek için plastik kapsülü 60 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. Kapsülü inkübatörden çıkarın ve reçine polimerizasyonunu doğrulayın. Gömülü numunenin üzerine bir epoksi reçine ve sertleştirici tabakası ekleyin ve kapsülü aynı koşullar altında tekrar inkübe edin.

Reçineye gömülü numuneyi baş aşağı bir numune tutucuya monte edin. Numuneyi bir ultramikrotomun düzeltme bloğuna güvenli bir şekilde sabitleyin. Plastik kapsülü reçinedeki numuneden kesin.

Açıkta kalan reçineyi bir piramit şeklinde şekillendirin. Daha sonra kapsülü ve numune tutucuyu ultramikrotomun hareketli koluna aktarın. Bir kırpma bıçağı takın ve bir mikroskop tarafından yönlendirilen piramit şeklini düzeltin.

Düzeltme bıçağını bir histoloji bıçağıyla değiştirin. Mikroskop altında, kapsül eğim açısını, piramit bıçak kenarına dik olacak şekilde ayarlayın. Kesme hızını ayarlayın ve numuneyi bölümlere ayırın.

Numuneyi bölümlere ayırdıktan sonra, seçilen bölümü filtre kağıdı üzerinden işlenmiş bir bakır ızgaraya aktarın. Numunenin kurumasını bekleyin ve ardından numuneyi elektron mikroskobuna yükleyin. Odak eğimi serisini tasarlamak için önce elektron ışını alan derinliğini ve numunenin maksimum görünür kalınlığını hesaplayın.

Bu değerlere dayanarak, bir odak aralığı seçin ve numunenin tamamını maksimum görünür kalınlıkta görüntülemek için gereken odak adımlarının sayısını belirleyin. Ardından, düşük büyütme oranında, numune içindeki ilgilenilen bölgeyi bulun. Ötesantrik yüksekliği, numune döndürüldüğünde ROI hareket ediyormuş gibi görünmeyecek şekilde ayarlayın.

ROI'nin eğim aralığı boyunca görünür kaldığını doğrulayın. Otomatik görüntü toplama için odak eğimi serisi parametrelerini doldurun ve görüntüleri alın. Görüntü serisini bir görüntü işleme programına aktarın ve aynı eğim açısında toplanan görüntüleri piramidal bir hiyerarşide hizalayın.

Hizalanmış görüntüleri üst üste koyarak her eğim açısında hizalamayı bulun. Görüntüden görüntüye yalnızca odaklanılan bölgenin hareket ettiğinden emin olmak için yığına göz atın ve görüntüleri gerektiği gibi yeniden hizalayın. Örnek boyunca hizalama doğrulandıktan sonra, eğim açısı başına tek bir görüntü elde etmek için odak bilgilerini yüksek ayarlarda birleştirin.

Yerel minimuma veya referans işaretleyicilere dayalı olarak eğim serisinin bul hizalamasını gerçekleştirin. 3 boyutlu bir rekonstrüksiyon gerçekleştirin ve ortaya çıkan görüntüyü inceleyin. Rekonstrüksiyon bulanık veya deforme görünüyorsa, orijinal görüntü serisini yeniden hizalayın.

Bir T. brucei örneği bu yöntem kullanılarak görüntülendi ve analiz edildi. Sıfır derece eğim açısında, kamçı cebinin birkaç detayı görülebilir.

70 derecelik daha yüksek eğim açısında, odak serisinde toplanan her görüntünün yalnızca bir kısmı odaktadır. Bu konum seri boyunca değişir. Odak içi bölümler birleştirilerek, daha büyük bir odak içi alana sahip tek bir görüntü üretilir.

Bu etki, odak eğimi serisinin yüksek frekans alanları vurgulandığında daha da belirgindir. Yüksek frekans bilgisi, birleştirilmiş görüntünün çoğunu kapsar ve bu da odak eğimi serisinin iyi işlendiğini gösterir. Mastering yapıldıktan sonra, görüntü işleme kısmı, seçilen hizalama ve yeniden yapılandırma parametrelerine bağlı olarak yaklaşık üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, son rekonstrüksiyonun kalitesinin büyük ölçüde önceki hizalama testlerinin kalitesine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, odak üzerinden eğilme serisinin koleksiyonunu ve görüntü işlemesini nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.