Konfokal mikroskopi kullanılarak fare nöral kök hücre bölünmesinin hızlandırılmış görüntülenmesi

Transgenik bir fare beyninden izole edilmiş yapışık nöral kök hücreler veya NSC'ler içeren çok kuyulu bir plaka alın. Bu NSC'ler, ilk büyüme veya G1 fazına özgü floresan etiketli bir protein içerir.

NSC bölündükçe, hücre döngüsünün G1 fazında floresan yayılırken, diğer fazlarda floresan yaymaz.

Plakayı, kontrollü bir sıcaklıkta tutulan konfokal bir lazer taramalı mikroskop görüntüleme odasına yerleştirin.

İstediğiniz objektif lensi seçin ve floresan yoğunluğunu ayarlayın.

Zaman atlamalı görüntüleme için parametreleri yapılandırın.

Büyük görüntü seçeneğini belirleyin ve istenen süre için düzenli aralıklarla görüntü alımını planlayın.

Foto ağartmayı önlemek ve yüksek çözünürlüğü korumak için yüksek hızlı bir rezonans tarayıcı kullanın.

Hücre şeklini görselleştirmek için parlak alan ayarını kullanın ve floresansı yakalamak için uygun bir floresan filtresi kullanın.

Farklı hücre döngüsü aşamalarını görselleştirmek için NSC'nin hızlandırılmış görüntülemesini başlatın.

Bağlı sıcaklık kontrol odasını %5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtarak görüntüleme için konfokal bir lazer tarama mikroskobu hazırlayın. 96 oyuklu plakayı önceden ısıtılmış mikroskop odasının içine yerleştirin ve ilk kuyuyu odağa getirin. Ardından, görüntüleme yazılımını açın ve ana pencereye sağ tıklayarak Edinme Kontrollerini ve Edinmeyi Kaldırma'yı seçmek için TI Pad'i açın ve Apo VC 20x DIC hedefi planını seçin.

Ardından, Edinme Kontrollerini Al'a tıklayın ve ardından hızlandırılmış çekim seçeneklerini açın. Her bir bölmenin merkezini bir sahne konumu olarak ayarlayın ve Büyük Resim seçeneğini 7 x 7 milimetre kare olarak seçin. Her kuyunun merkezinde bir mozaik görüntü gözlemleyin. Büyük mozaik görüntünün üst üste binmesini %5'e ayarlayın ve sıklığı, resimlerin 24 saat boyunca her 20 dakikada bir çekileceği şekilde ayarlayın.

A1 plus ayarları altında, menü çubuğunda listelenen her floresan için fotoçoğaltıcı tüp voltaj seviyesini seçin. 512 x 512 piksel biçiminde yüksek hızlı rezonans tarayıcı kullanarak görüntü elde etmek için seçin ve hücreleri görselleştirmek için DIC kullanın. Ardından, veri dosyalarının kaydedileceği klasörü seçin. Alıma başlamak için ND alım penceresindeki Şimdi Çalıştır düğmesini seçin.