JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:21 dk • June 17th, 2025
Fare embriyonik kortikal nöronlarını içeren cam tabanlı bir görüntüleme kabı alın.
Görüntüleme sırasında hücre canlılığını korumak için çanağı bir diferansiyel girişim kontrastı veya DIC mikroskobunun çevre odasının içine yerleştirin.
DIC mikroskobu, polarize ışığı numuneyi geçen iki ışına böler.
Numune boyunca kırılma indisindeki değişiklikler, bu ışınlar arasında faz kaymalarına neden olur.
Işınlar yeniden birleştiğinde, girişimleri yüksek kontrastlı bir görüntü oluşturarak daha ince hücresel yapıları görünür hale getirir.
Dallanmamış aksonları olan nöronları tanımlayın ve aksonal dallanmayı görselleştirmek için hızlandırılmış görüntülemeyi kullanın.
Aksonal reseptörlere bağlanan ve lokalize ekzositozu tetikleyen hücre dışı bir rehberlik işareti olan netrin-1 ile tedavi edin.
Ekzositik veziküller, zar genişlemesini desteklemek için hücre iskeleti yeniden düzenlenirken, bölgelere zar bileşenleri sağlar.
Mikroskop altında, bu değişiklikler aksonal dallanmanın başlangıcını işaret eden küçük çıkıntılar olarak görünür.
Zamanla, bu çıkıntılar olgun aksonal dallara dönüşür ve bu da nöronal gelişimin dinamik sürecini gösterir.
İki gün in vitro olarak, transfekte edilmemiş nöronları içeren cam tabanlı görüntüleme kabını önceden ısıtılmış nemli bir çevre odasına yerleştirin. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlüğü için 60x plan apokromat, 1.4 NA, DIC objektif lensi ve yüksek sayısal açıklıklı kondansatör ile donatılmış bir mikroskop kullanın. Daha sonra, iletilen ışık aydınlatması ile, oküler aracılığıyla nöronları bulmak için odak düzlemini ayarlayın.
Akson dallanmasının DIC görüntülemesi için, soğuk aydınlatmanın uygun şekilde ayarlanması, görüntü optimizasyonu için ayrılmaz bir unsur olacaktır ve analiz edilebilir sonuçlar üretmek için kritik öneme sahiptir. Ardından, ilgilenilen nöronlar görüş alanı içindeyken, en az altı hücrenin XYZ konumlarını bulmak ve kaydetmek için görüntüleme yazılımındaki çok alanlı toplama işlevini kullanın. Şimdi, hücreleri uyarmak için mililitre başına 250 nanogram netrin-1 veya başka bir ilgi faktörü konsantrasyonuna ekleyin ve Çok Alanlı Edinimi Başlat'a basın.
Sırayla, 24 saat boyunca her 20 saniyede bir her konumda görüntü alın, alımı duraklatın ve gerektiğinde yeniden odaklanın. Görüntüleme yazılımı içinde, Uygulama'yı seçerek görüntüleri inceleyin, Çok Boyutlu Verileri Gözden Geçirin, ve istediğiniz dosyayı açın. Görüntüleme seansı sırasında oluşan kararlı akson dallarını tanımlayın. Aksonun tabanından ucuna kadar kararlı bir akson dalını ölçmek için izleme bölgesi aracını kullanın.
Bu makale, fare embriyonik kortikal nöronlarda gerçek zamanlı aksonal dallanmayı incelemek için diferansiyel interferans kontrast (DIC) mikroskopisi kullanan bir canlı görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Protokol, bir yönlendirici sinyal olan netrin-1'in, lokalize ekzositozu ve hücre iskeleti yeniden düzenlenmelerini nasıl tetiklediğini, bunun da membran çıkıntılarına ve olgun aksonal dalların oluşumuna nasıl yol açtığını vurgulamaktadır. Metodoloji, nöronal morfogenezin temelindeki dinamik süreçlere dair değerli bilgiler sağlamaktadır.
Fare kortikal nöronlarında aksonal dallanmanın gerçek zamanlı in vitro görüntülemesi, nöronal morfogenezi ve membran trafiğini sorgulamak için kantitatif bir platform sağlar. Bu yaklaşım, netrin-1 gibi hücre dışı sinyallerin aksonal mimari üzerindeki etkilerini doğrudan görselleştirerek, nörogelişimsel hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasına olanak tanır. Bu metodoloji, nörobiyoloji odaklı portföyler için erken keşif ve hedef doğrulamada öngörülebilir bir güven sağlar.
Bu canlı görüntüleme yöntemi, nörobiyoloji programlarında erken hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olmaktadır.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026