Fare Kortikal Nöronlarında Aksonal Dallanmanın Gerçek Zamanlı İn Vitro Görüntülenmesi

Fare embriyonik kortikal nöronlarını içeren cam tabanlı bir görüntüleme kabı alın.

Görüntüleme sırasında hücre canlılığını korumak için çanağı bir diferansiyel girişim kontrastı veya DIC mikroskobunun çevre odasının içine yerleştirin.

DIC mikroskobu, polarize ışığı numuneyi geçen iki ışına böler.

Numune boyunca kırılma indisindeki değişiklikler, bu ışınlar arasında faz kaymalarına neden olur.

Işınlar yeniden birleştiğinde, girişimleri yüksek kontrastlı bir görüntü oluşturarak daha ince hücresel yapıları görünür hale getirir.

Dallanmamış aksonları olan nöronları tanımlayın ve aksonal dallanmayı görselleştirmek için hızlandırılmış görüntülemeyi kullanın.

Aksonal reseptörlere bağlanan ve lokalize ekzositozu tetikleyen hücre dışı bir rehberlik işareti olan netrin-1 ile tedavi edin.

Ekzositik veziküller, zar genişlemesini desteklemek için hücre iskeleti yeniden düzenlenirken, bölgelere zar bileşenleri sağlar.

Mikroskop altında, bu değişiklikler aksonal dallanmanın başlangıcını işaret eden küçük çıkıntılar olarak görünür.

Zamanla, bu çıkıntılar olgun aksonal dallara dönüşür ve bu da nöronal gelişimin dinamik sürecini gösterir.

İki gün in vitro olarak, transfekte edilmemiş nöronları içeren cam tabanlı görüntüleme kabını önceden ısıtılmış nemli bir çevre odasına yerleştirin. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlüğü için 60x plan apokromat, 1.4 NA, DIC objektif lensi ve yüksek sayısal açıklıklı kondansatör ile donatılmış bir mikroskop kullanın. Daha sonra, iletilen ışık aydınlatması ile, oküler aracılığıyla nöronları bulmak için odak düzlemini ayarlayın.

Akson dallanmasının DIC görüntülemesi için, soğuk aydınlatmanın uygun şekilde ayarlanması, görüntü optimizasyonu için ayrılmaz bir unsur olacaktır ve analiz edilebilir sonuçlar üretmek için kritik öneme sahiptir. Ardından, ilgilenilen nöronlar görüş alanı içindeyken, en az altı hücrenin XYZ konumlarını bulmak ve kaydetmek için görüntüleme yazılımındaki çok alanlı toplama işlevini kullanın. Şimdi, hücreleri uyarmak için mililitre başına 250 nanogram netrin-1 veya başka bir ilgi faktörü konsantrasyonuna ekleyin ve Çok Alanlı Edinimi Başlat'a basın.

Sırayla, 24 saat boyunca her 20 saniyede bir her konumda görüntü alın, alımı duraklatın ve gerektiğinde yeniden odaklanın. Görüntüleme yazılımı içinde, Uygulama'yı seçerek görüntüleri inceleyin, Çok Boyutlu Verileri Gözden Geçirin, ve istediğiniz dosyayı açın. Görüntüleme seansı sırasında oluşan kararlı akson dallarını tanımlayın. Aksonun tabanından ucuna kadar kararlı bir akson dalını ölçmek için izleme bölgesi aracını kullanın.