Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Hazırladığımız gibi cihazlar, 10 veya 20'lik kitler halinde paketlenir ve geldiklerinde, bir kutuda soğuk olarak gönderilir ve kit, çalıştırmanız gereken tüm bileşenleri içerir. Kitteki deney, oda sıcaklığında kalabilen tüm şırınga ve tamponları içeren bir pakettir. Bu deneyde izleyeceğimiz protokolün bir kopyası da var.

Ayrıca, gerçek cihazları ve soğutulması gereken tüm çalışan arabellekleri içeren bir soğutmalı kutu da vardır. Tipik olarak, kitler 10 veya 20'li gruplar halinde paketlenir. Kullanılmadığı zaman kitler buzdolabında saklanmalıdır.

Her şırınga ve her kit bileşeni dikkatlice etiketlenmiştir ve etiketler, takip ettiğimiz protokoldeki tabloya karşılık gelir. Bu nedenle, bireysel adımlarda hangi şırınga veya kit bileşeninin kullanılması gerektiği konusunda herhangi bir belirsizlik yoktur. Cihazları paketinden çıkardıktan ve biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirdikten sonra, nötrofilleri izole etme ve onları aşağı akış genomik uygulamalar için parçalama prosedürünü gerçekleştireceğiz çünkü olacağız, çünkü elde ettiğimiz hayat kurtarıcısı hücre lizatından RNA'yı izole etmek için kullanılacak.

Bu nedenle, alanımızın sadece steril anlamda değil, aynı zamanda çevrede tipik olarak bulunan RNA'lardan da temiz olduğundan emin olmak istiyoruz. Bu nedenle, RNA'ları yok eden bir çözümle tüm alanınızı ve cihazlarınızı silmek çok önemlidir. Bu nedenle, tipik olarak, tüm araçlarımızı ve çalışma yüzeylerimizi, bir dizi üreticiden alabileceğiniz RNA SAP veya RNA'larla sileceğiz.

Cihaz, ısıyla yapıştırılmış bir poşet içinde paketlenmiş olarak geldi. Her cihaz mühürlenir ve bu barkod barkodlanır. Herhangi bir klinik örnekle çalışıyorsanız bu barkodu not etmelisiniz.

Böylece cihazın mührü açılır, kapak çıkarılır ve pompa tutma manifoldu cihazına yerleştirilir. Kullandığımız kan örneği tam kan örneğidir. Bunu standart bir mil BD şırıngasından geçireceğiz ve bu şırınga olarak adlandırıldı.

Tipik olarak yapılan şey, şırınganın paketten çıkarılması ve kapağın kan tüpünden dikkatlice çıkarılmasıdır. Ve yaptığınız şey 700 mikrolitre veya 0.7 mil kan damlatmak ve bunun yarısını veya 350 mikrolitreyi 1.5 millik bir tüpe enjekte etmek. Teşekkürler. Bu şekilde, kanınız daha sonraki işlemler için aktarılabilir.

Sizin, kan tüpünüz aktarılabilir ve yine de bir cihaz arızası durumunda daha fazla kanınız kalır. Şimdi yapacağımız şey, içinde kan olan şırıngayı, bu cihazla bir boru parçasına bağlı olan bu iğnenin üzerine yüklemek. Mikroakışkan izolasyon cihazı ile çok iyi olmak istiyoruz.

Cihazın içine, içine herhangi bir hava kabarcığı girmemesine veya cihazın arızalanmasına çok dikkat etmek istiyoruz. Tipik olarak yaptığımız şey, şırıngayı almak ve pistonu aşağı itmek ve sıvıyı cihazın üst yüzeyine eklemek, tüm sıvıyı çıkarmadan önce tamamen yapıştığından emin olmaktır. Duruyoruz ve şırınga gövdesini iğneden dikkatlice çıkarıyoruz ve temel olarak iğne ucunu veya iğnenin yem konektörünü bu şırıngada kalan tamponla dolduruyoruz.

Bunu bertaraf ediyoruz. Daha sonra kanlı şırıngamızı alacağız ve onu bu yem merkezine yerleştireceğiz. Kanı dökmemeye dikkat etmek ve hava kabarcığı sokmamaya dikkat etmek.

Herhangi bir kan dökülmesi durumunda şırınganın gövdesini ve hortumu tutan bir kemo kullanmanın en iyi yolunu bulun. Bir kez, şırınga boru muhafazasına veya iğneye bağlandıktan sonra, konektörde olabilecek hava kabarcıklarını gidermek için birkaç keskin dokunuş yaparız. Bu şırınga daha sonra şırınga pompasına yüklenir ve ardından kilitleme vidası ile sabitlenir.

Şırınga pompası açılmıştır ve akış koşullarımıza göre önceden ayarlanmıştır. Bu kanı cihazdan dakikada 30 mikrolitre hızla geçireceğiz. Şırınga gövdesi şırınga pompasına yüklendikten sonra, hareketli piston kolundaki düğmeye basacağız ve pistonun üst kısmına değene kadar aşağı kaydıracağız ve sıvıyı bunun ucundan dışarı itmeye başlayacağız.

Kör uçlu, paslanmaz çelik bir iğne. Sistemin hazır olduğunu öğrendikten sonra çalıştır tuşuna basacağız. Kan akışını başlatmak için, durdurmak için durdur'a basıyorsunuz ve ardından temiz bir 1,5 mil santrifüj tüpü veya fendor tüpü alıyorsunuz ve dikkatlice fişini çekeceğiz.

Sadece birini çıkarın, hortumu cihazın bir bağlantı noktasından çıkarın. Bu borunun fişi çekildikten sonra, onu 1.5 mil fendor tüpüne yerleştireceğiz. Kan akışını tekrar başlatmak için çalıştır tuşuna basacağız.

Ve bir damla kan formu gördüğümüzde, pompayı durdurup cihazda yeni açtığımız girişe yerleştiriyoruz. Kan akışını başlatmak için çalıştır tuşuna basacağız ve beş dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayacağız. Kanın tüm odaları eşit şekilde doldurduğundan ve cihazda belirgin hava kabarcıkları olmadığından emin olmak istiyoruz.

Odacıklardan herhangi birine akışı engelleyen hava kabarcıkları varsa, bir cımbız alabilir ve bunları yakalama odalarına veya yakalama odalarından çıkan küçük kanallara giden küçük kanallar boyunca gezdirebilirsiniz. Bu cihaz güzel bir şekilde doluyor, bu yüzden beş dakika sonra, kan akışını durdurmak için şırınga pompasındaki durdur düğmesine basıyorsunuz, şırınga kelepçesini gevşetiyorsunuz ve şırınga pompası tutucusundan çıkarıyorsunuz. Sonra üç numaralı şırıngayı kullanacağız, nükleaz içermeyen PBS ile yüklü, kullanacağız, temel olarak, herhangi bir hava kabarcığını önlemek için cihazın yüzeyinin yapıştığından emin olacağız, herhangi bir hava kabarcığı yapmak için şırıngaya dokunacağız, herhangi bir hava kabarcığı şırınga gövdesinin üstünde olduğundan emin olun.

Şırınga pompasındaki kolu gevşetin ve üç değirmen şırıngasını pompaya yerleştirin. Aşağı doğru sıkın ve ardından pistonu şırınganın pistonuna temas edene kadar aşağı doğru itin. Çalıştır düğmesine basıyoruz ve sıvının cihazı doldurmasını bekliyoruz ve paslanmaz çelik iğnenin ucunda bir damlacık görmesini bekliyoruz.

Bir damla oluştuğunu gördüğünüzde pompayı durdurursunuz. Kanı çıkaracağız, kanı olan paslanmaz çelik ucu. Yıkama tamponunu yerleştireceğiz ve çalıştır tuşuna basacağız.

Ve bunun beş dakika boyunca çalışmasına izin vereceğiz. Ve temiz bir mendil almalı ve girişte veya çıkışta olabilecek küçük bir miktar kanı silmelisiniz. Cihazda beş dakika yıkama tamponu çalıştıktan sonra, cihaz herhangi bir kandan tamamen arındırılmalıdır ve temel olarak Cihazda hiç kırmızı kan kalmayacağını görebilirsiniz, Cihaz net görünecektir. Beş dakika sonra yapacağımız şey, yıkama tamponunun çalışmasını durdurmak.

Ve yine, şırıngayı şırınga pompasından çıkaracağız. 1.5 mil mikro santrifüj tüpünü esnek çıkış borusunun üzerine kapatacağız. Ve tüpü, mikro santrifüj tüpünü dikkatlice kaldıracağız, atık boruyu cihazdan çekerek çıkaracağız.

Bunu bir biyolojik tehlike kabına atacağız. Kitte aslında Teflon'dan yapılmış yeni bir çıkış borusu var. Üzerinde yine paslanmaz çelik bir uç var.

Eski çıkış borusunu bu yeni çıkış borusuyla değiştireceğiz. Bu çıkış borusunu alacağız ve onu bir tür U veya V şeklinde bükmeye çalışacağız. Ve ayrıca kit ile birlikte bir kaya parçalayıcı sütunu var, bu DNA'yı kesiyor ve temel olarak hücre yaşamınızı homojenleştiriyor.

Bu yüzden, parçalayıcı kolonunun mor kapağını açacağız ve çıkış borusunu Kay Parçalayıcı kolonuna yerleştireceğiz. İki numaralı kit şırıngasından çıkaracağız, diyor ki, RLT için onu kullanacağız. 22 gauge kör uçlu, paslanmaz çelik şırınga için standart bir BD bir mildir.

Bunu, kyogen'den cihaza 350 mikrolitre standart RLT enjekte etmek için kullanacağız. Cihazın ölü hacmi yaklaşık 50 mikrolitre olduğu için, yapmak istediğimiz şey RLT'yi enjekte etmek istiyoruz, ancak RLT'nin arkasına, cihazın bu ölü hacmini chi parçalayıcı kolonuna bırakmak için bir hava tıkaç enjekte etmek istiyoruz. Bunu şu şekilde yapacağız, şırıngamızı alacağız, çekeceğiz, 350 mikrolitre hava çekeceğiz ve ardından 350 mikrolitre veya 0.35 mil RLT vereceğiz ve RLT şimdi şırınganın dibinde.

Şırıngayı ters çevirme ve havayı enjekte etme cazibesine direnin. Hava, tüm RLT'yi Kay parçalayıcı sütunumuza aldığımızdan emin olmak için orada. Yıkama tamponundan çıkan boruyu çıkaracağız.

Şırıngamızı RLT ile birlikte yerleştireceğiz ve RLT'yi yaklaşık 30 saniyelik bir süre boyunca cihaza yavaşça enjekte edeceğiz, çıkış borusunun atıklarını chi parçalayıcı kolonuna attığından emin olacağız. Cihaza hava enjekte edilmeye başladığında, plumer'ı aşağı bastırın ve tüm sıvının Kay Shredder kolonuna salınmasını bekleyin. Kay parçalayıcı kolonunu ca'lıyoruz ve iki dakika boyunca tezgah üstü bir mikro merkez sigortasında 15, 000 RPM veya maksimum RPM'de bir terazi ile bir mikro merkez füje üzerinde döndürüyoruz.

Bu nedenle, sütunu iki dakika döndürdükten sonra, şu anda RLT'de olan numuneyi çıkaracağız ve onu verilen mor kapaklı kriyo şişelerinden birine yerleştireceğiz. Klinik bir örnekle çalışıyorsanız, bu kriyo şişelerini örnekleyin, deneyin başında etiketleyeceksiniz. İşte kriyo şişesindeki lizat.

Bu kriyo şişesi hemen eksi 80 derecelik bir AC C dondurucuya yerleştirilir ve sevkiyat veya daha sonra RNA ekstraksiyonu için saklanır. Yani bu alternatif bir protokol Nötrofillerin izolasyonu için. Hücreleri RLT tamponu ile parçalamak yerine, onları standart bir histolojik boyama ile boyayacağız.

Bir leke. Bu yüzden cihaz mühürlü cihazı çantadan çıkarıyoruz ve tekrar paketinden çıkarıyoruz, cihazın lot numarasını not ediyoruz ve Petri kabını yerleştiriyoruz. Petri kabı tutucusunda.

Bir numaralı şırıngadan bir mil şırıngayı çıkaracağız, üzerine 700 mikrolitre kan yükleyeceğiz ve bunun yarısını 350 mikrolitre olarak bir eend DPH tüpüne enjekte edeceğiz. Bunu bir kenara koyacağız. Seçmek için kullanacağımız boruya sahip olan dördüncü şırıngayı alın, kanı cihaza enjekte edin.

İğnenin tabanını borunun ucundan kimyasal bir şekilde tutacak. Şırınga gövdesini çıkarın ve yemi doldurun. Adaptör bu şırıngayı tamponlar ve atar.

Herhangi bir yayılmayı toplamak için kimyasal mendil kullanarak kan içeren şırıngayı iğneye yerleştireceğiz. İğne ve şırınga gövdesi arasındaki bağlantıdaki hava kabarcıklarını gidermek için şırıngaya dokunacağız. Şırıngayı şırınga pompasına yükleyeceğiz, şırınga pompasının hareketli kolunu aşağı doğru iterek astarlayacağız veya boruyu dolduracağız.

Boruyu cihazın çıkışlarından birinden, yakalama cihazından çıkaracağız ve 1.5 mil einor tüpüne yerleştireceğiz. Ve sonra şırınga pompasını iterek kan akıtmaya başlayacağız. Paslanmaz çelik uçta bir damla kan oluşmasını bekleyeceğiz.

Damlacık oluştuğunda, o kanı durdurun, kurutun, cihaza yerleştirin ve çalıştır'a basın. Şimdi beş dakikalık bir zamanlayıcı ayarladık. Tamam, cihazdan beş dakika aktıktan sonra, şırınga pompasındaki durdur düğmesine basın ve şırıngayı serbest bırakın.

Ve bu şırıngayı, yıkama tamponumuzu içeren üç mil şırınga ile değiştireceğiz, bu sadece bir XPBS. Yine, cihazın üst kısmının çentikli olduğundan emin olmak istiyoruz ve ardından kan veya artı koşu içeren iğne ucunu çıkaracağız. Cihazı hazırlamaya başlayın.

Damlacık formlarına gireceğiz, onu cihaza yerleştireceğiz ve giriş veya çıkış borusundaki herhangi bir kanı akıtacağız ve yıkama adımından sonra beş dakika boyunca akmasına izin vereceğiz. Yine, şırınga pompasını durduracağız ve şırıngayı pompa tutucusundan çıkaracağız. Standart GIM sürdürme yapmak için önce hücreleri sabitleyeceğiz ve %100 metanol kullanarak dehidre edeceğiz.

Yani biz, bir şırıngamız var, metanol ile önceden yüklenmiş üç millik bir şırınga. Yine, şırıngayı dolduracağız, metanolün aktığından emin olacağız, şırınga pompasını durduracağız, cihaza takacağız ve çalıştır düğmesine basacağız. Onları bu metanol çözeltisinde iki ila dört dakika boyunca sabitleyeceğiz.

İki ila dört dakikalık sabitleme ve metanolden sonra, pompayı durduruyoruz, şırıngayı metanol ile serbest bırakıyoruz ve burada bir şırınga yükleyeceğiz, Sigma'dan eem sustain standart eem sustain içeren üç mil şırınga deiyonize suda bir ila beş seyreltilmiş. Seyrelttikten sonra şırıngaya yükledik ve şırınganın ucuna 0.8 mikron filtre takarak içine girecek partikülleri süzdük ve bu da cihazı tıkayacak. Leke beş ila 10 dakika.

Ve sonra Deion i'nin suyu ile durulayacağız. Beş ila 10 dakikalık boyamadan sonra, şırınga pompasını durduracağız ve deiyonize su içeren şırınga ile boyama tamponu ile şırıngayı değiştireceğiz, temel olarak SAI'nin mavi rengini görene kadar yıkayacağız, cihazdan yıkandı. Fazla gim sustain cihazdan durulandıktan sonra yıkama solüsyonunu durdururuz.

Ve sonra yapacağımız şey, su şırıngasını girişten çıkarmak. Daha sonra cihazın çıkış borusunu alacağız. Sonunda o boruyu cımbızımızla kavrayacağız.

Bu esnek bir tigon borusudur ve onu cihazın girişine geri takacağız. Bu, cihazı kapatır ve hücreleri nemli tutar ve morfolojilerini sağlam tutar. Şimdi iş arkadaşım Dr.John Hong Chang, CD dört pozitif lenfositin izolasyonu için alternatif bir protokol gösterecek ve ardından doğrudan mikroakışkan cihaz içinde immünofloresan boyama yapacak.

Bu yüzden benim adım Shong Hong ve bugün size mikroakışkan cihazda hücre boyamayı göstereceğim, bu aşamada size kan hücrelerini benzeri görülmemiş tam kandan spesifik olarak izole etmek için bir mikro flic immüno-afinite izolasyon cihazının nasıl kullanılacağını gösterebilirim. Amacı için, hücreleri bitlemek ve izole edilen bu hücrelerden protein ve DNA içeriği almak istiyor. Araştırmamın amacı için, hücreleri elde etmek ve daha sonra hücre sayısını elde etmekle ilgileniyorum, örneğin, tam kandan CD dört hücre sayımı elde etmek ve bunu teşhis amaçlı bir gösterge olarak kullanmak.

Yani kullanılan cihaz Ken'in cihazına çok benziyor. P-D-M-S-A düz odadan yapılmıştır. Geometri biraz farklıdır, bu nedenle çalışma parametreleri biraz farklıdır, genel olarak ise genel işlem prosedürü çok benzerdir.

Bu yüzden tüm hücre yakalama ve durulama adımlarını atlayacağım ve hücre sayma prosedürlerinde doğrudan hücre boyama adımına atlayacağım. İşte burada, tam kandan alınan yarım hücrelerden oluşan bir cihazım var ve cihaz zaten PBS ile durulanmış durumda. Bu nedenle, giden hücreler zaten cihazdan yıkanmış ve önceden hazırlanmış olan hücreleri, özellikle cihaza izole edilen hücreleri etiketlemek için kullanılan bir antikor karışımı.

Yani burada kullandığımız antikor konsantrasyonu, floresan mikroskobu altında çok yüksek floresan yoğunluğuna sahip hücreleri boyamak için optimize edilmiştir. Yani prosedür oldukça basittir. Antikor çözeltisi ile doldurulmuş şırıngayı şırınga pompasına yüklüyoruz ve ardından akış hızının ihtiyacımız olan doğru parametrelere ayarlandığından emin oluyoruz.

Ve sonra şırınga pompasını başlatacağız, borunun sonunu izleyeceğiz, çözeltinin zaten çıktığından emin olacağız, böylece boruda daha fazla kabarcık kalmayacak. Ve sonra bu hortumu, hücrelerimizi yakaladığımız mikroakışkan cihaza takabiliriz. Şimdi antikor cihaza akıyor ve izole ettiğimiz hücreleri lekeliyor, cihazda, buradaki akış hızı, dakikada beş mikrolitre kullanıyorum, ancak oradaki cihaz geometrisine bağlı olarak, amacınız için kullanmak istediğiniz farklı akış parametreleri olabilir.

Ve antikor çözeltisinin akışını beş dakika boyunca içeri alacağız, bu da mikrofo kanalındaki tüm çözeltiyi değiştirmek için yeterli hacim için yeterlidir. Yani antikor enjeksiyonundan sonra akışı durduracağız. Bu yüzden, mikrokanal içindeki tüm çözeltiyi değiştirmek için beş dakika boyunca dakikada beş mikrolitrede antikor içinde yüzdürüyoruz.

Daha sonra akışı durdururuz ve cihazın 30 dakika boyunca inkübe edilmesine ve oda sıcaklığına izin verilir. Bu yüzden bu karanlıkta yapılmalıdır, böylece hücreler bir boyama antikoru ile inkübe edilirken hücreler, floresan antikorlar söndürülebilirken antikor söndürülemez. Bu nedenle, genellikle 15 dakika ila 30 dakika arasında boyama işleminden sonra, boruyu cihazdan çıkaracağız ve cihazdan bağlanmamış antikoru yıkamak için antikor şırıngasını bir tampon şırınga ile değiştireceğiz.

Yani buradaki yıkama solüsyonu PBS solüsyonunda %1 BSA içerir. BSA, antikorun yüzeyde bağlanmamasını engellemek için kullanılır ve biz de aynı şeyi yapacağız. Bu yüzden önce şırınga pompasındaki akış hızını, istediğimiz doğru akış hızı olduğundan emin olmak için ayarlıyoruz ve ardından şırınga pompasını başlatacağız ve cihaza takmadan önce borudan gerçekten sıvı çıktığından emin olacağız.

Bunu yapmanın amacı, boruda kalıntı gibi bir kabarcık kalmamasıdır. Yani enjekte ettiğimizde, cihazımıza hiçbir baloncuk girmez. Bu yüzden sadece tüpü cihaza takıyoruz ve cihazdaki tüm yıkanmayı, bağlanmamış antikoru değiştirmek için beş dakika daha akmasına izin veriyoruz.

Yıkama adımından sonra hücreleri %1 PFA ile sabitleyeceğiz. Bunu yapmanın amacı, görüntüleme hemen gerçekleştirilebiliyorsa, cihaz birkaç haftadan birkaç haftaya kadar saklanabilir. Yani prosedür oldukça basittir.

Daha önce yaptığımıza benzer. Şırıngayı pompaya yüklüyoruz, akış hızını istediğimiz hıza ayarlıyoruz ve ardından şırınga pompasını başlatıyoruz ve hücreleri sabitlemek için cihazımıza sabitleyici olan paraform IDE solüsyonunu enjekte etmek için boruyu cihazımıza takıyoruz. Yine, yaklaşık beş dakika akmasına izin verdik.

Bu nedenle PFA, cihazdaki tüm hücreleri sabitlemek için cihazdaki tüm arabelleğin yerini alır. Bu nedenle, PFA sabitleme adımından sonra, PFA şırıngasını çıkarıyoruz ve artık cihaz görüntüleme için hazır. Bazı durumlarda, insanlar hücre yüzeyi işaretleyici boyaması ile üst üste binmek için göstermek için bir çekirdek boyamasına sahip olmak isterler.

Yani bu amaçla, sonunda DPI kullanarak çekirdek boyama yapacaktır. Bu yüzden DPI şırıngasını yüklüyoruz, şırınga pompasını açıyoruz ve DPI'yı cihazımıza akıtıyoruz. Yani şimdi çekirdek, hücrelerin yerini göstermek için bu hücrelerde boyanacak.

Ve bu, DPI boyama görüntüsü daha sonra hücrelerin nerede olduğunu göstermek için yüzey işaretleyici boyama ile kaplanabilir. Bu nedenle, DPI boyamanın sonunda, L bandı DPI P'yi tampon solüsyonu ile tekrar yıkamamız gerekir. Bu nedenle, giden dpi'yi temizlemek için %1 BSA içeren PBS kullanıyoruz.

Ve operasyon daha önce yaptığımıza benzer. Sadece tampon şırıngayı cihazımıza takıyoruz ve bağlanmamış dap'ı yıkamak için tamponun cihaza akmasına izin vereceğiz. İşte bu, mikro sıvı cihazındaki hücreleri boyama prosedürünün tamamıdır.

Ve tüm boyama işlemlerinden sonra cihazlar görüntüleme için hazır hale gelir. Ve PFA düzeltmesi yaptığımız için, cihazlar birkaç hafta boyunca da saklanabilir. Görüntü görüntüleme hemen gerçekleştirilemezse.