Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu
October 13th, 2023
Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.
Bu protokol, kırmızı tümör hücresi sayımı ve klinik CTC izolasyonu için bir yöntem tanımladı. Başlamak için, MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa tümör hücrelerini bir hücre kültürü şişesinde bir milimetre DMEM'de bir kez 10 ila beşinci% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş olarak kültürleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Hücre çizgileri% 95 birleşime kadar yapışkan tek tabakalar olarak büyüdüğünde, bunları iki dakika boyunca% 0.25 tripsin çözeltisi ile kültür kabından ayırın. Üç mikrolitre Calcein ekleyerek tümör hücrelerini boyayın ve tabağı 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüm hücreleri tripsin ile sindirin.
PBS'deki kültür tümör hücrelerini bir hücre sayma odası ile sayın ve bir mililitre PBS başına 100 tümör hücresi elde edilene kadar seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş hücre süspansiyonunu, çeşitli akış hızlarında bir şırınga pompalı bir şırınga kullanarak mikroakışkan çipe sokun. Çeşitli akış hızları için yakalama verimliliğini elde edin ve optimum akış hızını belirleyin.
Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Verilen formülü kullanarak yakalama verimliliğini hesaplayın. 10'dan 100'e kadar farklı sayıda tümör hücresi için yakalama verimliliğini elde etmek için prosedürü tekrarlayın.
Nadir sayıda tümör hücresi için mikroakışkan çipi test edin ve doğrulayın. Seyreltilmiş tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirmesi ile yapılan içi boş bir iğne kullanarak bu 10 numune süspansiyonunu mikroakışkan çiplere enjekte edin. Çip üzerinde yakalandıktan sonra her numune için tümör hücrelerinin sayısını tespit edin ve numaralandırın.
Daha sonra, tümör hücrelerini Calcein ile boyayın ve beş mikrolitre PBS'de 100 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitrelik tam, normal kan örneğine dökün. Bu hücreleri çipe yerleştirin ve çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını yeşil immünofloresan ile numaralandırın.
Açıklandığı gibi in vivo numaralandırma gerçekleştirin ve yakalamadan sonra yakalama verimliliğini hesaplayın. Boyama olmadan bir ila 10 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitre tam, normal kana dönüştürün.
Bu örnekleri mikroakışkan çipe yerleştirin ve tümör hücrelerini yakalayın. 20 ila 30 mikrolitre PBS'ye üç ila beş mikrolitre floresan boya ekleyin ve bu çözeltiyi bir şırınga ile çip üzerine verin. Yakalama verimliliğini belirlemek için çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını mavi ve yeşil immünofloresan ile numaralandırın.
Daha sonra, anti-epitelyal hücre adezyon molekülünün afiniteye dayalı yakalanması için çipin yüzeyini 100 mikrolitre% 4 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve etanol ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca değiştirin. İnkübasyonun sonunda, çipi etanol ile üç kez yıkayın. Daha sonra 100 mikrolitre birleştirme maddesi GMBS ekleyin ve 30 dakika boyunca etkileşime girmesine izin verin.
İnkübasyonun sonunda, çipi bir mililitre PBS ile üç kez yıkamak için bir şırınga kullanın. Çipe, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında mililitre nötravidin başına 30 ila 40 mikrolitre 10 mikrogram uygulayın, bu da hücrelerin GMBS'ye immobilizasyonuna yol açar ve daha sonra fazla avidini çıkarmak için PBS ile yıkayın. Çipi üç mikrolitre anti-biyotinillenmiş epitel hücre adezyon molekülü antikoru ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin.
Tüm tümör hücreleri, herhangi bir hücre eksik olmadan dalga çipi dizisinin etrafında yakalandı, bu da mikroakışkan çipin yüksek yakalama verimliliğini gösterdi. Hoechst ve Calcein ile boyanmış tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Küçük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan bir mide kanseri hastasından alınan CTC'ler burada gösterilmektedir.
Ayrıca, yamuk mikro filtreler kullanılarak yakalanan ve hem mavi hem de yeşil floresan yayan bir kolorektal kanser hastasından alınan CTC'ler gösterilmektedir. Büyük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan tümör hücreleri için yüksek yakalama etkinliği ve canlılığı gözlendi. Mikroakışkan çipte yakalanan kolorektal CTC'lerin klinik immünofloresan analizi, CTC'leri DAPI-pozitif, CK-pozitif, CD45-negatif ve WBC'leri DAPI-pozitif, CK-negatif, CD45-pozitif olarak tanıdı.
Yakalandıktan sonra büyük elips çip üzerinde kültürlenen kolorektal tümör hücreleri ve büyük elips mikro filtrelerde yakalanan kolorektal tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Aptamer ile yapılan bu modifikasyon yöntemi, CTC izolasyonunu zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, klinik mikroakışkan çip kullanarak kırmızı tümör hücrelerinin sayımını ve dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTCs) izole edilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu teknik, kan örneği ön işlemesini basitleştirir ve tek tek CTC'lerin hızlı tespiti ve tanımlanmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomedikal analiz
- Klinik teşhis
- Hücre kültürü teknikleri
Arka Plan
- Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTCs), kanser teşhisi ve izlemesi için kritik öneme sahiptir.
- Mikroakışkan çipler, CTC izole etme verimliliğini artırır.
- İmmünoflüoresan boyama, CTC'lerin görselleştirilmesine yardımcı olur.
- Standart hücre kültürü yöntemleri, tümör hücrelerinin analiz için hazırlanmasında esastır.
Çalışmanın Amacı
- CTC sayımı için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Klinik kan örneği işleme verimliliğini artırmak.
- Dolaşımdaki tümör hücrelerinin yerinde tanımlanmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- DMEM'de tümör hücre hatlarının (MCF-7, MDA-MB-231, HeLa) kültürü.
- Görselleştirme için hücrelerin Calcein AM ile boyanması.
- Sayım için hücrelerin tripsin ile ayrılması.
- CTC izole etme ve analiz için mikroakışkan çipin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Kırmızı tümör hücrelerinin başarılı bir şekilde sayılması.
- Kan örneklerinden CTC'lerin verimli bir şekilde izole edilmesi.
- Klinik ortamlarda mikroakışkan çipin etkinliğinin gösterilmesi.
- İmmünoflüoresan boyama yoluyla tek tek CTC'lerin hızlı tanımlanması.
Sonuçlar
- Mikroakışkan çip, CTC analizi için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, kanser teşhisinin hızını ve doğruluğunu artırır.
- Dahası, çalışmalar klinik onkolojideki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and enumeration of circulating tumor cells (CTCs) are critical for advancing liquid biopsy strategies in oncology drug discovery and translational research. This microfluidic chip platform enables high-sensitivity detection and in situ characterization of rare CTCs, supporting predictive biomarker development and early-stage mechanistic de-risking. Integration of affinity-based capture and immunofluorescence analysis positions this technology at a key inflection point for portfolio triage and target validation in cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumor cell heterogeneity and metastatic potential through rare cell capture.
- Supports functional validation of epithelial and mesenchymal markers via immunofluorescence staining.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct enumeration and phenotyping of CTCs from clinical samples.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for preparing and analyzing blood samples for CTC content.
- Delivers quantitative outputs for capture efficiency and cell viability, supporting assay reproducibility.
- Enables platform scalability and reuse for compound screening or biomarker studies involving rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ CTC characterization from patient samples.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by bridging in vitro and clinical sample analysis.
- Reduces biological risk in candidate selection by providing real-time, patient-derived cellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip platform fits within the discovery-to-translational continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and preclinical biomarker validation for oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of CTC biology and metastatic mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative CTC enumeration and viability metrics for assay development.
- Analytics: Provides immunofluorescence-based phenotyping and statistical capture efficiency outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Enables direct analysis of patient-derived CTCs, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform adaptable to diverse cancer types and biomarker panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in oncology research.
- Operational Value: Standardizes rare cell isolation and analysis, improving reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative CTC data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology assets based on translational biomarker evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, immunofluorescence, and rare cell analysis.
- Needs access to cell culture, fluorescence microscopy, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptable to various tumor types and blood sample volumes with protocol optimization.
- Capture efficiency and marker specificity must be validated for each clinical context.
