Name: Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin dolaşımdaki tümör hücrelerinin klinik mikroakışkan çip kullanarak izolasyonu ve sayımı yöntemini. Bu teknik kan örneği ön işlemini basitleştirir ve tek CTC'lerin hızlı tespitini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma çalışması, Çin Anhui Doğa Bilimleri Vakfı (1908085MF197, 1908085QB66), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21904003), Tianjin Eğitim Komisyonu Bilimsel Araştırma Projesi (2018KJ154), Anhui Eyaleti Yüksek Öğretim Kurumları İl Doğa Bilimleri Araştırma Programı (KJ2020A0239) ve Şanghay Çok Boyutlu Bilgi İşleme Anahtar Laboratuvarı, Doğu Çin Çok Boyutlu Bilgi Anahtar Laboratuvarı tarafından desteklenmiştir İşleme, Doğu Çin Normal Üniversitesi (MIP20221).

Hasta kan örnekleri, Şanghay Tıp Üniversitesi'ne bağlı Longhua Hastanesi tarafından sağlandı.Protokol, Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi'nin insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip ediyor. Örneklerin araştırma amaçlı kullanılması için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kültürlenmiş tümör hücreleri ile yakalama verimliliğini kontrol etmek için ön deney
<ol><li>Yakalama verimliliğini belirlemek için MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa tümör hücrelerini kültürleyin. Tümör hücresi süspansiyonunu seyreltin, tümör hücrelerinin sayısını sayın ve 1 mL PBS'de istenen hücre sayısı elde edilene kadar tekrarlayın.<ol><li>Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) başlangıç hücre sayısı ~ 1 x10 5 hücre olan bir hücre kültürü şişesinde kültürleyin. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %5CO2 atmosferi ile inkübe edin.</li>
		<li>Hücre çizgileri% 95 birleşime kadar yapışkan tek tabakalar olarak büyüdüğünde, bunları Chen ve ark.16'da tarif edildiği gibi% 0.25 tripsin çözeltisi ile 2 dakika boyunca kültür kaplarından ayırın.</li>
		<li>Tümör hücrelerini kalsein ile boyayın. Kültür kabına 3 μL kalsein koyun ve kabı inkübatörde 30 dakika tutun. Ardından, tüm hücreleri tripsin ile sindirin.</li>
		<li>PBS'de kültürlenmiş tümör hücrelerini bir hücre sayma odası ile sayın ve 1 mL PBS başına 100 tümör hücresi elde edilene kadar seyreltin. NOT: Hücre sayısını tam olarak numaralandırmak için, mikroskopla içindeki tümör hücresi sayısının beş olup olmadığını görmek için elde edilen hücre süspansiyonundan 50 μL alın. 50 μL hücre süspansiyonundaki gerçek tümör hücresi sayısına göre 100 tümör hücresi elde etmek için alınması gereken hücre süspansiyonunun hacmine karar verin.</li>
	</ol></li>
	<li>0.5 mL / s, 1 mL / s, 2 mL / s, 3 mL / s, 4 mL / s ve 5 mL / s'lik çeşitli akış hızlarında bir şırınga pompalı bir şırınga kullanarak 1 mL PBS başına 100 tümör hücresi içeren hücre süspansiyonunu mikroakışkan çipe sokun. Çeşitli akış hızları için yakalama verimliliğini elde edin ve optimum akış hızını belirleyin.<ol><li>Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Yakalama verimliliğini aşağıdaki gibi hesaplayın: Yakalama verimliliği = Yakalanan hücre sayısı/(Yakalanan hücre sayısı + dışarı akan hücre sayısı) × %100</li>
		<li>10'dan 100'e kadar farklı sayıda tümör hücresi için yakalama verimliliğini elde etmek için tekrarlayın (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).</li>
	</ol></li>
	<li>Nadir sayıda tümör hücresi için mikroakışkan çipi test edin ve doğrulayın. 1 mL PBS içinde seyreltilmiş 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirme ile yapılan içi boş bir iğne kullanarak bu 10 numune süspansiyonunu mikroakışkan çiplere enjekte edin. Çip üzerinde yakalandıktan sonra her numune için tümör hücrelerinin sayısını tespit edin ve numaralandırın. NOT: İçi boş iğne yaklaşık 3 cm uzunluğunda ve 1 mm dış çapındadır.</li>
	<li>Normal kan örneklerine çivilenmiş tümör hücreleri için klinik deney öncesi testler yapın.<ol><li>Tümör hücrelerini kalsein ile boyayın ve ardından 5 μL PBS'de 100 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri 1 mL tam normal kan örneğine dökün. Bu hücreleri çipe yerleştirin ve çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını yeşil immünofloresan ile numaralandırın. Yukarıda açıklandığı gibi çip üzerinde in vivo numaralandırma gerçekleştirin ve yakalamadan sonra yakalama verimliliğini hesaplayın.</li>
		<li>10'dan 90'a kadar dokuz ek tümör hücresi sayısı konsantrasyonu için adım 1.4.1'i tekrarlayın (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).</li>
		<li>Adım 1.3'te açıklandığı gibi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücrelerini boyamadan numaralandırın, 1 mL tam normal kana dökün, bu örnekleri mikroakışkan çipe ekleyin ve çip üzerindeki tümör hücrelerini yakalayın.</li>
		<li>Çipi Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE ile boyayın. 20-30 μL PBS'ye 3-5 μL floresan boya koyun ve ardından bu çözeltiyi bir şırınga ile mikroakışkan çipe verin. Yakalama verimliliğini belirlemek için çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını hem mavi hem de yeşil immünofloresan ile numaralandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Anti-EpCAM'in afiniteye dayalı yakalanması için mikroakışkan çipin modifikasyonunu gerçekleştirin. NOT: Dalga çipi hem afinite tabanlı hem de fiziksel özellik tabanlı izolasyonu birleştirdiğinden, çipi ajanlarla değiştirin.<ol><li>Çipin yüzeyini 45 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol içinde 100 μL% 4 (h / h) 3-merkaptopropil trimetoksisilan ile değiştirin. Çipin iç yapısını, özellikle üst yüzeyin ve alt tabaka camının yapışmasını tahrip etmesi ihtimaline karşı bu çözeltiyi çipe dikkatli ve yavaş bir şekilde sokun. NOT: Talaş yüzeyi merkaptosilan kullanılarak modifiye edilmiştir. Çip üzerinde meydana gelen etkileşimler kimyasal bağlarla belirlenir. Antijen ile modifiye edilmiş antikorun bağlanmasını gerçekleştirmek için kimyasal bağlar kurulur. Birbirine bağlanan kimyasal bağlar oluşturmak için çipin içinde çeşitli reaktifler modifiye edilir. Modifiye edilecek son reaktif, bir anti-epitelyal adezyon molekülüdür (anti-EpCAM). EpCAM'in tümör hücresi yüzey antijeni, CTC'lerin yakalanmasını gerçekleştirmek için çip içindeki anti-EpCAM ile birleşir.</li>
		<li>Etanol 3x ile yıkayın. Çip üzerine 100 μL birleştirme maddesi N-y-maleimidobütiriloksi süksinimid ester (GMBS, 1 μM) ekleyin ve 30 dakika etkileşime girmesine izin verin.</li>
		<li>PBS 3x ile yıkayın. Yıkamak için çipe 1 mL PBS vermek için bir şırınga kullanın.</li>
		<li>Çipi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30-40 μL 10 μg / mL nötravidin ile muamele edin, bu da hücrelerin GMBS'ye immobilizasyonuna yol açar ve ardından fazla avidini çıkarmak için PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Çipi, %1 (a/h) BSA ile 100 μL PBS'de 10 μg/mL konsantrasyonda 3 μL anti-biyotinillenmiş EpCAM antikoru ile değiştirin. Bunu bir gecede saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC'ler) numaralandırmak için çip üzerinde klinik deney
<ol><li>Kırmızı kan hücreleri lizis (RBCL) solüsyonu kullanarak klinik kanser hastası kan örneklerini önceden işleyin veya bir şırınga kullanarak 2-3 mL kan örneğini doğrudan mikroakışkan çipe verin.<ol><li>Yaklaşık 30 dakika süren ön işlem gerçekleştirin. Antikoagülan tüplerde tam kan örnekleri toplayın. 2-3 mL kana 6-9 mL RBS lizis çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5-8 dakika boyunca 111 x g'da santrifüjleyin ve kırmızı berrak sıvının üst tabakasını atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çip üzerindeki hücreleri aşağıda açıklandığı gibi yakalayın, boyayın, tanıyın ve numaralandırın.<ol><li>Çip üzerindeki hücreleri adım 1'de açıklandığı gibi yakalayın.Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE kullanılarak yakalanan CTC'ler için çipi boyayın. CK-FITC, tümör hücreleri için spesifik bir boyadır ve CD45-PE, beyaz kan hücreleri içindir.</li>
		<li>20 μL PBS'ye 3 μL CK-FITC ekleyin. Bunu şırıngaya yerleştirin ve seyreltilmiş CK-FITC'yi çipin üzerine pompalayın. 30 dakika lekelenmesine izin verin. Çipi yıkamak için çipin üzerine 300 μL PBS verin.</li>
		<li>20 μL PBS'ye 3 μL CD45-PE ekleyin. Bunu şırıngaya yerleştirin ve seyreltilmiş CD45-PE'yi çipin üzerine pompalayın. 30 dakika bekletin. Çipi yıkamak için çipin üzerine 300 μL PBS verin.</li>
		<li>CTC'leri 20x veya 40x büyütmede ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu ile tanımlayın. CTC'ler hem mavi hem de yeşil floresan yayar ve beyaz kan hücreleri (WBC'ler) hem mavi hem de kırmızı floresan yayar. Hem mavi hem de yeşil floresanslı CTC'leri ve hem mavi hem de kırmızı floresanlı WBC'leri tanımlayın.</li>
		<li>İmmünofloresan görüntülerden, çip üzerinde yakalanan CTC'lerin sayısını numaralandırın. CTC'leri Hoechst+/CK-FITC+/CD45− ve WBC'leri Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ olarak numaralandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çip üzerinde yakalanan CTC'leri girişten toplamak için şırıngadan mikroakışkan çip üzerine ters yönde PBS ile yıkayarak yakalanan CTC'leri zenginleştirin. 1 mL PBS'li bir şırınga kullanın, çip üzerinde yakalanan CTC'leri 2-3 dakika içinde zenginleştirmek için prizden sokun, girişten toplayın. Her yıkama adımı için 1 mL PBS kullanın ve 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Mikroakışkan çipte yakalanan tümör hücrelerini veya CTC'leri aşağıda tarif edildiği gibi boyayın.<ol><li>Kalsein kullanarak boyayın. 20 μL PBS'ye 5 μL kalsein ekleyin, hücreleri 30 dakika boyayın, daha sonra tümör hücrelerini elde etmek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 111 x g'de santrifüjleyin ve 1 mL PBS'de süspanse edin.</li>
		<li>Hücresel çekirdeği tanımlamak için, büyük elips mikrofiltreler için 1 mL/s ve yamuk olanlar için 1,5 mL/s'lik optimum akış hızında çipe 20 μL DAPI çözeltisi (20 μL PBS'de 10 μL DAPI reaktifi) ekleyin. Çip ile 30 dakika reaksiyona girmek için 20 μL anti-sitokeratin stok çözeltisinden (20 μL PBS'de 3 μL anti-sitokeratin antikor) geçirin.</li>
		<li>Çip üzerinde yakalanan WBC'leri boyayın. CTC'ler çip üzerinde yakalandıktan sonra, çipe 25 μL anti-CD45 antikor çözeltisi (20 μL PBS içinde 5 μL anti-CD45 çözeltisi) ekleyin ve 30 dakika lekelenmesine izin verin. PBS ile yıkayın ve epitel hücrelerini hem mavi hem de yeşil floresan ile tanımlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi floresan mikroskobu ile immünofloresan tanımlaması yapın.<ol><li>Bir floresan mikroskobu kullanın ve numuneyi mavi lazerle uyarın. Çekirdek hücreleri olan mavi floresan yayan hücreleri bulun. Şu büyütme oranlarından birini kullanın: 10x, 20x veya 40x. Tümör hücresi için açık bir alan bulun. Mavi lazer kaynağı için, 420-485 nm'lik bir uyarma plakası dalga boyu ve 515 nm'lik bir emisyon plakası dalga boyu kullanın.</li>
		<li>Numuneleri hareket ettirmeden başka bir lazer kaynağı kullanın. Floresan mikroskobunu döndürün ve numuneyi yeşil lazerle uyarın. Tümör hücrelerinin göstergesi olan yeşil floresan yayan hücreleri bulun. Bu yeşil lazer kaynağı ile aynı alanın görüntülerini aynı büyütme ile çekin. Hem mavi hem de yeşil floresan yayan hücreler tümör hücreleri olarak tanınır. Yeşil lazer kaynağı için, 460-550 nm'lik bir uyarma plakası dalga boyu ve 590 nm'lik bir emisyon plakası dalga boyu kullanın</li>
		<li>Numuneleri hareket ettirmeden başka bir lazer kaynağı kullanın. Floresan mikroskobunu döndürün ve numuneyi kırmızı lazerle uyarın. Kırmızı floresan yayan hücreleri bulun. Bu kırmızı lazer kaynağı ile aynı alanın görüntülerini aynı büyütme ile çekin. Hem mavi hem de kırmızı floresan yayan hücreler beyaz kan hücreleri olarak tanınır.</li>
		<li>Yukarıdaki lazer kaynaklarının her birini kullanarak elde etmek için görüntüyü kaydedin. Farklı renkli ışıklarla aynı alanın birkaç görüntüsünü çekin.</li>
		<li>Uyarma plakası dalga boyu 330-400 nm ve emisyon plakası dalga boyu 425 nm olan ultraviyole ışık kullanın. Uyarma plakası dalga boyu 395-415 nm ve emisyon plakası dalga boyu 455 nm olan mor ışık kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yakalama verimliliğini adım 1.2.1'deki gibi hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer</a> (2022).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).</li>
<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-selective+collection+of+circulating+tumor+cells+using+Vortex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumor+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Murlidhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radial+flow+microfluidic+device+for+ultra-high-throughput+affinity-based+isolation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells.</a> Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).</li>
<li>Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdevice+for+the+isolation+and+enumeration+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood.</a> Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).</li>
<li>Preira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+circulating+cell+sorting+by+deformability+using+a+microfluidic+gradual+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter.</a> Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).</li>
<li>Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microfluidics+combined+with+active+and+passive+approaches+for+continuous+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).</li>
<li>Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumour+cells+by+physical+means+in+a+microfluidic+device%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review.</a> RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).</li>
<li>Kumeria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+membranes+based+on+peptide-modified+nanoporous+anodic+alumina%3A+Toward+smart+membranes+for+on-demand+molecular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport.</a> Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).</li>
<li>Mahesh, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+platform+for+physical+and+immunological+detection+and+capture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells.</a> Biosensors. 12 (4), 220(2022).</li>
<li>Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+antibody-coated%2C+physical-based+microfluidic+chip+with+wave-shaped+arrays+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells.</a> Biomedical Microdevices. 19 (3), 66(2017).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers. 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inertia-deformability+hybrid+CTC+chip%3A+Design%2C+clinical+test+and+numerical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study.</a> Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Kanserin prognozu ve erken tanısı kanser tedavisi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1. Mikroakışkan çiplerle CTC izolasyonu, invazyon olmadan sıvı biyopsi imkanı sunar. Bununla birlikte, CTC'ler kanda son derece nadir ve heterojendir1, bu da CTC'leri izole etmeyi zorlaştırır. CTC'ler, kaynaklandıkları orijinal tümör kaynaklarına benzer özelliklere sahiptir. Bu nedenle, CTC'ler kanser metastazında hayati bir rol oynar1. 
Ö...

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC'ler nadir ve heterojen olduğu için CTC numaralandırması hayati önem taşır. Nadir CTC'lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, CTC izolasyonu için güçlü tekniklerdir, çünkü gerekli unsurları yüksek duyarlılıkla sunarlar1. Normal kanla karışan nadir sayıda tümör hücresi, gerçek hasta kanını yakından taklit eder, çünkü 2-3 mL gerçek hasta kanı sadece 1-10 CTC içerir. Kritik bir deneysel problemi çözmek için, PBS'ye sokulan veya normal kanla karıştırılan çok sayıda tümör hücresi kullanmak yerine, nadir sayıda tümör hücresinin kullanılması, bir deney yaparken gerçeğe daha yakın olan düşük sayıda kan hücresi sağlar.
Kanser dünyada önde gelen ölüm nedenidir2. CTC'ler, kan ve lenfatik dolaşım sistemlerinde dolaşan orijinal tümörden dökülen tümör hücreleridir3. CTC'ler yeni bir hayatta kalma ortamına taşındıklarında, ikinci bir tümör olarak büyürler. Buna metastaz denir ve kanser hastalarında ölümlerin %90'ından sorumludur4. CTC'ler prognoz, erken tanı ve kanser mekanizmalarının anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, CTC'ler hasta kanında son derece nadir ve heterojendir 5,6.
Mikroakışkan çipler, tümörü istila etmeyen sıvı bir biyopsi sunar. Taşınabilir, düşük maliyetli ve hücre uyumlu bir ölçeğe sahip olma avantajına sahiptirler. CTC'lerin mikroakışkan çiplerle izolasyonu esas olarak iki tipte sınıflandırılır: antijen-antikor bağlanmasınadayanan 7,8,9 afinite tabanlı ve orijinal ve en yaygın kullanılan CTC izolasyon yöntemidir; ve tümör hücreleri ile kan hücreleri10,11,12,13,14,15 arasındaki boyut ve deforme olabilirlik farklılıklarını kullanan fiziksel tabanlı çipler etiketsizdir ve kullanımı kolaydır. Mikroakışkan çiplerin alternatif tekniklere göre avantajı, büyük elips mikrofiltrelerin fiziksel tabanlı yaklaşımının, CTC'leri yüksek yakalama verimliliği ile sıkıca yakalamasıdır. Bunun nedeni, elips mikro direklerin ince hat hattı boşlukları tünelleri halinde düzenlenmesidir. Çizgi-çizgi boşlukları, eşkenar dörtgen mikro direkler gibi mikro direkler tarafından oluşturulan geleneksel nokta-nokta boşluklarından farklıdır. CTC'lerin dalga çipi tabanlı yakalanması, hem fiziksel özellik tabanlı hem de afinite tabanlı izolasyonu birleştirir. Dalga çipi tabanlı yakalama, dairesel mikropostlar üzerinde kaplanmış anti-EpCAM antikoru ile 30 dalga şeklinde diziyi içerir. CTC'ler küçük boşluklar tarafından yakalanır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılır. Kaçırılan CTC'lerin bir sonraki dizideki küçük boşlukları geçmesi gerekir ve çip16'nın içine entegre edilmiş afinite tabanlı izolasyon tarafından yakalanır.
Protokolün amacı, nadir sayıda tümör hücresinin sayımını ve mikroakışkan çiplerle CTC'lerin klinik analizini göstermektir. Protokol, CTC izolasyon adımlarını, az sayıda tümör hücresinin nasıl elde edileceğini, küçük elips filtrelerin, büyük elips filtrelerin ve yamuk filtrelerin klinik fiziksel ayrımını, afinite modifikasyonunu ve zenginleştirmeyi açıklar17.

<table><tbody><tr><td>Calcein</td><td>BIOTIUM</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>kalibre edilmiş mikrokapiller pipetler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0799</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td> CK-FITC BD Biosciences 347653 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>sitokeratin monoklonal antikor</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>GIBCO, ABD</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Moleküler Problar, Solarbio Corp., Çin</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Ying Güvenilir biyoteknoloji, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı kan hücreleri lizisi (RBCL)</td> <td>Solarbio, Pekin</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

Çok yönlü dolaşımdaki tümör hücrelerinin İzolasyonu için klinik mikroakışkan Çip platformu

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC'ler nadir ve heterojen olduğu için CTC sayımı hasta hastalığını belirlemede hayati önem taşır. CTC'ler primer tümörden ayrılır, kan dolaşım sistemine girer ve potansiyel olarak uzak bölgelerde büyür, böylece tümörü metastaz yapar. CTC'ler primer tümöre benzer bilgiler taşıdığından, CTC izolasyonu ve müteakip karakterizasyonu kanserin izlenmesi ve teşhisinde kritik olabilir. Nadir CTC'lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, gerekli elementleri yüksek hassasiyetle sağladıkları için CTC izolasyonu için güçlü yöntemlerdir. Mikroakışkan çipler, hastalar için ağrısız bir likit biyopsi yöntemi sunar. Bu çalışmada, CTC ayırma, analiz ve erken tanı için gerekli olan bir dizi işlevsellik ve hizmeti içeren, böylece biyomoleküler analiz ve kanser tedavisini kolaylaştıran çok yönlü bir CTC izolasyon platformu olan klinik mikroakışkan çipler için bir protokol listesi sunuyoruz. Program, nadir tümör hücresi sayımı, kırmızı kan hücresi lizizini içeren klinik hasta kan ön işlemesini ve mikroakışkan çipler üzerinde yerinde CTC'lerin izolasyonunu ve tanınmasını içerir. Program, tümör hücrelerinin veya CTC'lerin kesin sayımına izin verir. Ek olarak, program, çok yönlü mikroakışkan çipler ile CTC izolasyonunu ve çipler üzerinde yerinde immünofloresan tanımlamasını ve ardından biyomoleküler analizi içeren bir araç içerir.

Tüm kurulum bir şırınga pompası, bir şırınga ve bir mikroakışkan çip içerir. Şırıngadaki hücre süspansiyonu, şırınga pompasına bağlanır ve hücre süspansiyonu, hücreleri yakalamak için mikroakışkan çipe sokulur. Kullanılan tüm mikroakışkan çipler için yakalama verimliliği yaklaşık% 90 veya üzerindeydi. Dalga çipi için çeşitli boşluklara sahip mikro yapılar tasarladık. Küçük boşluklar CTC'leri yakalamak için kullanılır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılır. Hücre süspansiyonu büyük boşluk alanlarında ...

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Bu protokol, kırmızı tümör hücresi sayımı ve klinik CTC izolasyonu için bir yöntem tanımladı. Başlamak için, MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa tümör hücrelerini bir hücre kültürü şişesinde bir milimetre DMEM'de bir kez 10 ila beşinci% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş olarak kültürleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.Hücre çizgileri% 95 birleşime kadar yapışkan tek tabakalar olarak büyüdüğünde, bunları iki dakika boyunca% 0.25 tripsin çözeltisi ile kültür kabından ayırın. Üç mikrolitre Calcein ekleyerek tümör hücrelerini boyayın ve tabağı 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüm hücreleri tripsin ile sindirin.PBS'deki kültür tümör hücrelerini bir hücre sayma odası ile sayın ve bir mililitre PBS başına 100 tümör hücresi elde edilene kadar seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş hücre süspansiyonunu, çeşitli akış hızlarında bir şırınga pompalı bir şırınga kullanarak mikroakışkan çipe sokun. Çeşitli akış hızları için yakalama verimliliğini elde edin ve optimum akış hızını belirleyin.Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Verilen formülü kullanarak yakalama verimliliğini hesaplayın. 10'dan 100'e kadar farklı sayıda tümör hücresi için yakalama verimliliğini elde etmek için prosedürü tekrarlayın.Nadir sayıda tümör hücresi için mikroakışkan çipi test edin ve doğrulayın. Seyreltilmiş tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirmesi ile yapılan içi boş bir iğne kullanarak bu 10 numune süspansiyonunu mikroakışkan çiplere enjekte edin. Çip üzerinde yakalandıktan sonra her numune için tümör hücrelerinin sayısını tespit edin ve numaralandırın.Daha sonra, tümör hücrelerini Calcein ile boyayın ve beş mikrolitre PBS'de 100 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitrelik tam, normal kan örneğine dökün. Bu hücreleri çipe yerleştirin ve çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını yeşil immünofloresan ile numaralandırın.Açıklandığı gibi in vivo numaralandırma gerçekleştirin ve yakalamadan sonra yakalama verimliliğini hesaplayın. Boyama olmadan bir ila 10 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitre tam, normal kana dönüştürün.Bu örnekleri mikroakışkan çipe yerleştirin ve tümör hücrelerini yakalayın. 20 ila 30 mikrolitre PBS'ye üç ila beş mikrolitre floresan boya ekleyin ve bu çözeltiyi bir şırınga ile çip üzerine verin. Yakalama verimliliğini belirlemek için çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını mavi ve yeşil immünofloresan ile numaralandırın.Daha sonra, anti-epitelyal hücre adezyon molekülünün afiniteye dayalı yakalanması için çipin yüzeyini 100 mikrolitre% 4 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve etanol ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca değiştirin. İnkübasyonun sonunda, çipi etanol ile üç kez yıkayın. Daha sonra 100 mikrolitre birleştirme maddesi GMBS ekleyin ve 30 dakika boyunca etkileşime girmesine izin verin.İnkübasyonun sonunda, çipi bir mililitre PBS ile üç kez yıkamak için bir şırınga kullanın. Çipe, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında mililitre nötravidin başına 30 ila 40 mikrolitre 10 mikrogram uygulayın, bu da hücrelerin GMBS'ye immobilizasyonuna yol açar ve daha sonra fazla avidini çıkarmak için PBS ile yıkayın. Çipi üç mikrolitre anti-biyotinillenmiş epitel hücre adezyon molekülü antikoru ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin.Tüm tümör hücreleri, herhangi bir hücre eksik olmadan dalga çipi dizisinin etrafında yakalandı, bu da mikroakışkan çipin yüksek yakalama verimliliğini gösterdi. Hoechst ve Calcein ile boyanmış tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Küçük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan bir mide kanseri hastasından alınan CTC'ler burada gösterilmektedir.Ayrıca, yamuk mikro filtreler kullanılarak yakalanan ve hem mavi hem de yeşil floresan yayan bir kolorektal kanser hastasından alınan CTC'ler gösterilmektedir. Büyük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan tümör hücreleri için yüksek yakalama etkinliği ve canlılığı gözlendi. Mikroakışkan çipte yakalanan kolorektal CTC'lerin klinik immünofloresan analizi, CTC'leri DAPI-pozitif, CK-pozitif, CD45-negatif ve WBC'leri DAPI-pozitif, CK-negatif, CD45-pozitif olarak tanıdı.Yakalandıktan sonra büyük elips çip üzerinde kültürlenen kolorektal tümör hücreleri ve büyük elips mikro filtrelerde yakalanan kolorektal tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Aptamer ile yapılan bu modifikasyon yöntemi, CTC izolasyonunu zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar.

clinical-microfluidic-chip-platform-for-isolation-versatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Protokol, bir poli (N-ISO-propylacrylamide) etkili bir yakalama ve canlı dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) arasında thermoresponsive salınması için (PIPAAm) kaplanmış mikro filtre sunulmaktadır kullanılması. Bu yöntem analizleri ve karakterizasyonu, aşağı off-çip kültürü için hastaların kan ve canlı CTC sonraki sürümünden CTC yakalanmasını sağlar.

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Kült WC'ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Öğrenin dolaşımdaki tümör hücrelerinin klinik mikroakışkan çip kullanarak izolasyonu ve sayımı yöntemini. Bu teknik kan örneği ön işlemini basitleştirir ve tek CTC'lerin hızlı tespitini sağlar.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Daha fazla video keşfet