Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Düşürme deneyinin genel amacı, makromolekülleri mekanik bozunma kullanarak vektörsüz bir şekilde hedef hücrelere iletmektir. Bu, öncelikle hedef hücre tipinin istenen iletim materyali ile süspansiyona getirilmesi ve özel olarak tasarlanmış bir mikroakışkan cihazın rezervuarına yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, mikroakışkan cihaza basınç uygulanır ve hücreler, geçici membran bozunmasını kolaylaştırmak için hücreleri sıkıştıran bir mikroakışkan kanallar dizisinden geçirilir.

Ardından, materyalin hücre sitoplazmasına difüzyonla taşınmasını kolaylaştırmak için hücrelerin, hedef iletim materyali varlığında inkübe edilmesine izin verilir. Bu sırada hücre membranı onarılır. Akış sitometrisi kullanımıyla makromoleküllerin etkili bir şekilde iletildiğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin elektroporasyon ve lipofeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer yöntemlerle etkili bir şekilde iletilemeyen zorlu hücre tiplerini ve materyalleri hedefleyebilmesidir. Bu yöntem, hücre yeniden programlamanın nasıl geliştirileceği gibi biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Sistem, anti-tümör etkinliğini artırmak için bağışıklık hücrelerinin manipülasyonuna olanak tanıdığından, bu tekniğin etkileri kanserin tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır.

Başlamak için, burada gösterilen ve beraberindeki metin protokolünde detayları listelenen mikroakışkan cihazı, cihaz tutucuyu, plastik sıvı rezervuarlarını ve O-ringleri üretin veya satın alın, ardından üç adet sızdırmaz kabı kısmen %70 ethanol ile doldurun. Cihazları birinci kaba, rezervuarları ve O-ringleri ikinci kaba ve tutucuları ise üçüncü kaba yerleştirin. Daha sonra kapların geri kalanını %70 ethanol ile doldurun.

Ardından, rezervuarları ve O-ringleri içeren kabı ve tutucuları içeren kabı, kullanmadan önce beş ila 10 dakika boyunca bir ultrasonik banyoya yerleştirin. Bu işlem, önceki deneylerden kalan kontamine partiküllerin temizlenmesine yardımcı olacaktır; bileşenler sonikasyona tabi tutulurken çalışma alanını bir biyogüvenlik kabini içinde %70 etanol ile silerek temizleyin. Daha sonra, üç kap ve bir cımbız çifti dahil olmak üzere gerekli tüm malzemeleri %70 etanol ile silerek sterilize edin ve montaja başlamak için bunları biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.

İlk olarak, çalışma alanına iki ila üç adet düşük havlı temizleme bezi yerleştirin. Ardından, plastik rezervuarları cımbızla etanol kabından çıkarın ve etanolün iç yüzeyinden emilmesini ve buharlaşmasını kolaylaştırmak için bezlerin üzerine koyun. Etanol çözeltisinin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için rezervuarlara hafifçe vurun.

Gerekirse, rezervuarı tamamen temizlemek için basınçlı gaz kullanın. Rezervuarlar kuruduktan sonra, O-ringleri rezervuarlardaki uygun yuvalara yerleştirin. Ardından, çipi cımbız yardımıyla yüzü yukarı bakacak şekilde cihaz tutucusuna yerleştirin.

Çipin tutucuda düz bir şekilde durduğundan emin olun ve gerekirse cımbız yardımıyla ayarlayın. Cihaz tutucuna düzgünce oturmazsa, sonraki adımlar sırasında kırılma riski oluşur. Ardından, rezervuarları nazikçe tutucunun üzerine yerleştirin ve klipslerle hizalayın.

O-ringlerin yuvalarından çıkmadığından emin olun. Bu işlem sırasında, rezervuarlar yerine oturup tık sesi gelene kadar hafifçe aşağı bastırın. Rezervuarların her iki tarafının da sabitlendiğinden ve çipin doğru konumda göründüğünden emin olun.

Rezervuarlara aşırı kuvvet uygulayarak bastırmayınız. Uygulanan basınç, primer hücreler veya adezyon hücre hatları için kullanılan çipleri kırabilir. Hücrelerin deneyden bir ila iki gün önce ekilmesi ve konfluens oranlarının %80'i geçmemesi sağlanmalıdır.

Deney günü. Deneyden hemen önce hücreleri hasat edin ve mililitrede 1 ile 10 milyon hücre olacak şekilde besiyerinde veya istenen diğer bir tampon çözeltide süspande edin. Ardından, hücre kümelerinin ve matrisin cihazı tıkamasını önlemek için hücre süspansiyonunu dikkatlice 40 mikronluk bir hücre süzgeç ağından geçirin.

Süzme işlemi tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunun 300 mikrolitresi, istenen konsantrasyondaki taşıyıcı materyal ile ayrı bir tüpte karıştırıldı. Bu gösterim için, 50 mikrolitre hücre süspansiyonu başına 5 mg/mL konsantrasyonda iki mikrolitre dekstrin ve iki mikrolitre Alexa 488 izotop kontrol antikoru eklenmiştir.

Ardından, 100 µL hücreyi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın. Daha sonra, jel yükleme uçları kullanarak hücreleri ve iletim materyalini rezervuarlardan birine pipetleyin, doldurulan rezervuara basınç hortumunu bağlayın ve sızdırmazlığı sağlamak için düğümü elinizle sıkın. Sonra, hücrelerin cihaz içindeki ilerleme hızını kontrol etmek için regülatör üzerindeki hava basıncını 70 PSI değerine ayarlayın.

Basınç, her deneyde kullanılan spesifik hücre ve mikroakışkan çip kombinasyonu için optimize edilmelidir. Her şey hazırlandıktan sonra, cihazı göz hizanıza kaldırın ve rezervuardaki sıvının kolayca görülebileceği şekilde yönlendirin. Ardından, rezervuru basınçlandırmak ve hücre akışını başlatmak için basmalı butonlu valfe basın.

Sıvının rezervuardan akış hızını gözlemleyin. Eğer sıvı, başlangıç akış hızına kıyasla önemli ölçüde yavaşlarsa, takılı olan cihaz muhtemelen tıkanmıştır ve değiştirilmesi gerekir. Tıkanıklığın neden olduğu artmış kayma kuvveti, normalden daha fazla hücre ölümüne yol açacaktır.

Sıvı seviyesi rezervuar tabanından yaklaşık iki milimetre uzağa geldiğinde, akışı durdurmak için regülatörü hızlıca sıfır PSI konumuna getirin. Rezervuar boşalmadan önce hava akışını durdurmak önemlidir, aksi takdirde numune toplama rezervuarından dışarı atılabilir. Ardından, işlem görmüş hücreleri çıkış rezervuarından toplayın ve bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Oda sıcaklığında, işaretlenmiş hücreler 10 dakikaya kadar materyal almaya devam edecektir. 10 dakika sonra, hücreleri ek besiyeri ile plakaya aktarın veya deneysel ihtiyaçlara göre hücreleri kullanmaya devam edin. Gereken miktarda işlem görmüş hücre toplamak için bu adımları tekrarlayın; çipler tıkanırsa gerektiğinde değiştirin ve sonraki her örnek için tıkanmış cihazları atın.

Tıkanma etkilerini en aza indirmek için akış yönünü değiştirin. Hücre toplama işlemi tamamlandığında, klips kollarını yana iterek rezervuarları ana tutucudan nazikçe ayırın. Ardından, yeniden kullanılacak her parçayı uygun saklama kabına yerleştirin ve içlerini taze %70 ethanol ile doldurun.

Son olarak, kullanılan tüm çipleri uygun şekilde bertaraf edilmek üzere ayrı bir kaba yerleştirin. HeLa hücrelerinin iletim verimliliği ve hücre canlılığı ölçülmüştür. Bir dizi deneyin ardından, üç farklı mikroakışkan çip 600 millimeters per second'e kadar olan hız aralıklarında test edilmiştir.

Bu testler, test edilen çiplerin her biri için akış hızının artırılmasının, floresan konjugeli üç kilodaltonluk dekstrinin hücrelere iletimini iyileştirdiğini göstermiştir. Ek olarak, hız artışı test edilen cihazlarda hücre canlılığının yaklaşık %20 oranında düşmesine neden olmuştur. Bu miktardaki hücre ölümü nispeten düşüktür ve uygun şekilde tasarlanmamış cihazlarda genellikle çok daha yüksektir.

Solda gösterilen kontrol hücre popülasyonuna Pacific blue konjuge dekstrin alımı, sınırlı yüzey bağlanması ve endositik etkilerin bir sonucudur. Hücreler, taşınan materyale işlem görmüş hücrelerle aynı süre boyunca maruz bırakılmıştır. Sağda ise kontrol hücreleriyle aynı dekstrin konsantrasyonuna maruz kalırken mikroakışkan cihazdan geçen canlı hücre popülasyonu yer almaktadır.

Gölgeli bölgedeki hücreler iletilmemiş, çizginin sağındaki hücreler ise iletilmiş olarak kabul edilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından; iletim verimliliği ve malzeme işlevselliği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, optimizasyon sonrası diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların, doğrudan protein iletimini kullanarak yetişkin primer hücrelerde hücre programlamasını incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kendi uygulamanız için kendi kendini sıkan (self-squeezing) sistemi nasıl kuracağınız ve çalıştıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.