Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Düşen deneyin genel amacı, mekanik bozulma kullanarak hedef hücrelere makromolekülleri vektörsüz olarak ulaştırmaktır. Bu, önce hedef hücre tipinin istenen dağıtım malzemesi ile süspansiyon halinde yerleştirilmesi ve özel olarak tasarlanmış bir mikroakışkan cihazın rezervuarına yüklenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, mikroakışkan cihaz basınçlandırılır ve hücreler, geçici zar bozulmasını kolaylaştırmak için hücreleri sıkıştıran bir dizi mikroakışkan kanaldan geçirilir.

Daha sonra, materyalin hücre sitoplazmasına difüzyonla taşınmasını kolaylaştırmak için hücrelerin hedef dağıtım materyalinin varlığında inkübe edilmesine izin verilir. Hücre zarı tamir edilirken. Akış sitometrisi kullanılarak makromoleküllerin etkili bir şekilde verildiğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin ation ve lipo mükemmelliği gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, diğer yöntemlerle etkili bir şekilde verilemeyen zorlu hücre tiplerini ve materyallerini ele alabilmesidir. Bu yöntem, hücre yeniden programlamasının nasıl geliştirileceği gibi biyolojik alandaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin etkileri, kanserin tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü sistem, anti-tümör etkinliklerini artırmak için bağışıklık hücrelerinin manipülasyonunu sağlar.

Başlamak için, burada gösterilen ve beraberindeki metin protokolünde ayrıntılarla listelenen mikroakışkan cihazı, cihaz tutucuyu, plastik sıvı rezervuarlarını ve O-ringleri imal edin veya satın alın, ardından üç sızdırmaz kabı kısmen %70 etanol ile doldurun. Cihazları birinci kaba, rezervuarları ve O-ringleri ikinci kaba ve tutucuları üçüncü kaba yerleştirin. Ardından kapları geri kalan kısmında% 70 etanol ile doldurun.

Bir sonraki yer, rezervuarları ve O-ringleri içeren kabın yanı sıra, kullanmadan önce beş ila 10 dakika boyunca bir ultrason banyosunda tutucuları içeren kap. Bu, önceki deneylerden herhangi bir kirletici parçacığın çıkarılmasına yardımcı olurken, bileşen sonikat çalışma alanını% 70 etanol içeren bir biyogüvenlik kabininde siler. Ardından, üç kap ve bir cımbız da dahil olmak üzere gerekli tüm malzemeleri %70 etanol ile silerek sterilize edin ve montaja başlamak için biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.

İlk olarak, çalışma alanına iki ila üç düşük tüy bırakan mendil koyun. Daha sonra plastik rezervuarları etanol kabından cımbızla çıkarın ve etanolün iç yüzeyinden fitillenmesini ve buharlaşmasını kolaylaştırmak için mendillerin üzerine yerleştirin. Etanol çözeltisinin çıkarılmasına yardımcı olmak için rezervuarlara hafifçe vurun.

Gerekirse, rezervuarı tamamen boşaltmak için basınçlı gaz kullanın. Rezervuarlar kuruduktan sonra, O-ringleri rezervuarlardaki uygun yuvalara yerleştirin. Ardından, çipi yüzü yukarı bakacak şekilde cihaz tutucusuna yerleştirmek için cımbız kullanın.

Çipin tutucuda düz durduğundan emin olun ve gerekirse cımbız kullanarak ayarlayın. Cihaz tutucusuna tam olarak oturmazsa, sonraki adımlarda kırılma riski vardır. Ardından, rezervuarları yavaşça tutucuya yerleştirin ve klipslerle hizalayın.

O-ringlerin yuvalarından düşmediğinden emin olun. Bu işlem sırasında, yerine oturana kadar rezervuarlara hafifçe bastırın. Rezervuarların her iki tarafının da sağlam olduğundan ve çipin doğru konumda göründüğünden emin olun.

Rezervuarlara aşırı kuvvet uygulayarak bastırmayın. Basınç, birincil veya yapışma için talaşları kırabileceğinden. Hücre hatları, hücreleri deneyden bir ila iki gün önce, %80'den fazla birleşmeyecek şekilde yerleştirin.

Deney gününde. Deneyden hemen önce, hücreleri toplayın ve yeniden canlandırın, bunları mililitre başına bir ila 10 milyon hücre arasında bir ortamda veya istenen başka bir tamponda askıya alın. Ardından, hücre kümelerinin ve matrisin cihazı tıkamasını önlemek için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgeç ağından dikkatlice geçirin.

Süzüldükten sonra, 300 mikrolitre hücre süspansiyonunu ayrı bir tüpte istenen konsantrasyonda dağıtım materyali ile karıştırın. Bu gösteri için, mililitrede beş miligramda iki mikrolitre dekstrin ve iki mikrolitre Alexa. 4 50 mikrolitre hücre süspansiyonu başına 88 izotop kontrol antikoru eklenir.

Ardından, 100 mikrolitre hücreyi pipetleme ile nazikçe karıştırın. Daha sonra jel yükleme uçlarını kullanarak, hücreleri ve dağıtım malzemesini rezervuarlardan birine pipetleyin, doldurulmuş rezervuara basınçlı boru takın ve uygun tavanı sağlamak için düğümü parmakla sıkın. Ardından, hücrelerin cihazdan geçme hızını kontrol etmek için regülatördeki hava basıncını 70 PSI'ye ayarlayın.

Basınç, her deneyde kullanılan spesifik hücre ve mikroakışkan çip kombinasyonu için optimize edilmelidir. Her şey hazırlandıktan sonra, cihazı göz hizasına kaldırın ve rezervuardaki sıvının kolayca görülebileceği şekilde yönlendirin. Ardından, rezervuarı basınçlandırmak ve hücre akışını başlatmak için basmalı düğme valfine basın.

Sıvının rezervuardan akma hızını izleyin. Sıvı, ilk akış hızına göre önemli ölçüde yavaşlarsa, monte edilen cihaz muhtemelen tıkanmıştır ve değiştirilmesi gerekir. Tıkanıklığın neden olduğu artan kayma, normalden daha fazla hücre ölümüne neden olacaktır.

Sıvı seviyesi rezervuarın dibinden yaklaşık iki milimetre uzakta olduğunda, akışı durdurmak için regülatörü hızlı bir şekilde sıfır PSI'ye çevirin. Rezervuar boşaltılmadan önce hava akışını durdurmak önemlidir, aksi takdirde numune toplama haznesinden dışarı atılabilir. Daha sonra tedavi edilen hücreleri çıkış rezervuarından toplayın ve bunları bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Oda sıcaklığında, nominal hücreler 10 dakikaya kadar malzeme almaya devam edecektir. 10 dakika sonra, hücreleri ek ortamla kaplayın veya deneysel ihtiyaçlara göre hücreleri kullanmaya devam edin. İhtiyaç duyulduğu kadar çok sayıda işlenmiş hücre toplamak için bu adımları tekrarlayın ve sonraki her numune için C tıkalı cihazları tıkarlarsa ve atarlarsa çipleri gerektiği gibi değiştirin.

Tıkanma etkilerini en aza indirmek için akış yönünü değiştirin. Hücreleri toplamayı bitirdiğinizde, klips kollarını kenara iterek rezervuarları ana tutucudan yavaşça ayırın. Daha sonra yeniden kullanılacak her bir parçayı uygun saklama kabına koyun ve üzerlerini taze %70 etanol ile doldurun.

Son olarak, kullanılmış tüm cipsleri uygun şekilde imha etmek için ayrı bir kaba koyun. Hela hücrelerinin iletim etkinliği ve hücre canlılığı ölçüldü. Bir dizi deneyin ardından, üç farklı mikroakışkan çip, saniyede 600 milimetreye kadar bir hız aralığında test edildi.

Bu testler, artan akış hızlarının, test edilen çiplerin her biri için hücrelere floresan olarak konjuge üç kilodalton dekstrinin verilmesini iyileştirdiğini gösterdi. Ek olarak, artan hızlar, test edilen cihazlarda hücre canlılığının yaklaşık% 20 oranında düşmesine neden oldu. Bu hücre ölümü miktarı nispeten düşüktür ve uygun olmayan şekilde tasarlanmış cihazlarda genellikle çok daha yüksektir.

Pasifik mavisi konjuge dekstrinin solda gösterilen kontrol hücresi popülasyonuna alımı, sınırlı yüzey bağlanması ve endositik etkilerin sonucudur. Hücreler, tedavi edilen hücrelerle aynı süre boyunca dağıtım materyaline maruz kaldığından. Sağda, kontrol hücreleri ile aynı dekstrin konsantrasyonuna maruz kaldıklarında mikroakışkan cihazdan geçen canlı hücrelerin popülasyonu bulunmaktadır.

Gölgeli bölgedeki hücreler teslim edilmemiş olarak kabul edilir ve çizginin sağındaki hücreler teslim edildi olarak tanımlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir saatin altında tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, geliştirildikten sonra teslimat verimliliği ve malzeme işlevselliği gibi ek soruları yanıtlamak için diğer yöntemler, ömür boyu optometri yapılabilir.

Bu teknik, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların, doğrudan protein dağıtımı kullanarak yetişkin birincil hücrelerde hücre programlamasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, istediğiniz uygulama için kendi kendine sıkma sistemini nasıl kuracağınızı ve çalıştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.