Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Bir mikropipeti, ilgilenilen geni taşıyan plazmit vektörleri ve bir izleme boyası içeren bir DNA karışımı ile doldurun. Bir mikromanipülatöre sabitleyin.

Mikroskop altına bir agaroz bloğu yerleştirin ve üzerine kortikal internöronları olan agaroza gömülü bir fare embriyonik beyin dilimi yerleştirin.

Mikropipeti indirin ve DNA karışımını internöron progenitör bölgesine enjekte edin. İzleme boyası enjeksiyon bölgesini işaretler.

Bir Petri kabı elektroduna başka bir agaroz bloğu ve kapak elektroduna bir agaroz sütunu yerleştirin.

Dilimi bloğa aktarın ve kapak elektrodunu enjeksiyon bölgesi üzerine hizalayın.

Hücre zarlarını geçici olarak geçirgen hale getirmek için kısa elektrik darbeleri uygulayın ve plazmitlerin çekirdeğe girmesine izin verin.

Hücre canlılığını korumak için dilimi bir ortamda inkübe edin.

Çekirdeğin içinde, plazmit gen ekspresyonunu tetikler, hedef proteini üretir ve nöronlar arası progenitör fonksiyonlarını modüle eder.

Enjeksiyon için, ekspresyon ve kontrol vektörü DNA'sını her vektör için mikrolitre başına 1 mikrogram konsantrasyonda karıştırın ve 1 ila 10'luk bir seyreltmede hızlı yeşil stok çözeltisi ekleyin. Çekilmiş 0,5 milimetre iç çaplı, 1 milimetre dış çaplı cam mikropipeti 10 mikrolitre DNA karışımı ile doldurun ve mikropipeti pnömatik bir piko pompa enjektörüne yükleyin. Daha büyük agaroz bloğunu bir stereomikroskop altına yerleştirin ve enjekte edilecek dilimi agaroz parçasının üzerine yerleştirin.

Daha sonra, dilimin seçilen medial ganglionik veya kaudal ganglionik eminens bölgesine 25 ila 50 nanolitre hacim enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, küçük agaroz bloğunu Petri kabı elektroduna yerleştirin ve agaroz kolonunu mobil kapak elektroduna takmak için düz uçlu bir mikro spatula kullanın.

Enjekte edilen dilimi destek zarı ile agaroz bloğuna aktarın ve agaroz sütunu ile üst elektrodu dilimin seçilen bölgesinin üzerine yerleştirin. Daha sonra bölgeyi 500 milisaniye arayla 125 voltluk iki adet 5 milisaniyelik darbeyle elektrolizle kaplayın. Elektroporasyondan sonra, dilimi destek zarı ile birlikte tekrar tutma kabına yerleştirin ve kabı doku kültürü inkübatörüne geri koyun.