Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Bu prosedürün amacı, fare embriyonik, koklea exvivo'yu kültürlemek ve elektro çalıştırmaktır. Morfogenez farklılaşması ve büyüme olayları da dahil olmak üzere koklear gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için, bu, önce 13. günlük bir embriyonik fare embriyosundan başın elde edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, beyni çıkararak iç kulakları açığa çıkarın ve kafatasının tabanından ayrılarak gelişmekte olan temporal kemikten izole edin.

Daha sonra üstteki kıkırdağı çıkarın ve koklearın duyusal epitelini elde etmek için koklear kanalı açın. Son adım, diseke edilen koklearın bir haftaya kadar elektroporasyonlu veya elektroporasyonsuz kültürlenmesidir. Sonuç olarak, implantlar canlı hücre görüntüleme veya sabit immün boyama için analiz edilebilir ve konfokal görüntüleme ile analiz edilebilir, Fare embriyonik kültürü.

Koklear explan, gelişmekte olan kokleadaki proliferasyon, sülfat spesifikasyonu ve polarite gibi organogenezin çeşitli yönlerini ve bu olayların büyüme ve farklılaşmaya nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için mükemmel bir sistem sağlar. Dolayısıyla bu teknik, farmakolojik manipülasyonların yapılmasına ve gen fonksiyonlarının ex vivo olarak izlenmesine izin verir. Ve böylece bu teknik, elektroporasyon yoluyla gen transferi ile birleştiğinde, ilgilenilen genin ifadesini değiştirebilir ve işlevini tek bir hücre düzeyinde izleyebilir.

Bu işleme başlamak için, bir E 13 fare embriyo kafasını soğuk diseksiyon solüsyonu içeren steril bir sogar kabına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, göz bölgesinin etrafına küçük ayrıntılar yerleştirerek embriyo başını hareketsiz hale getirin. Daha sonra iki çift steril forseps kullanarak, cildi dikkatlice çıkarın ve kafatasını orta hat boyunca sırt tarafında açın.

Bundan sonra, beyni kraniyal boşluktan çıkarın. Temporal kemiklerin içinde yer alan iç kulaklar, etraflarındaki kan damarının astarından tanımlanabilir. Daha sonra, forsepsleri dokunun altına yerleştirerek ve iç kulağı kafatasının tabanından izole ederek iç kulakları temporal kemiklerden ayırın.

Daha sonra, diseke edilmiş iç kulakları soğuk diseksiyon solüsyonu içeren yeni bir kaba aktarın. Şimdi iç kulağı ventral taraf yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Minuchin pimlerinin keskin ucunu vestibüler kısımdan nazikçe sokarak iç kulağı stabilize edin.

Ultra ince forseps kullanarak, oval pencerenin yakınında bir kesi yaparak üstteki kıkırdağı kesin. Forsepslerin kıkırdağa çok derine yerleştirilmediğinden emin olun, çünkü üstteki kıkırdak bazen koklear kanal ile kaynaşır. Ardından kıkırdağı kokleardan dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, forsepsleri koklear kanalın tabanına veya tepesine yerleştirerek duyusal epiteli açığa çıkarın ve koklearın çatısını yavaşça dışarı çekin. Son adım olarak, koklear ekplanın tabanı düz olacak şekilde altta yatan bağ dokusunu açıkta kalan duyusal epitelden dikkatlice çıkarın. Bundan sonra, disseke edilen koklearı iç kulağın vestibüler kısmından izole edin.

Diseke edilmiş koklear duyusal epiteli, 1,5 milimetrelik steril bir kepçe kullanarak bazal membran matrisi Kaplanmış kültür kuyusuna aktarın, eğer ekstra dokuyu çıkarmak için daha fazla temizlik gerekiyorsa, bu aşamada gerçekleştirilebilir. Daha sonra koklear ekplanyonu, epitelin lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Dokuyu dikkatlice düzleştirmek için bazal membran matris DMEM solüsyonunu aspire edin ve tabağa yavaşça 150 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin.

Her bir x explan a'nın kaplanmış cam kapak kızağına iyi bir şekilde yapıştığından ve kültür ortamında yüzmediğinden emin olun. Daha sonra, mikro diseke koklearı nazikçe 150 milimetrelik steril bir kültür kabına aktarın ve bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Üç ila altı DIV için% 37 karbondioksit ile 5 santigrat derece.

1D'den sonra IV. Koklear ekplanın kültür kabına iyi yapıştığından emin olmak için kültürü diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Daha sonra, elektroporasyon için ayarlamak üzere immünohistokimya için işlemeden önce kültürü istenen süre boyunca in vivo olarak inkübe etmeye devam edin. İlk olarak, 100 milimetrelik puro kaplı bir cam tabağı otoklavlayarak veya% 70 etanol içinde yaklaşık 20 dakika bekleterek sterilize edin.

Daha sonra kullanmadan önce temiz bir tezgahta kurumaya bırakın. Şimdi uygun bir maxi veya MIDI hazırlık kiti kullanarak tercih edilen bir ekspresyon vektöründen DNA hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ifade vektörleri, bir H bir ifade yapısı ve nöro D bir ifade yapısıdır.

Ve DNA'nın nihai konsantrasyonu, steril DNA RNA'larında mikrolitre başına en az bir mikrogram olmalıdır, DNA'yı enik koklear ekşame elektro olarak çalıştırmak için serbest su. 100 milimetrelik puro kaplı taze bir tabağa 10 mikrolitre plazma DNA çözeltisi ekleyin. Daha sonra, tamamen diseke edilmiş bir koklear ekzyonu, epitelin lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde DNA çözeltisine aktarın.

Koklearı, yemeğin düzlemine dik olacak şekilde hafifçe eğin. Ardından, elektrotatörü kullanarak negatif elektrot kanatçığını duyusal epitele doğru ve pozitif elektrot kanatçığını koklear tabanın yanına yerleştirin. 24 milivolt 30 milisaniye darbe süresinde dokuz ila 10 darbe verin.

Daha sonra, elektro dereceli kokleara 100 mikrolitre ılık kültür ortamı ekleyin. Elektro dereceli kokleayı kaplama için bazal membran matris kaplı çanağa aktarmadan önce tüm koklear ekzit ve ilgilenilen tüm genlerin DNA'sı için prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra, tüm elektro dereceli kokleaları istenen süre boyunca 37 santigrat derece% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde kültürleyin ve daha sonra immünosito kimyası için işlenecektir.

Bu görüntüler, bir TH olan, EEG FP veya nöro D bir EGFP Reporter yapıları ile elektroporasyona tabi tutulan vahşi tip CD one fare barlarından elde edilen embriyonik gün 13 koklear implantları göstermektedir. Saç hücresine özgü belirteç, anti myo yedi A veya kırmızı renkte iki ila bir nöronal belirteç ile immünografik olarak etiketlendiler. EGFP ekspresyonu ile görselleştirilebilen elektro dereceli hücreler, daha büyük epitel sırtı, daha küçük epitel sırtı ve duyusal epitel hücreleri boyunca görülür.

Nöro D bir, beş DIV'den sonra transfekte koklear epitel hücreleri, çoğu bir veya bir T oh H olan dendritik süreçlerle nöronal fenotipi elde ettikten sonra elde etti. Transfekte edilen hücreler myo yedi için pozitifti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sekiz ila 10 patlama istihbarat litresi için üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu, diseksiyon kültürü, elektroporasyon ve eksürünün kaplanması için yeterli zaman sağlayacaktır.