Name: Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Keşfedin, fare embriyonik koklear eksplantlarını kültüre alma ve elektroporasyonla gen transferi yöntemini. Bu teknik, iç kulak gelişimi ve gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol hakkındaki yorumları için Dr. Bradley Schulte'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R00 (5R00DC010220) tarafından desteklenmiştir. Bu proje, Grant C06RR014516 tarafından desteklenen yenilenmiş bir laboratuvar alanında gerçekleştirilmiştir.

NOT: canlı hayvanlar kullanarak tüm protokolleri gözden ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve resmi laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yöntemler onaylı takip gerekir gerekir. Bütün tahlil temiz bir laminer akış tezgahı üzerinde, steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır. Eldiven ve maske, istenirse, bu işlem sırasında giyilmelidir. Embriyonik Fare İç Kulak 1. Diseksiyon <ol><li> Corti eksplant kültürlerin organ için ayarlama: <ol><li> Yaklaşık 30 dakika, UV ışık yakarak laminer akış doku kültürü kapağı sterilize ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bir yüzeyin dezenfekte edilmesi. Buna ek olarak, ince diseksiyon araçları ve otoklav yoluyla embriyo diseksiyon veya kullanımdan önce en az 20 dakika süreyle% 70 etanol iliklerine Sylgard kaplı yemekleri dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletleri sterilize. Temiz bir laminer akış clea hava kurumaya yemekleri ve araçlar% 70 etanol dökün ve izinn tezgah kullanmadan önce. </li><li> Hazırlama steril Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) / (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), HEPES 10x HBSS ve% 0.5% 10 eklenmesi ve yaklaşık pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın ve filtre sterilizasyonu ile (HEPES) karışımı 4 ° C&#39;de, nihai çözelti saklayın. Daha iyi prosedür boyunca doku korumak için soğutulmuş HBSS / hepes çözeltisi içinde tüm diseksiyonları uygulayın. </li><li> 15 ml&#39;lik steril bir polipropilen tüp içinde taban membran matrisi bir 300 ul&#39;lik bölüntü, steril (4 ° C) soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 5 ml ilave etmek suretiyle taban membran matrisi ile kaplayın cam alt yemekler. Içeriğini vorteks ile karıştırın ve kasesinin ortasına kadar mevcut tüm kültür kapsar, böylece her bir kültür kabı merkezine bazal membran matris DMEM karışımından 150 ul ilave edin. Kullanımdan önce en az 45 dakika süre ile 37 ° C inkübatör yemekleri ve mağaza örtün. </li><li> Th içine HBSS soğutulmuş 4-5 ml dökünSteril polistiren petri kapları REE ve kaput kapalı bırakın. </li><li> DMEM 9 ml N2 takviyeleri 100 ul, 10 ug / ml Cipro ve FBS, 1 ml ilave edilerek steril bir 15 ml&#39;lik polipropilen bir tüp içinde kültür ortamı hazırlanır. </li></ol></li><li> Embriyoların izole edilmesi: NOT: embriyonik farelerden alınan koklear eksplantlarm Bu prosedürde, hasat iç kulaklar embriyonik gün (E) den gübreleme gün sonra 13 temporal kemik E1 9 olarak kabul ediliyor. protokol de E12 dan E18 başlayan embriyonik fare iç kulakları ile kullanılabilir. <ol><li> CO 2 ile zamanlanmış gebe fare Euthanize ve servikal dislokasyon veya uygun onaylanmış protokoller ile hayvan kurban. Doku kültürü odasında sterilite korumak için uzak laminer akış doku kültürü kaputu gelen euthanization yürütmek. </li><li> Yukarı bakacak şekilde karın kağıt havlu üzerine ötenazi fare koyun ve% 70 etanol ile karın dezenfekte edin. </li><li> Cildi kapma karın boşluğu açınBaşka bir el kullanılarak makas ile orta hat boyunca kavisli bir eliyle forseps ve kesme epidermis ve kas ile. Her iki tarafta iki dik kesim yapmak ve forseps ile bilateral uterin boynuz kaldırarak dikkatle rahim çekin ve bağ dokusu kullanılarak makas altından ayırmak. </li><li> Laminer akışlı temiz bir tezgah soğutulmuş diseksiyon çözeltisi (HBSS / hepes karışımı) ve transfer ihtiva eden bir petri tabağına embriyonik zinciri yerleştirin. </li><li> Plasenta dikkatlice embriyolar çıkarın ve diseksiyon çözeltisi içeren steril Petri kapları birine yerleştirin. Çözüm kanlı dönerse, yeni bir Petri kabı taşıyabilirsiniz. NOT: Bu noktada, embriyolar, bir Theiler evreleme kılavuzunu kullanarak sahnelenecek edilebilir. </li><li> Temiz forseps veya makasla ile boyun bölgesinde kısma embriyolar başını kesmek ve soğutulmuş diseksiyon çözeltisi içeren taze Petri kabındaki başkanları yerleştirin. </li></ol></li><li> İç kulak Diseksiyon: <ol><li> Yeri oSoğuk diseksiyon içeren bir steril sylgard çanak ne embriyo baş </li><li> Çözelti. ~ 1.6x bir büyütmede bir mikroskop altında çalışarak, göz bölgesi (Şekil 1A) etrafında ya da daha yakın Minutien işaretçilerini yerleştirerek embriyo baş hareketsiz. </li><li> Steril forseps iki çift kullanarak dikkatli bir şekilde cilt kaldırmak ve orta hat (Şekil 1B) boyunca sırt tarafında kafatasını açmak. Kranial kavite ve temporal kemiklerin içinde yer alan iç kulaklar, bu aşamada (Şekil 1C, D) tespit edilebilir beyni çıkarın. Genellikle, iç kulak çevresine mevcut kan damarı, astar, bu aşamada (Şekil 1D), iç kulak belirlemek için bir işaret olarak kullanılabilir. </li><li> Dokuda altına forseps yerleştirerek ve soğuk diseksiyon çözüm içeren yeni bir çanak kafatası ve transfer tabanından iç kulak izole ederek zamansal kemiklerden iç kulak incelemek (Şekil 1E, F). </li></ol></li></ol> Corti Eksplant Kültürler Organ 2. Nesil NOT: Bu gelişme aşamasında, doku kıkırdak ve kolayca forseps kullanılarak disseke edilebilir. <ol><li> Orient ventral yüzü (Şekil 2A) yukarı bakacak ve yavaşça iç kulak (Şekil 2B) vestibüler bölümü ile Minutien pim keskin ucunu takarak iç kulak stabilize böylece iç kulak. </li><li> Kullanımı ultra ince forseps koklea (Şekil 2C) kıkırdak kaldırmak dikkatlice oval pencereye yakın forseps bir ucunu kullanarak ve bir kesi yaparak örten kıkırdak kesip. NOT: Bu örten kıkırdak bazen altına kazıma ile altta yatan koklear kanal gelen kıkırdak serbest bırakmak için kapalı forseps kullanmak yararlı olduğu durumda koklear kanal ile kaynaşmış olarak forseps kıkırdak içine çok derin takılı olmadığından emin olmak için önemlidir sKıkırdak, sert bir yere. Bu gelişme aşamasında, koklear spiral uzunluğu bir dönüş sadece dörtte üçü olduğunu. </li><li> Sonraki baz ya da çok apeks de ya koklear kanal tercih edilen bölgede forseps koyarak duyusal epitel maruz ve yavaşça koklea (Şekil 2B) çatısı çekerek. NOT: Kokleanın çatı o analizini engelleyen duyusal epitel maske gibi tamamen kaldırılmalıdır. NOT: duyusal epitel gözyaşı kolay olduğu gibi bu işlem nazikçe yapılmalıdır. </li><li> Koklear eksplant tabanı eşit düz böylece son adım olarak, dikkatle maruz duyusal epitel yatan bağ doku kaldırmak. </li><li> Forseps kullanarak iç kulak vestibüler kısmından disseke koklea izole edin. Bu, daha önce ya da aşama 2.4 (Şekil 2E) sonra gerçekleştirilebilir. </li><li> Bir bodrum membra içine disseke koklear duyusal epitel aktarınne matris kaplı kültür de bir 1,5 mm steril scooper (Şekil 2F) kullanılarak. </li><li> Orient epitel lümenal yüzeyi ile koklear eksplant yukarı bakacak ve dikkatle doku dümdüz ve hafifçe çanak ekleyerek taze kültür ortamı 150 ul ile değiştirmek için bazal membran matris-DMEM çözüm aspire. Bakım, her eksplant kaplamalı cam lamel iyi yapışır ve kültür ortamı içinde yüzen olmadığından emin olmak için alınmalıdır. Koklear eksplant zarar vermemek için cam kuyuya yapıştırılması sırasında forseps ucu kadar sivri olduğundan emin olun. </li><li> Yavaşça İstenilen bir zaman, in vitro olarak, genellikle 3-6 gün (DIV),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir steril 150 mm kültür çanağı ve yerine kültür kaplarına transfer. 1 DIV sonra, koklear eksplant kültürü çanak iyi yapışmış emin olmak için bir mikroskop altında kültürleri incelemek. </li><li> Sonrasıistenen zaman uzunlukları için in vitro cubation, kültürler imünohistokimya için işlenir. Not: eksplant kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler, immünohistokimya gibi, daha aşağıda uygulama (Şekil 3B) için işlenebilir, RT-PCR, in situ hibridizasyon ve / veya Western blot. </li></ol> 3. Elektroporasyon aracılı gen transferi <ol><li> Elektroporasyon için ayarlama: <ol><li> Otoklavda veya yaklaşık 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatılarak bir 100 mm Sylgard kaplı cam tabak sterilize ve kullanımdan önce temiz bir tezgah içinde kurumaya bırakın. </li><li> Uygun maksi veya Midi-prep kitleri kullanılarak seçim bir ifade vektörü DNA hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ifade vektörleri pIRES2-Atoh1.EGFP ve pCLIG-NeuroD1.EGFP vardır. DNA nihai konsantrasyon steril DNA, en az 1 ug / ul olmalıdır /RNAse içermeyen su. </li></ol></li><li> Embriyonik koklear eksplantlarından içine DNA electroporating: <ol><li> Taze 100 mm Sylgard kaplı çanak plazmid DNA çözeltisinin 10 ul ekle ve DNA çözeltisi (adım 2.5 de elde edilmiş), tam kesilmiş koklear eksplant aktarın. </li><li> Çanak düzlemine dikey olacak şekilde yukarı bakacak şekilde epitelyum lümenal yüzeyi ile hafifçe koklea yatırın. </li><li> Duyusal epiteli ve koklea tabanına bitişik bulunan pozitif raket (anot) doğru negatif kürek (katot) ile koklea iki tarafında elektrot kürekler yerleştirin. Not: DNA, negatif yüklü olduğu için, pozitif elektrot ve duyu epitel bitişik sonda katot ucuna yerleştirilerek negatiften göç; DNA, çoğunlukla duyusal epitel yüzeyine geçer. </li><li> Elektro-kullanma, 24 mV 9-10 darbeler teslim, t ayak pedalı ile 30 msn darbe süresiO Electroporator ve ardından Electroporated cochlea&#39;ya sıcak kültür ortamı 100 ul ekleyin. </li><li> Tekrar tüm koklear eksplant ve ilgi tüm genlerin DNA için 3.2.1-4 adımları ve (adım 2.7) kaplama için bazal membran matris kaplı çanak içine electroporated cochleae aktarın. Daha sonra, bağışıklık kimyası için işlenecektir arzu edilen bir zaman uzunlukları için 37 ° C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde kültür Electroporated cochleae. NOT: CD1 fare (yaklaşık 8-12 yavru) bütün bir çöp gelen koklea, izole microdissected, Electroporated ve &lt;4 saat içinde kaplama olabilir. </li></ol></li></ol> 4. Analiz Koklear Eksplantın Kültürlerin Not: kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler sabitlenmiş ve immünolojik hücre kimyası için işlendi. <ol><li> Inc istenilen uzunlukta sonraubation, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) &#39;de koklear eksplant yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (PBS içerisinde hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid içinde inkübe edilir. </li><li> 15 dakika boyunca üç kez ekleyerek PBS ile fiksatif yıkayın ve PBS içinde durulayın. </li><li> % 10 keçi serumu içeren PBS-T ile bloke önce 30 dakika için PBS-T (PBS +% 0.5 Tween) ile geçirgenliği. </li><li> 4 ° C de bir gece boyunca,% 1 keçi serumu ile PBS-T ile primer antikor ihtiva eden birincil antikor çözelti içinde inkübe edilir. </li><li> Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor ilave edilmeden önce PBS-T her biri 15 dakika kullanılarak oda sıcaklığında koklea üç kez yıkayın. </li><li> Koklear eksplant cam lamel kültüre olduğundan, çanak lamel izole ve bir slayt monte edilerek tek tek ele alınabilir. Bu, oda sıcaklığında en az 1 saat için çözücü, OS30 kültür çanağı ıslatılmasıyla elde edilebilir. Steril jilet kullanarak, d lamel ayırmakish ve bir slayt monte ve bir floresan mikroskop altında görselleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+development+of+the+organ+of+Corti+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Organotypic development of the organ of Corti in culture.</a> J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes1+is+a+negative+regulator+of+inner+ear+hair+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation.</a> Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).</li>
<li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li>
<li>Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+differentiation+and+DNA+binding+%28Ids%29+regulate+Math1+and+hair+cell+formation+during+the+development+of+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti.</a> J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).</li>
<li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li>
<li>Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hey2+regulation+by+FGF+provides+a+Notch-independent+mechanism+of+maintaining+pillar+cell+fate+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti.</a> Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea.</a> J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press. San Diego. (1995).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).</li>
<li>Torres, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the vertebrate inner ear.</a> Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).</li>
<li>Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+inner+ear+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of inner ear induction.</a> Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).</li>
<li>Puligilla, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+world%E2%80%99s+best+hearing+aid%3B+regulation+of+cell+fate+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+gene+transfer+to+study+the+molecular+physiology+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).</li>
<li>Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+hair+cells+and+support+cells+of+the+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea.</a> Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Dahil olmak üzere, bir fare, iç kulağın membranöz labirent içindeki tüm hücreler duyusal duyunun ve spiral gangliyon nöronlarının her E8 10-14 civarında, ektodermin Beyin bitişiğinde yer otocyst placodally türevi elde edilir. E11 içinde otocyst ventral bölgesi koklear kanal oluşturmak üzere uzanır ve geliştirme devam ederken haline koklea içindeki epitel hücreleri yanı sıra otocyst diğer bölgelerinde bir grup, daha sonra ortaya çıkaracaktır prosensory yamalar olarak belirtilen mechanosensory saç hücreleri ve ...

Corti'nin memeli organı, iki tip mekanosensoriyel tüy hücresinin yanı sıra en az dört tip duyusal olmayan destekleyici hücre de dahil olmak üzere özel hücre tiplerinin bir mozaiğinden oluşur ve bu da onu proliferasyon, kader spesifikasyonu, farklılaşma ve modelleme gibi normal hücresel süreçleri incelemek için ideal bir model sistem haline getirir. Ek olarak, bu farklı hücre tiplerinin normal gelişimi, normal işitme fonksiyonu için çok önemlidir. Bu nedenle, gelişimlerini düzenleyen hem moleküler hem de hücresel faktörleri anlamak çok önemlidir. Bununla birlikte, fare kokleasının küçük boyutu ve erişilemezliği, gen ekspresyonu çalışmaları için özel bir zorluk teşkil etmektedir. Ayrıca, hücre kaderi spesifikasyonu ve modelleme olaylarının çoğu embriyonik zaman dilimlerinde meydana gelir ve çoğunlukla doğumdan önce tamamlanır. Bu nedenle, embriyonik zaman periyotlarında sinyalleşme olaylarının tanımlanması ve karakterizasyonu, koklear morfogenezin moleküler temeli hakkında bilgi edinmek için gereklidir. 
Burada, embriyonik fare iç kulaklarından in vitro olarak sağlam koklea kültürü için bir yöntem gösteriyoruz. Bu tekniğin kullanılmasının ardındaki mantık, kültürlenmiş kokleaların moleküler ve morfolojik özelliklerini korumaları ve böylece potansiyel aday genlerin araştırılması ve koklear morfogenezde yer alan mekanizmaların araştırılması için değerli bir model sağlamasıdır. Transgenik fareler gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabilse de, spesifik gen fonksiyonlarını izlemek için genellikle bir in vitro sisteme ihtiyaç vardır. Ayrıca, transgenik fare embriyolarından koklear kültürler oluşturulabilir, böylece in vitro gelişimleri ve çeşitli çözünür faktörlere ve antagonistlere yanıtları incelenebilir. Bu protokolde 13. gündeki embriyolar (E13) kullanılsa da, E12 veya E14'ten erken postnatal iç kulaklara kadar olan kültürler benzer sonuçlar verebilir. 
Kare dalga elektroporasyonu kullanılarak kültürlenmiş embriyonik koklear eksplantlarda da bir gen transfer tekniği sunuyoruz. Koklear eksplantların izolasyonunu takiben, koklear kanal içindeki tek tek hücrelerde ilgilenilen gen(ler)in DNA plazmitlerini eksprese etmek için elektroporasyon kullanılabilir. Bu teknik, hücresel fenotipin altında yatan moleküler yollar hakkında bilgi edinmek için transgenik fareleri kullanan çalışmalara tamamlayıcı bir yaklaşım olarak hizmet eder. Bu gen transferi yöntemi kullanılarak, embriyonik koklea içindeki çeşitli epitel hücre tipleri transfekte edilir, böylece tek hücre düzeyinde fonksiyon kaybı ve kazancı analizleri mümkün olur. Ayrıca koklear eksplant kültürlerinde elektrofizyolojik çalışmalar da yapılabilmektedir8. Bu in vitro elektroporasyon yöntemi nispeten basit ve anlaşılırdır, dokuya minimum hasar ile birleştiğinde, bu tekniğin hızlı bir şekilde genişlemesine neden olmuştur.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Orta</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Siprofloksasin hidroklorür</td><td>Cellgro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabak 60 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23062-6015/23064-6015</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabak 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10015 / 23062-10015</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Darbe üreteci</td><td>Protech International Inc</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt kültür kapları</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Kültür kabı, 60 x 15 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kapları</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OS-30</td><td>Dow Corning</td><td>4021768</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler, 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Miyozin 6</td><td>Proteus Biyobilimler A.Ş</td>. <td>25-6791</td><td></td></tr><tr><td>Miyozin 7a</td><td>Proteus Biyobilimler A.Ş</td>. <td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>TuJ1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporasyon tarafından embriyonik fare koklear eksplantlarından kültür ve gen transferi

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Corti'nin fare organında bulunan işitsel tüy hücreleri, ses bilgisini algılar ve merkezi sinir sistemine iletir. Mekanosensoriyel saç hücreleri, kokleanın bazal eksenine kadar uzanan bir sıra iç saç hücresi ve üç sıra dış saç hücresi halinde hizalanır. Burada tarif edilen eksplant kültür tekniği, koklear eksplantları embriyonik fare iç kulağından izole etmek ve korumak için etkili bir yöntem sağlar. Ayrıca, koklear eksplant kültürleri içindeki duyusal tüy hücrelerinin ve duyusal olmayan destekleyici hücrelerin morfolojisi ve moleküler özellikleri, in vivo olarak gözlemlenenlere benzer ve içsel hücresel ortamında incelenebilir. Koklear eksplantlar, hücresel spesifikasyon ve modellemede yer alan moleküler ve genetik yolakların tanımlanması ve karakterizasyonu için önemli deneysel araçlar olarak hizmet edebilir. Transgenik fare modelleri, gen ekspresyonu çalışmaları için etkili bir yaklaşım sağlasa da, önemli sayıda fare mutantı embriyonik gelişim sırasında ölür ve böylece gelişimsel fenotiplerin analizini ve yorumlanmasını engeller. Doğumdan önce ölen mutant farelerden alınan Corti organı, in vitro gelişimleri ve farklı faktörlere tepkileri analiz edilebilmesi için kültürlenebilir. Ek olarak, embriyonik koklear eksplantların ex vivo elektropoze edilmesi için bir teknik açıklıyoruz, bu da belirli gen(ler)i aşağı regüle etmek veya aşırı eksprese etmek ve potansiyel endojen fonksiyonlarını analiz etmek ve memeli koklear gelişimini etkilemek için belirli bir bağlamda spesifik gen ürününün gerekli veya yeterli olup olmadığını test etmek için kullanılabilir1-8.

Embriyonik iç kulaklardan kohleanın izole edilmesi ve duyusal epitelyumu açığa çıkarmak için mikro-diseksiyon yapılması yöntemini tanımlıyoruz. Diseksiyon sonrası, yapı bozulmamış bir kohlear kanal olarak plaklara ekilebilir ve kültüre edilebilir (Şekil 3) ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Kültüre edilen kohlear eksplantlar, çeşitli çözünür faktörlerin ve farmakolojik ilaçların kohlear gelişim üzerindeki etkisini incelemek için kullanışlı bir analiz yöntemi sunar. Kohlear eksplantların diseksiyo...

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Bu prosedürün amacı, fare embriyonik, koklea exvivo'yu kültürlemek ve elektro çalıştırmaktır. Morfogenez farklılaşması ve büyüme olayları da dahil olmak üzere koklear gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için, bu, önce 13. günlük bir embriyonik fare embriyosundan başın elde edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, beyni çıkararak iç kulakları açığa çıkarın ve kafatasının tabanından ayrılarak gelişmekte olan temporal kemikten izole edin.Daha sonra üstteki kıkırdağı çıkarın ve koklearın duyusal epitelini elde etmek için koklear kanalı açın. Son adım, diseke edilen koklearın bir haftaya kadar elektroporasyonlu veya elektroporasyonsuz kültürlenmesidir. Sonuç olarak, implantlar canlı hücre görüntüleme veya sabit immün boyama için analiz edilebilir ve konfokal görüntüleme ile analiz edilebilir, Fare embriyonik kültürü.Koklear explan, gelişmekte olan kokleadaki proliferasyon, sülfat spesifikasyonu ve polarite gibi organogenezin çeşitli yönlerini ve bu olayların büyüme ve farklılaşmaya nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için mükemmel bir sistem sağlar. Dolayısıyla bu teknik, farmakolojik manipülasyonların yapılmasına ve gen fonksiyonlarının ex vivo olarak izlenmesine izin verir. Ve böylece bu teknik, elektroporasyon yoluyla gen transferi ile birleştiğinde, ilgilenilen genin ifadesini değiştirebilir ve işlevini tek bir hücre düzeyinde izleyebilir.Bu işleme başlamak için, bir E 13 fare embriyo kafasını soğuk diseksiyon solüsyonu içeren steril bir sogar kabına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, göz bölgesinin etrafına küçük ayrıntılar yerleştirerek embriyo başını hareketsiz hale getirin. Daha sonra iki çift steril forseps kullanarak, cildi dikkatlice çıkarın ve kafatasını orta hat boyunca sırt tarafında açın.Bundan sonra, beyni kraniyal boşluktan çıkarın. Temporal kemiklerin içinde yer alan iç kulaklar, etraflarındaki kan damarının astarından tanımlanabilir. Daha sonra, forsepsleri dokunun altına yerleştirerek ve iç kulağı kafatasının tabanından izole ederek iç kulakları temporal kemiklerden ayırın.Daha sonra, diseke edilmiş iç kulakları soğuk diseksiyon solüsyonu içeren yeni bir kaba aktarın. Şimdi iç kulağı ventral taraf yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Minuchin pimlerinin keskin ucunu vestibüler kısımdan nazikçe sokarak iç kulağı stabilize edin.Ultra ince forseps kullanarak, oval pencerenin yakınında bir kesi yaparak üstteki kıkırdağı kesin. Forsepslerin kıkırdağa çok derine yerleştirilmediğinden emin olun, çünkü üstteki kıkırdak bazen koklear kanal ile kaynaşır. Ardından kıkırdağı kokleardan dikkatlice çıkarın.Daha sonra, forsepsleri koklear kanalın tabanına veya tepesine yerleştirerek duyusal epiteli açığa çıkarın ve koklearın çatısını yavaşça dışarı çekin. Son adım olarak, koklear ekplanın tabanı düz olacak şekilde altta yatan bağ dokusunu açıkta kalan duyusal epitelden dikkatlice çıkarın. Bundan sonra, disseke edilen koklearı iç kulağın vestibüler kısmından izole edin.Diseke edilmiş koklear duyusal epiteli, 1,5 milimetrelik steril bir kepçe kullanarak bazal membran matrisi Kaplanmış kültür kuyusuna aktarın, eğer ekstra dokuyu çıkarmak için daha fazla temizlik gerekiyorsa, bu aşamada gerçekleştirilebilir. Daha sonra koklear ekplanyonu, epitelin lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Dokuyu dikkatlice düzleştirmek için bazal membran matris DMEM solüsyonunu aspire edin ve tabağa yavaşça 150 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin.Her bir x explan a'nın kaplanmış cam kapak kızağına iyi bir şekilde yapıştığından ve kültür ortamında yüzmediğinden emin olun. Daha sonra, mikro diseke koklearı nazikçe 150 milimetrelik steril bir kültür kabına aktarın ve bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Üç ila altı DIV için% 37 karbondioksit ile 5 santigrat derece.1D'den sonra IV. Koklear ekplanın kültür kabına iyi yapıştığından emin olmak için kültürü diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Daha sonra, elektroporasyon için ayarlamak üzere immünohistokimya için işlemeden önce kültürü istenen süre boyunca in vivo olarak inkübe etmeye devam edin. İlk olarak, 100 milimetrelik puro kaplı bir cam tabağı otoklavlayarak veya% 70 etanol içinde yaklaşık 20 dakika bekleterek sterilize edin.Daha sonra kullanmadan önce temiz bir tezgahta kurumaya bırakın. Şimdi uygun bir maxi veya MIDI hazırlık kiti kullanarak tercih edilen bir ekspresyon vektöründen DNA hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ifade vektörleri, bir H bir ifade yapısı ve nöro D bir ifade yapısıdır.Ve DNA'nın nihai konsantrasyonu, steril DNA RNA'larında mikrolitre başına en az bir mikrogram olmalıdır, DNA'yı enik koklear ekşame elektro olarak çalıştırmak için serbest su. 100 milimetrelik puro kaplı taze bir tabağa 10 mikrolitre plazma DNA çözeltisi ekleyin. Daha sonra, tamamen diseke edilmiş bir koklear ekzyonu, epitelin lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde DNA çözeltisine aktarın.Koklearı, yemeğin düzlemine dik olacak şekilde hafifçe eğin. Ardından, elektrotatörü kullanarak negatif elektrot kanatçığını duyusal epitele doğru ve pozitif elektrot kanatçığını koklear tabanın yanına yerleştirin. 24 milivolt 30 milisaniye darbe süresinde dokuz ila 10 darbe verin.Daha sonra, elektro dereceli kokleara 100 mikrolitre ılık kültür ortamı ekleyin. Elektro dereceli kokleayı kaplama için bazal membran matris kaplı çanağa aktarmadan önce tüm koklear ekzit ve ilgilenilen tüm genlerin DNA'sı için prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra, tüm elektro dereceli kokleaları istenen süre boyunca 37 santigrat derece% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde kültürleyin ve daha sonra immünosito kimyası için işlenecektir.Bu görüntüler, bir TH olan, EEG FP veya nöro D bir EGFP Reporter yapıları ile elektroporasyona tabi tutulan vahşi tip CD one fare barlarından elde edilen embriyonik gün 13 koklear implantları göstermektedir. Saç hücresine özgü belirteç, anti myo yedi A veya kırmızı renkte iki ila bir nöronal belirteç ile immünografik olarak etiketlendiler. EGFP ekspresyonu ile görselleştirilebilen elektro dereceli hücreler, daha büyük epitel sırtı, daha küçük epitel sırtı ve duyusal epitel hücreleri boyunca görülür.Nöro D bir, beş DIV'den sonra transfekte koklear epitel hücreleri, çoğu bir veya bir T oh H olan dendritik süreçlerle nöronal fenotipi elde ettikten sonra elde etti. Transfekte edilen hücreler myo yedi için pozitifti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sekiz ila 10 patlama istihbarat litresi için üç ila dört saat içinde yapılabilir.Bu, diseksiyon kültürü, elektroporasyon ve eksürünün kaplanması için yeterli zaman sağlayacaktır.

culture-embryonic-mouse-cochlear-explants-gene-transfer

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

İn vivo potansiyellerini belirlemek için kültürlenmiş hücreleri erken fare embriyolarının tanımlanmış bölgelerine aşılamak için bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, eksojen DNA'nın embriyolardaki birkaç hücreye hassas bir şekilde iletilmesini sağlayan, çapı bilinen cam kılcal damarları kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi de sunuyoruz.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin, fare embriyonik koklear eksplantlarını kültüre alma ve elektroporasyonla gen transferi yöntemini. Bu teknik, iç kulak gelişimi ve gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Daha fazla video keşfet