Name: Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron progenitörleri üretme yöntemini. Bu teknik Nkx2.1 eksprese eden hücrelerin verimli oluşumunu sağlayarak sinirbilim araştırmalarında ve tedavi uygulamalarında önemli avantajlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolü geliştirmeye yardımcı erken çalışmaları için Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP çift muhabir mESC çizgi gibi Jennifer Tyson, Asif Maroof ve Tim Petros geliştirmek için Qing Xu için minnettarız. Biz de CHOP Akış Sitometresi çekirdek teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bir NIH R01 MH066912 (SA) ve F30 MH105045-02 (DT) tarafından desteklenmiştir.

Not: Bu protokol için açıklanan çift muhabir mESC hattı (sande@mail.med.upenn.edu) istek üzerine sağlanmaktadır.
1. medyası hazırlama
Not: tüm medya hücre kültüründe kullanmadan önce 37 ° c sıcak.
<ol><li>
Fare embriyonik Fibroblast (MEF) medya (hazırlığı 500 mL)
	<ol>
<li>Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ve bir 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden 449 ml 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyin.</li>
		<li>1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. 1 ay veya aliquot ve ≤ dükkanında 4 ° C'de medya saklamak-20 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2 medya (hazırlığı 500 mL)
	<ol>
<li>5 mL L-alanin-L-glutamin ekleyin (100 x) ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 489.5 ml DMEM: Besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) ve 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden.</li>
		<li>1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) ve 5 mL N2 ek-B filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay boyunca karanlıkta saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(500 mL hazırlığı) serum-Alerjik büyüme orta (KSR)
	<ol>
<li>75 mL serum-Alerjik orta ek, 5 mL L-glutamin ekleyin (100 x), 5 mL MEM sigara-esansiyel Amino asitler (MEM-NEAA) (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.</li>
		<li>1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare embriyonik kök hücre medya (hazırlığı 500 mL)
	<ol>
<li>75 mL kök hücre sınıf FBS, 5 mL MEM-NEAA ekleyin (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.</li>
		<li>1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° C'de 1 ay veya aliquot ve ≤ mağazasında için karanlıkta saklamak-20 ° c</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kültür mESCs
<ol><li>Plaka mitotically etkin olmayan MEF besleyici hücreler MEF medya doku kültürü üzerine 3-4 x 104 hücreleri/cm2tabak tedavi. En az 12 h onları mESCs kaplama daha önce bir hücre kültür kuluçka ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de yerleşmek izin verir. Hemen değil kullandıysanız, her 3 günde MEF ortamı değiştirin. MEFs kaplama 7 gün içinde kullanılmayan eğer atın.</li>
	<li>MESCs (1-4 x 104 hücreleri/cm2yoğunluk aralığı) MEF plakaları fare lösemi inhibitör faktör (mLIF) (1000 U/mL) içeren mESC medya ekleyin. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Geçiş tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) kullanarak mESCs (1:5-1:10) çanak olur sonra ~ % 70-80 birleşmesi veya koloniler dokunmaya başlıyor. Bu genellikle 2 günde ortaya çıkar, ancak ilk kaplama yoğunluğu bağlı olarak 4 veya 5 gün sürebilir.</li>
	<li>MESCs mESC orta pluripotency tutmak için MEF besleyici katmandaki korumak.</li>
	<li>
Farklılaşma başlamadan önce en az bir kez üzerine jelatin kaplı plakaları olmadan MEFs sulandırmak için MEFs hücreleri geçiş.
	<ol>
<li>% 0.1 ekleyerek jelatin kaplı plakalar fosfat tamponlu tuz (PBS) ile Ca2 +/Mg2 + bir doku kültürü tedavi çanak içinde jelatin hazırlamak ve en az 1 h. plaka 1.5-2 x 106 hücreler/10 cm tabak için 37 ° C'de bırakarak (2.7-3.6 x 104 hücre/cm2) ve hücre farklılaşması başlamadan önce 2 gün boyunca genişletmek izin verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mESCs MGE benzeri Telencephalic ataları doğru ayırt
<ol><li>
Farklılaşma gün (DD) 0 "hücreleri float" =
	<ol>
<li>MESCs büyüdü sonra jelatin kaplı levha 2 gündür medya Aspire edin ve PBS olmadan Ca2 +/Mg2 +bir kez hücrelerle yıkayın. Yeterli tripsin-plaka (tipik olarak 4 mL tripsin-EDTA bir 10 cm doku kültürü yemek için) yüzeyine kapak ve geri içine ≥95% bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de kuluçka makinesi 4 dk için hücreleri yerleştirmek için EDTA (% 0.05 tripsin) ekleyin.</li>
		<li>4 dk sonra mESC medya ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek. Hücreleri bir uygun ölçekli santrifüj tüpü aktarmak ve hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. 5 dk sonra tüpü çıkarması ve medya Pelet bozmadan Aspire edin. BMP inhibitörü LDN-193189 içeren Pelet 1 ml KSR:N2 medya (1:1) resuspend (250 nM) ve Wnt inhibitörü XAV-939 (10 µM).</li>
		<li>Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonu ölçmek. LDN-193189 içeren KSR:N2 medya (1:1) 75.000 hücre/mL ekleyerek olarak embryoid organları (EBs) hücreleri büyüyen Başlat (250 nM) ve XAV-939 (10 µM) yapışık olmayan doku kültürü yemekleri. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD1 üzerinde "kaplama doku kültürü tedavi yemekleri ile Poli-L-lizin (10 µg/mL PBS ile Ca2 +/Mg2 +) tarafından bir gecede açılış" hücre (O/N) ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de veya en az 1 h için hazırlayın.</li>
	<li>DD2, Poli-L-lizin Aspire edin ve laminin (10 µg/mL PBS ile Ca2 +/Mg2 +) ile plakalar ceket O/N ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de. Not: O/N optimal, gibi küçük ise 2 h yeterli olabilir. Tabak diğer gün kullanılmazsa, laminin Aspire edin, PBS ile Ca2 +/Mg2 +değiştirin ve 4 ° C'de 2 hafta için saklamak.</li>
	<li>
DD3 ("Kara hücreleri")
	<ol>
<li>EB ayrılma işlemine başlamadan önce laminin Aspire edin ve tabakaları bana izin tamamen kuru bir doku kültürü Hood. Parlak veya gözle görülür ıslak görünen plakaları kullanmayın. EBs medya ile 15 mL tüp ve 15 g x veya EBs pelleted kadar 3-4 dk santrifüj içine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya Aspire edin ve 3 mL Dnaz içeren hücre dekolmanı çözümü ekleyin (2 U/mL) ve ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de kuluçkaya ve % 5 CO2 15 dakika süreyle yavaşça EB ayrılma yardım için tüp her 3 dakikada fiske.</li>
	<li>EBs artık görünür veya 15dk geçen kez Dnaz içeren 6 mL KSR:N2 (1:1) eklemek (1 U/mL) ve 200 x g de 5 dk santrifüj.</li>
	<li>KSR:N2 (1:1) LDN-193189 içeren hücrelerde plaka (250 nM), XAV-939 (10 µM) ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 µM) 4.5-5 x 104 hücreleri/cm2.</li>
</ol>4. SST zenginleştirici Protokolü: "DD12 GFP yüksek Sonic Kirpi (SHH)" (Adım 3.7 devamı)
<ol><li>DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Gün 8 (Adım 4.4) yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak 3.2-3.3 adımlarda açıklanan yönergeleri kullanarak.</li>
	<li>DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve ŞŞŞ (50 ng/mL).</li>
	<li>
DD8 üzerinde hücreleri yeniden plaka. Not: Bu adım gerekli değildir, ancak hücreleri yeniden kaplama erken farklılaşmış, istenmeyen hücre tipleri azaltabilir. Yeniden kaplama aynı zamanda aşağı akım immunohistokimyasal analizleri yapmak zor hücre topları keser ve sonraki zaman noktalarda FACS verimliliğini artırır.<ol>
<li>Hücreleri yeniden plaka, plaka ile tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) hücrelerden ≥95% bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de 5 min için ayırmak için. KSR:N2 ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek ve 5 dakika süreyle 200 x g, santrifüj filtre hücreleri herhangi bir kümeleri kaldırmak için 40 µm filtre tüpünden. FGF-2 içeren hücreler 250.000 hücreler/cm2 N2/KSR (1:1)'de yeniden plaka (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve Y-27632 (10 µM) ŞŞŞ ile (50 ng/mL). Not: Bunun yerine, karar DD8 sayfasındaki hücreleri yeniden plaka değil yaptıysanız, medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL) DD12 DD7 her 2 gün ve IGF-1 eklemeye devam edin (20 ng/mL) ve FGF-2 (10 ng/mL) DD9 kadar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD10 üzerinde medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL).</li>
	<li>
DD12 üzerinde SST alt için zenginleştirilmiş hücreleri elde etmek için FACS Lhx6::GFP belirlemek için kullanın-sadece hücreleri ifade.
	<ol>
<li>Hücreleri ayırmak için bir sigara tripsin içeren hücre-ayrılma reaktif tripsin-EDTA yerine kullanın. Hücreleri bir kez PBS olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. Dnaz içeren önceden ısıtılmış tripsin sigara içeren hücre-ayrılma reaktif ekleyin (2 U/mL) hücreleri. Kuluçka makinesi 10-30 dk ya kadar hücreleri bağlantısız ≥95% bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de yer onları. Yavaşça plakaları her 5 dk ayrılma yardım için dokunun. Not: DD11-12 kültürler için sadece 10-15 dk gerekli olabilir. DD15-16 kültürler için 30 dakika veya daha fazla tam ayrılma için gerekli olabilir.</li>
		<li>Hücreleri tamamen tabağını kaldırdı, standart protokolleri kullanarak FACS izolasyon için ilerlemek veya diğer aşağı akım analizleri hücrelerdeki kullanmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV zenginleştirici Protokolü: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"--dan adım 3.7 (devamı)
<ol><li>DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8 yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak (Adım 4.4) kullanma yönergeleri özetlenen adımlar 3.2-3.3.</li>
	<li>DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8 üzerinde hücreleri aşağıdaki istisnalar 4.4. adımda açıklandığı gibi yeniden plaka: hücreleri yeniden kaplama, ŞŞŞ ile smoothened agonist yerine (SAG; 30 nM) ve atipik PKC inhibitörü (aPKCi; 2 µM) ekleyin. Birlikte, yeniden hassasiyette medya ele alındığında şimdi N2/KSR (1:1) FGF-2 içeren (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) ve aPKCi (2 µM).</li>
	<li>DD10 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin.</li>
	<li>
DD11 Not: Bu noktada, Nkx2.1::mCherry+ hücreleri PV CIns olmak için zenginleştirilmiş.<ol>
<li>4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak FACS için plaka hücrelerden ayırmak. Karar daha sonra bir farklılaşma gün Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak için bu adımı dikkate almayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD12 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD14 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD16 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD17 üzerinde 4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak.</li>
</ol>6. PV zenginleştirici Protokolü: "DD17 mCherry düşük ŞŞŞ" (Adım 3.7 devamı)
<ol><li>DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL). DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
DD9 üzerinde medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirin. Bu noktadan itibaren hiçbir ek büyüme faktörleri gereklidir.
	<ol>
<li>2 günde DD17 hücrelerdeyse hasat kadar medya değiştirmeye devam.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cortical+interneurons%3A+mouse+versus+monkey+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human.</a> Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).</li>
<li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).</li>
<li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons%3A+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+Linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Benes, F. M., Berretta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+interneurons%3A+implications+for+understanding+schizophrenia+and+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder.</a> Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).</li>
<li>Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+culture+and+Sonic+Hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li>
<li>Au, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+gain-of-function+approach+to+generate+cortical+interneuron+subtypes+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells.</a> Neuron. 80, 1145-1158 (2013).</li>
<li>Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+derivation+of+mouse+ESC-derived+cortical+interneurons+by+expression+of+Nkx2.1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1.</a> Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).</li>
<li>Cambray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+induces+cortical+interneuron+identity+and+differentiation+in+embryonic+stem+cell-derived+telencephalic+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors.</a> Nat Commun. 3, 841(2012).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%22MGE+Enhancers%22+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PloS one. 8, e61956(2013).</li>
<li>Danjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subregional+specification+of+embryonic+stem+cell-derived+ventral+telencephalic+tissues+by+timed+and+combinatory+treatment+with+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Tyson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+culture+and+sonic+hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li>
<li>Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+PKC+and+Notch+Inhibition+Differentially+Modulate+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).</li>
<li>Liodis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135, 1559-1567 (2008).</li>
<li>Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+molecular+specification+of+striatal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Origin and molecular specification of striatal interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).</li>
<li>Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+maintains+the+identity+of+cortical+interneuron+progenitors+in+the+ventral+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon.</a> Development. 132, 4987-4998 (2005).</li>
<li>Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+cyclin+D2+and+D1+protein+expression+distinguish+forebrain+progenitor+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets.</a> Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314, 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).</li>
<li>Fogarty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genetic+patterning+of+the+embryonic+neuroepithelium+generates+GABAergic+interneuron+diversity+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li>
<li>Colasante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Conversion+of+Fibroblasts+into+Functional+Forebrain+GABAergic+Interneurons+by+Direct+Genetic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://homes.mpimf-heidelberg.mpg.de/~mhelmsta/pdf/2004%20Xu%20et%20al%20JNeurosci.pdf">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344, 1240622(2014).</li>
<li>Tyson, J. A., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+interneuron+transplants+to+study+development+and+treat+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease.</a> Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).</li>
<li>Donegan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+interneuron+transplants+as+a+treatment+for+schizophrenia%3A+preclinical+validation+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model.</a> Mol Psychiatry. , (2016).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+naive-like+human+pluripotent+stem+cells+based+on+HERVH+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression.</a> Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li>
<li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem J1 kaynaklı mESCs (SCRC-1010) desenlendirme son derece etkili olmakla birlikte, diğer mESC çizgileri ve klonal yalıtır değişken başarı yaşadım. Örneğin, Foxg1::venus mESCs (EB3 kaynaklı; Danjo vd. 13) yanıt kötü bu protokolü ve Foxg1 indüksiyon DD12 tarafından genellikle sırasına % 1-2 olur. Tam olarak anlamıyorum nedeniyle, aynı anda (JQ27 denir) Bu protokol için açıklanan satır olarak izole edildi (JQ59 denir) başka bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir klon üretir az %1 ...

Fareler ve insanlar içinde kabaca tüm kortikal inhibitör interneurons (CIns) yarısı nerede medial ganglionic hazretleri (MGE) bilinen bir geçici subcortical yapısı içinde kaynaklanan neuroepithelial ataları, CIns ve diğer nöronal ve gliyal alt gruplar transkripsiyon faktörü Nkx2.11,2hızlı. CIn alt gruplar veya alt türlerinden kesişen morfolojik, nörokimyasal, Elektrofizyolojik ve bağlantı özellikleri3,4tarafından tanımlanır. MGE elde edilen CIns gruplandırılabilir çoğunlukla üst üste alt gruplar PV veya SST, hangi ilişkilendirir belirli Elektrofizyolojik ve bağlantı eğilimler5ile ifade onların ifade dayalı. İşlev bozukluğu interneurons, özellikle o PV alt grubu içinde birden çok nöropsikiyatrik bozukluklar ve hastalıklar6,7' karıştığı olmuştur. Bu yöntem genel amacı Mitotik ataları kök hücre kaynaklı ve göçmen öncüleri PV veya SST CIn kader kortikal interneuron biyoloji okuyan ve kullanılmak üzere hücre tabanlı terapiler için zenginleştirilmiş üretmektir.
İnterneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl mESCs gelen türetme ölçeklenebilir ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP kullanarak çift muhabir mESC kaplamak8, Nkx2.1 ataları ya da onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl FACS yolu ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Sinyal yolları bir dizi, kültür süresi ve neurogenesis modu manipüle ederek, biz fluorescently etiketli interneuron öncüleri aşağı akım uygulamaları bir dizi için uygun milyonlarca alabilirsiniz.
MESCs9,10,11,12,13,14, Wnt üzerinde dayanır bizim yöntem MGE benzeri ataları oluşturmak için birkaç yöntem mevcut olmasına rağmen antagonist XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 telencephalic ataları ortak ifade oluşturma özellikle verimli. Buna ek olarak, interneuron ataları veya onların sonrası Mitotik Lhx6 ifade döl çift muhabir sistemimiz üzerinden seçin yeteneği büyük ölçüde farklı ataları ve onların döl üretmek için kapasite artırır.

<table><tbody><tr><td>Şişe üstü vakum filtre sistemi</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci Geçmeli Test Tüpü</td><td>Geçmeli Kapaklı ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Fare embriyonik fibroblastları (CF-1, MEF, IRR 7M),</td> <td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>, dört adet 10 cm'lik TC plakası için 1 şişe 7M MEF yeterlidir. Referanslar: 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Antimikrobiyal ajan olarak da bilinir. Temel ortamla filtrelemeyin - filtrelemeden sonra ekleyin. Referanslar: 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Temel medya ile filtreleme -- ekle filtrasyondan sonra</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>L-alanin-L-glutamin olarak da bilinir. Referanslar: 9,11,38,39</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Değiştirme (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Serumsuz medyum takviyesi olarak da bilinir. Referanslar: 9,11</td></tr><tr><td>L-glutamin (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>Glutamin içermeyen DMEM olarak da bilinir. Referanslar: 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Kök hücre sınıfı FBS olarak da bilinir. Referanslar: 9,11</td></tr><tr><td>Doku kültürü uygulanmış tabak (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmayan steril petri kabı (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Lösemi inhibitör faktör (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Dondurmayınız, 4°C'de saklayınız. Referanslar: 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>%0.1 Jelatin Çözeltisi</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05)</td> <td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Tripsin içermeyen hücre ayrışma reaktifi olarak da bilinir. Referanslar: 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 RNaz İçermeyen DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>233-FB</td><td>%0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td> %<td>0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°</td></tr>C'de saklayın <tr><td>ROCK inhibitörü (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın</td></tr><tr><td>Düzleştirilmiş agonist (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>H20'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın rm</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td> %<td>0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık PKC & zeta alikotlarında -80 ° C'de saklayın</td></tr><tr><td>; Psödosubstrat İnhibitörü, Miristoillenmiş</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>H20'de yeniden süspanse edilir ve tek kullanımlık alikotlarda -80 ° C'de saklanır</td></tr></tbody></table>

fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal interneuron kara filmin tarih öncesi

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic kortikal interneurons heterojen bir nüfus eksitatör piramidal nöronların çıkışını düzenleyen hem de piramidal nöron topluluklar çıkışlarını eşitleme kritik rol oynarlar hücre vardır. İnterneuron işlevinde açıkları nöropsikiyatrik bozukluklar, şizofreni, otizm ve epilepsi gibi çeşitli karıştığı olmuştur. Embriyonik kök hücrelerden kortikal interneurons türetme sadece kendi geliştirme ve fonksiyon incelenmesi için izin verir, ama kortikal interneuron ile ilgili bozukluklar patogenezinde temel moleküler mekanizmaları görmemizi sağlar. İnterneurons da hayatta, göç ve bütünleşmek içine ana bilgisayar kortikal devresi sonrası nakli, yapım onları kullanmak için ideal aday hücre tabanlı terapiler için olağanüstü kapasitesine sahip. Burada, bir ölçeklenebilir, yüksek verimli, değiştirilmiş embryoid vücut monolayer yöntemi interneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl fare embriyonik kök hücreler (mESCs) üzerinden türetme için mevcut. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir mESC satırını kullanarak, Nkx2.1 ataları veya onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl olabilir (FACS) sıralama Floresans aktif hücre ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Ayrıca parvalbumin (PV) veya somatostatin için (SST) interneuron alt grupları, hangi-ebilmek var olmak yararlı kader tayini yönlerini çalışmak için veya kullanmak için alt grubu vitaminlerle zenginleştirilmiş interneuron yararlanacak terapötik uygulamalarda zenginleştirmek için yöntemler sağlar nakillerine.

Bu raporda açıklanan iletişim kuralı bizim yayımlanmış protokolleri15,16,17 değiştirilmiş bir versiyonu ve Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC hattımız ile kullanım için optimize edilmiştir. DD0-5 DD8 yeniden kaplama ile birlikte, Wnt inhibitörü XAV-939 ekleyerek neyin yukarı tüm DAPI + çekirdeği kültüründe % 50'si de Nkx2.1 (şekil 1A, B) ifa...

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmiş bir embriyoid cisimden tek tabakaya yöntemi kullanarak fare embriyonik kök hücreleri için mitotik internöron öncülerinde kortikal internöron progenitörleri oluşturmaktır. Bu yöntem, kortikal internöronların alt tiplerinin gelişim sırasında bireysel kaderlerine nasıl ulaştığı gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, internöron progenitörlerini eksprese eden Nkx2.1'in verimli bir şekilde üretilmesini ve ayrıca parvalbumin veya somatostatin internöron alt grupları için zenginleştirme yöntemlerini mümkün kılmasıdır.Bu prosedüre başlamak için, MEF ortamındaki mitotik olarak aktif olmayan MEF besleyici hücreleri doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar üzerine plakalayın. mESC'leri kaplamadan önce 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleşmeleri için en az 12 saat bekleyin. Hemen kullanılmayacaksa, MEF ortamını her üç günde bir değiştirin.Daha sonra, MEF plakalarına fare lösemi inhibitör faktörü içeren mESC'leri ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Çanak %70 ila 80 birleşim haline geldiğinde tripsin-EDTA kullanarak mESC'leri geçin ve pluripotentliği korumak için mESC'leri mESC ortamında bir MEF besleyici katmanında tutun.Farklılaşmaya başlamadan önce, hücreleri seyreltmek için MEF'ler olmadan en az bir kez jelatin kaplı plakalara geçirin. Bunu yapmak için, doku kültürü uygulanmış bir tabağa %0.1 jelatin ve kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ekleyerek jelatin kaplı plakalar hazırlayın ve 37 santigrat derecede en az 1 saat inkübe edin. Her on santimetrelik plakada 1,5 ila iki kez 10 ila altıncı hücre plakalayın ve farklılaşmaya başlamadan önce iki gün boyunca genişlemelerine izin verin.DD0'da, mESC'ler jelatin kaplı plakalar üzerinde iki gün boyunca büyüdükten sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, plakaların yüzeyini kaplayacak kadar tripsin-EDTA ekleyin. Ve hücreleri dört dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.Dört dakika sonra, hacminin iki katı mESC ortamı kullanarak tripsin-EDTA'yı söndürün. Hücreleri uygun büyüklükte bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, tüpü çıkarın ve peleti bozmadan ortamı aspire edin.Peleti bir milileter KSR-N2 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün. Yapışmayan doku kültürü kaplarında KSR-N2 ortamında milileter başına 75.000 hücre ekleyerek hücreleri embriyoid cisimler olarak büyütmeye başlayın.Ve onları 37 santigrat derecede inkübe edin. DD1'de, doku kültürü ile muamele edilmiş tabakları en az bir saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede poli-L-lizin ile kaplayarak hücre inişine hazırlanın. DD2'de, poli-L-lizini aspire edin ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede laminin ile kaplayın.DD3'te, EB ayrışmasına başlamadan önce, laminini aspire edin ve plakaların bir doku kültürü başlığında tamamen kurumasını bekleyin. Daha sonra, EB'leri ortamla birlikte 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 15 kez g'de veya EB'ler peletlenene kadar üç ila dört dakika santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve DNaz içeren üç mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.Ardından, numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. EB ayrışmasına yardımcı olmak için tüpü her üç dakikada bir hafifçe vurun. EB'ler artık görünmediğinde veya 15 dakika geçtiğinde, DNaz içeren altı mililitre KSR-N2 ekleyin ve 200 kez g'de beş dakika santrifüjleyin.Daha sonra, LDN193189, XAV939 ve ROCK inhibitörü Y27632 içeren KSR-N2'deki hücreleri, santimetre kare başına 4.5 ila beş çarpı on ila dördüncü hücrelerde kaplayın. DD5'te, FGF2, IGF2 ve SSH içeren KSR-N1 ile ortamı değiştirin. Daha sonra, DD1 ve DD2'deki prosedürlerde belirtilen talimatları kullanarak 8. günde yeniden kaplama için doku kültürü plakalarını hazırlayın.DD7'de, FGF2, IGF1 ve SHH içeren KSR-N2 ile ortamı değiştirin. DD8'de, hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca tripsin-EDTA ile plakalardan ayırarak yeniden plakalayın. KSR-N2 ile hacminin iki katını kullanarak tripsin-EDTA'yı söndürün.Ve beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Topakları gidermek için hücreleri 40 mikronluk bir filtre tüpünden süzün. Daha sonra, hücreleri SHH ile FGF2, IGF1 ve Y27632 içeren N2-KSR'de santimetre kare başına 250.000 hücrede yeniden plakalayın.DD10'da, ortamı SHH içeren KSR-N2 ile değiştirin. Hücreleri bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın ve hücrelere DNaz içeren önceden ısıtılmış, tripsin içermeyen hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Onları 10 ila 30 dakika boyunca veya hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.Ardından, ayrışmaya yardımcı olmak için plakalara her beş dakikada bir hafifçe vurun. DD5'te, ortamı FGF2 ve IGF2 içeren KSR-N1 ile değiştirin. Daha sonra, DD8 üzerinde yeniden kaplama için doku kültürü plakaları hazırlayın.DD7'de, FGF2 ve IGF2 içeren KSR-N1 ile ortamı değiştirin. DD8'de, hücreleri düzleştirilmiş agonist ile yeniden plakalayın ve atipik PKC inhibitörü ekleyin. DD10'da, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin.DD11'de, hücreleri FACS için plakalardan ayırın. Hücreler DD11'de FACS için ayrılmadıysa, DD12'deki ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin. DD14'te, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin.Ve DD16'da, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin. Ardından, DD17'de Nkx-2.1:mCherry pozitif hücrelerini toplayın. Burada, farklılaşma günü 12 kültüründen Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry ve Lhx6:GFP için immün boyamanın temsili görüntüleri gösterilmektedir.Bu görüntülerin aynı görüş alanından çakışan kanallar olduğunu unutmayın. Bu grafik, kültürde DD12'de Nkx2.1'i eksprese eden DAPI pozitif çekirdeklerin ortalama yüzdesinin nicelleştirilmesini göstermektedir. Ve bu, çift raportör mESC hattımız kullanılarak izole edilebilecek dört farklı hücre popülasyonunu gösteren temsili bir FACS grafiğidir.mCherry'nin x ekseninde ve GFP'nin y ekseninde olduğunu unutmayın. Bu nedenle, sağ üstteki kutu, mCherry-GFP çift pozitif olan hücreleri temsil eder. İşte Nkx2.1:mCherry ve Lhx6:GFP indüksiyonunun DD6'dan 16'ya kadar olan zaman seyri, kültürdeki yalnızca mCherry eksprese eden, yalnızca GFP eksprese eden veya mCherry-GFP ko-eksprese eden hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse baştan sona 17 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, her zaman plöripotent, farklılaşmamış, sağlıklı görünen kök hücrelerle başlamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, internöron kaderinin belirlenmesi veya internöron transplantasyonunun devre fonksiyonu ve hayvan davranışı üzerindeki etkisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için yenidoğan veya yetişkin fare neokorteksine transplantasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gelişimsel sinirbilim alanındaki araştırmacıların, farelerde ve buna bağlı olarak nöronlar arası ilişkili bozukluklardan etkilenen hastalarda nöronlar arası kader belirlemeye yönlendiren faktörleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Nkx2.1 eksprese eden progenitörlerin ve bunların post-mitotik döllerinin fare embriyonik kök hücrelerinden nasıl türetileceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video embriyonik farelerin gelişmekte olan korteks neuroprecursors izolasyonu için kullanılan yöntem açıklanır. , Embriyoların rahim kaldırarak, kortikal doku diseksiyon, ve sindirerek izole serebral korteks prosedür gösterilmiştir.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Biz küçük bir molekül tabanlı oligodendrosit öncü hücreler (OPC) içine fare embriyonik kök hücreleri farklılaşma için protokol açıklar. Bu protokol, 30 gün farklılaşma, yüksek verimlilik ile Olig2 + NG2 + OPC üretir. Ayrıca, aksiyon potansiyelleri ateş "spike" OPC oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin veya hESC'lerin, besleyici hücreler veya herhangi bir ara adım kullanmadan doğrudan nöral progenitör hücrelere farklılaşmasını göstermektedir. Kemik morfogenetik proteininin veya BMP'nin seçici inhibisyonu ve transforme edici büyüme faktörü-beta veya TGF-β sinyal yolakları, hESC'lerin nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere farklılaşmasına yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Progenitörlere Farklılaşması

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron öncüleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Protokol, kök hücrelerin, kök hücre çoğalmasını ve embriyoid cisimlere (EB'ler) agregasyonunu kolaylaştıran spesifik küçük molekül inhibitörleri içeren ortamlarda kültürlenmesini gerektirir. Daha sonra, EB'ler enzimlerle ayrıştırılır ve kortikal internöron öncülerine farklılaşmalarını teşvik etmek için adezyon proteinleri ile kaplanmış kültür plakası kuyucukları üzerine kaplanır.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Video, nöral progenitör hücreleri nöronlara ayırmak için bir hücre kültürü yöntemini gösterdi. Hücreleri, büyüme faktörleri ile desteklenmiş, besin açısından zengin bir ortamda inkübe ederek, progenitör hücreler, gelişmiş aksonlar ve dendritler ile nöronlara olgunlaştı. Stabilize edici bir ajan, hücre canlılığını sağladı ve farklılaşma süreci boyunca oksidatif hasara karşı koruma sağladı.

Nöral Progenitör Hücrelerin Nöronlara Farklılaşması

Bu video, işleyen sinapslara sahip ağa bağlı bir nöron popülasyonuna embriyonik kök hücre farklılaşması için bir tekniği göstermektedir. Embriyonik kök hücrenin nöronlara farklılaşması, nöronal ağ oluşumunun indüklenmesi ve kültürün ağa bağlı nöronlarla zenginleştirilmesi ile ilgili aşamaları ana hatlarıyla belirtir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron progenitörleri üretme yöntemini. Bu teknik Nkx2.1 eksprese eden hücrelerin verimli oluşumunu sağlayarak sinirbilim araştırmalarında ve tedavi uygulamalarında önemli avantajlar sunar.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Daha fazla video keşfet