Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmiş bir embriyoid cisimden tek tabakaya yöntemi kullanarak fare embriyonik kök hücreleri için mitotik internöron öncülerinde kortikal internöron progenitörleri oluşturmaktır. Bu yöntem, kortikal internöronların alt tiplerinin gelişim sırasında bireysel kaderlerine nasıl ulaştığı gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, internöron progenitörlerini eksprese eden Nkx2.1'in verimli bir şekilde üretilmesini ve ayrıca parvalbumin veya somatostatin internöron alt grupları için zenginleştirme yöntemlerini mümkün kılmasıdır.

Bu prosedüre başlamak için, MEF ortamındaki mitotik olarak aktif olmayan MEF besleyici hücreleri doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar üzerine plakalayın. mESC'leri kaplamadan önce 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleşmeleri için en az 12 saat bekleyin. Hemen kullanılmayacaksa, MEF ortamını her üç günde bir değiştirin.

Daha sonra, MEF plakalarına fare lösemi inhibitör faktörü içeren mESC'leri ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Çanak %70 ila 80 birleşim haline geldiğinde tripsin-EDTA kullanarak mESC'leri geçin ve pluripotentliği korumak için mESC'leri mESC ortamında bir MEF besleyici katmanında tutun.

Farklılaşmaya başlamadan önce, hücreleri seyreltmek için MEF'ler olmadan en az bir kez jelatin kaplı plakalara geçirin. Bunu yapmak için, doku kültürü uygulanmış bir tabağa %0.1 jelatin ve kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ekleyerek jelatin kaplı plakalar hazırlayın ve 37 santigrat derecede en az 1 saat inkübe edin. Her on santimetrelik plakada 1,5 ila iki kez 10 ila altıncı hücre plakalayın ve farklılaşmaya başlamadan önce iki gün boyunca genişlemelerine izin verin.

DD0'da, mESC'ler jelatin kaplı plakalar üzerinde iki gün boyunca büyüdükten sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, plakaların yüzeyini kaplayacak kadar tripsin-EDTA ekleyin. Ve hücreleri dört dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.

Dört dakika sonra, hacminin iki katı mESC ortamı kullanarak tripsin-EDTA'yı söndürün. Hücreleri uygun büyüklükte bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, tüpü çıkarın ve peleti bozmadan ortamı aspire edin.

Peleti bir milileter KSR-N2 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün. Yapışmayan doku kültürü kaplarında KSR-N2 ortamında milileter başına 75.000 hücre ekleyerek hücreleri embriyoid cisimler olarak büyütmeye başlayın.

Ve onları 37 santigrat derecede inkübe edin. DD1'de, doku kültürü ile muamele edilmiş tabakları en az bir saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede poli-L-lizin ile kaplayarak hücre inişine hazırlanın. DD2'de, poli-L-lizini aspire edin ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede laminin ile kaplayın.

DD3'te, EB ayrışmasına başlamadan önce, laminini aspire edin ve plakaların bir doku kültürü başlığında tamamen kurumasını bekleyin. Daha sonra, EB'leri ortamla birlikte 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 15 kez g'de veya EB'ler peletlenene kadar üç ila dört dakika santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve DNaz içeren üç mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.

Ardından, numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. EB ayrışmasına yardımcı olmak için tüpü her üç dakikada bir hafifçe vurun. EB'ler artık görünmediğinde veya 15 dakika geçtiğinde, DNaz içeren altı mililitre KSR-N2 ekleyin ve 200 kez g'de beş dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, LDN193189, XAV939 ve ROCK inhibitörü Y27632 içeren KSR-N2'deki hücreleri, santimetre kare başına 4.5 ila beş çarpı on ila dördüncü hücrelerde kaplayın. DD5'te, FGF2, IGF2 ve SSH içeren KSR-N1 ile ortamı değiştirin. Daha sonra, DD1 ve DD2'deki prosedürlerde belirtilen talimatları kullanarak 8. günde yeniden kaplama için doku kültürü plakalarını hazırlayın.

DD7'de, FGF2, IGF1 ve SHH içeren KSR-N2 ile ortamı değiştirin. DD8'de, hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca tripsin-EDTA ile plakalardan ayırarak yeniden plakalayın. KSR-N2 ile hacminin iki katını kullanarak tripsin-EDTA'yı söndürün.

Ve beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Topakları gidermek için hücreleri 40 mikronluk bir filtre tüpünden süzün. Daha sonra, hücreleri SHH ile FGF2, IGF1 ve Y27632 içeren N2-KSR'de santimetre kare başına 250.000 hücrede yeniden plakalayın.

DD10'da, ortamı SHH içeren KSR-N2 ile değiştirin. Hücreleri bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın ve hücrelere DNaz içeren önceden ısıtılmış, tripsin içermeyen hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Onları 10 ila 30 dakika boyunca veya hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.

Ardından, ayrışmaya yardımcı olmak için plakalara her beş dakikada bir hafifçe vurun. DD5'te, ortamı FGF2 ve IGF2 içeren KSR-N1 ile değiştirin. Daha sonra, DD8 üzerinde yeniden kaplama için doku kültürü plakaları hazırlayın.

DD7'de, FGF2 ve IGF2 içeren KSR-N1 ile ortamı değiştirin. DD8'de, hücreleri düzleştirilmiş agonist ile yeniden plakalayın ve atipik PKC inhibitörü ekleyin. DD10'da, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin.

DD11'de, hücreleri FACS için plakalardan ayırın. Hücreler DD11'de FACS için ayrılmadıysa, DD12'deki ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin. DD14'te, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin.

Ve DD16'da, ortamı aPKCi içeren KSR-N2 ile değiştirin. Ardından, DD17'de Nkx-2.1:mCherry pozitif hücrelerini toplayın. Burada, farklılaşma günü 12 kültüründen Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry ve Lhx6:GFP için immün boyamanın temsili görüntüleri gösterilmektedir.

Bu görüntülerin aynı görüş alanından çakışan kanallar olduğunu unutmayın. Bu grafik, kültürde DD12'de Nkx2.1'i eksprese eden DAPI pozitif çekirdeklerin ortalama yüzdesinin nicelleştirilmesini göstermektedir. Ve bu, çift raportör mESC hattımız kullanılarak izole edilebilecek dört farklı hücre popülasyonunu gösteren temsili bir FACS grafiğidir.

mCherry'nin x ekseninde ve GFP'nin y ekseninde olduğunu unutmayın. Bu nedenle, sağ üstteki kutu, mCherry-GFP çift pozitif olan hücreleri temsil eder. İşte Nkx2.1:mCherry ve Lhx6:GFP indüksiyonunun DD6'dan 16'ya kadar olan zaman seyri, kültürdeki yalnızca mCherry eksprese eden, yalnızca GFP eksprese eden veya mCherry-GFP ko-eksprese eden hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse baştan sona 17 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, her zaman plöripotent, farklılaşmamış, sağlıklı görünen kök hücrelerle başlamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, internöron kaderinin belirlenmesi veya internöron transplantasyonunun devre fonksiyonu ve hayvan davranışı üzerindeki etkisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için yenidoğan veya yetişkin fare neokorteksine transplantasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gelişimsel sinirbilim alanındaki araştırmacıların, farelerde ve buna bağlı olarak nöronlar arası ilişkili bozukluklardan etkilenen hastalarda nöronlar arası kader belirlemeye yönlendiren faktörleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Nkx2.1 eksprese eden progenitörlerin ve bunların post-mitotik döllerinin fare embriyonik kök hücrelerinden nasıl türetileceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.