FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerin veya S'nin yüzeylerini biyoaktif yapılarla zararsız ve hızlı bir şekilde etiketlemektir. Bu, önce bir fonksiyon aralayıcısı, lipid veya FSL yapı çözeltisi hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, yapı çözeltisinin eşit bir kısmı, hücre veya VIR çözeltisinin eşit bir kısmı ile karıştırılır.

Üçüncü adım olarak, karışım 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edilir. Son adım, modifiye edilmiş hücreleri veya sitleri veya modifiye edilmiş VIR'leri veya VIR'leri yıkamak ve bunları her zamanki gibi deneysel olarak kullanmaktır. Sonuç olarak, yüzey modifiye edilmiş canlı hücreler veya S, akış sitometrisi, mikroskopi ve aglütinasyon dahil olmak üzere tüm rutin deneysel analiz teknikleri ile görselleştirilebilir.

Bu tekniğin kovalent etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hızlı, sağlam, esnek olması ve modifiye edilmiş hücrenin veya Varian'ın canlılığını etkilememesidir. Önce FSL yapı stoğu çözeltisini hazırlamak için, kuru FSL ürününü yeniden oluşturmak için ürün dosyasına bir mililitre seyreltici ekleyin ve mililitre başına bir miligram stok çözeltisi oluşturun. Şişeyi 30 saniye boyunca sonikleştirin, stoğu 100 mikrolitrelik steril kaplara ayırın ve kapları bir haftaya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.

Kullanmadan hemen önce yerleştirme için çalışan FSL yapı çözeltilerini hazırlamak için, herhangi bir mis hücresini homojenize etmek için çözeltiyi 30 saniye boyunca tekrar sonikleştirin, ardından FSL yapısını seyreltin ve gereken konsantrasyona tamponlayın. Çalışma solüsyonunu, Resus süspansiyonundan sonra bir haftaya kadar iki ila sekiz santigrat derecede lipit içermeyen ortamda saklayın veya PBS, bağlanmamış lipitler içermeyen FSL modifikasyonu için hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra hücreleri 100 mikrolitre seyreltici içinde paketleyin, aynı koşullar altında kontroller için hücreleri 100 mikrolitre değiştirilmemiş hücreye yıkayın.

İstenirse 100 mikrolitre uygun bir FSL çözeltisi seyreltin. Buna paralel olarak, ilgisiz FSL çözümleri ve/veya PBS ile de negatif kontroller oluşturun. Daha sonra, inkübasyondan sonra tüm hücre alt kümelerini 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Serbest FSL yapılarını çıkarmak için tüm hücreleri lipid içermeyen ortam veya PBS ile iki kez yıkayın ve sıvı yağ içermeyen ortamda uygun bir süspansiyon hazırlayın. FSL modifikasyon işlemi tamamlandıktan sonra, coy'lar bir çiçek gibi dört ila sekiz santigrat derecede saklanabilir. FSL yapıları, biyolojik olarak işlevsel çeşitli gruplar olabilen fonksiyonel kafa veya F olmak üzere üç ana bileşenden oluşur.

Ara parça RS, su dağılımını iyileştirmek ve insan serumu ve DAL lipidi veya L ile reaktif olmamak için fonksiyonel başlığın zardan uzağa doğru ayrılmasını indüklemek üzere tasarlanmıştır, bu da yapının kendiliğinden yüzey dörtlüsüne dahil olmasını sağlar. Temsili FSL grupları aşağıdaki beş resimde gösterilmiştir. Canlı murin embriyoları, serum serbest hücre kültürü ortamında 37 santigrat derecede iki saat yöntemle doğrudan FSL floresein ile etiketlendi, yıkandı ve daha sonra floresan mikroskobu altında görüntülendi.

Bu ilk görüntüde, zop palita içermeyen iki hücreli aynalı bir embriyo görülmektedir. Embriyonun ortasındaki yoğun lekelenme, klasik bir polar cisim boyamasını temsil eder. Sonraki iki görüntüde, mikroskop P odağının dışında kalan hücrelerin gölgeli boyanmasını sergileyen zop palita serbest dört hücreli ve sekiz hücreli aynalama embriyoları burada gösterilmiştir.

FSL floresein etiketli canlı aynalama embriyolarının bu son görüntüsünde, zop palita içermeyen 16 hücreli aynalama embriyosunun bir görüntüsü gösterilmektedir, dört ila beş günlük sağlam aynalama blastları, hem embriyo hem de zop LUCITA etiketli embriyolar bu sonraki görüntü serisinde gösterilmektedir. Zebra balığının FSL floresein etiketlemesi gösterilmiştir. Bu ilk görüntü, döllenmeden 52 saat sonra, FSL floreseinin doğrudan dolaşıma enjekte edildiği bir zebra balığı larvasının mikro anjiyografisidir.

Zebra balığı damar sisteminin lekelenmesi burada gözlemlenebilir. FSL floresein, heterojen zebra balığı böbrek dokusu hücreleri veya ZK sitleri exvivo oluşturuldu ve daha sonra döllenmeden 52 saat sonra bir alıcının dolaşımına mikro enjekte edildi zebra balığı in vivo ZK sitlerinin in vivo gözlemleri, enjeksiyondan iki saat sonra, vaskülatür floresan altında görüntülenerek hızlandırılmış mikroskopi ile gösterilen, turuncu oklar ve hızlı hareket eden hücrelerle gösterilen büyük, yavaş hareket eden veya hareketsiz hücrelere sahip tek bir video karesidir, yeşil oklarla gösterilen hareketleri nedeniyle bulanık görünüyordu. Bu görüntüde, zebra balığı embriyolarının ve FSL floresein içeren ortamların beş güne kadar daldırılmasıyla elde edilen yapının oral alımıyla FSL floresein etiketlemesi gösterilmektedir.

Soldaki FSL floresein ile muamele edilmiş zebra balığının parlak alan mikroskobu, sağdaki bitişik floresan görüntüye karşılık gelir. Floresan tercihen bağırsak sistemine yerleştirildi. Burada gösterilen tedavi edilmemiş kontrol embriyolarında herhangi bir lekelenme gözlenmedi.

Burada veziküler stomatit virüsü veya VSV, 37 santigrat derecede iki saat boyunca mililitre FSL floresein başına 10 mikrogram ile doğrudan etiketlenir, ardından% 4 paraform aldehit ile fiksasyon yapılır ve daha sonra gerçek taraması ile analiz, VSV vir'in saflaştırılması gösterilmez. FSL sonrası etiketleme gerekliydi. Bu histogram, FSL floresein ile etiketlenmiş insan A Porto Riko 8, 19, 34 veya H bir N bir VIR ile enfekte olmuş domuz testis hücrelerini gösterir.

Floresan olmayan enfekte olmamış hücreler siyah çizgi ile temsil edilirken, H bir N bir koronun domuz hücreleri ile füzyonu kırmızı çizgi ile gösterilir, bu da floresan ile sonuçlanır. Bu sonraki görüntü serisinde, hücreler önce 37 santigrat derecede bir saat boyunca FSL biyotin ile etiketlendi, daha sonra yıkandı ve Fluor dört etiketli avadon ile reaksiyona sokuldu ve daha sonra floresan mikroskobu için yıkandı ve ıslak olarak monte edildi. İlk görüntü, bir murin embriyo blasts yardımının derlenmiş bir konfokal görüntüsünü gösterir ve bu şekil, önceki görüntüden embriyonun merkezi bir konfokal dilimini gösterir.

İşte canlı hareketli insanlar perma zoa. Bulanıklık, hareketlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Yerleştirme sonrası %4 Paraform aldehit içine sabitlenmiş insan spermatozoasının daha belirgin bir temsili görüntüsü bu şekilde görülebilir.

FSL biyotin işaretli insan eritrositleri, aşağıdaki iki şekilde gösterildiği gibi %4 paraform aldehit pres yerleştirilmesi FSL etiketlemesini etkilemediği ile fiksasyon gösterilmiştir, burada %4 parmal sabit RL 95 endometriyal insan karsinomu hücreleri gözlenebilir. Bu görüntüde ise RL 95 endometriyal insan karsinomu hücreleri sabit değildir. Fiksasyonlu veya fiksasyonsuz iki görüntü arasında etiketlemede neredeyse hiçbir fark gözlenmez.

Sitlerin intravenöz infüzyonundan iki saat sonra alınan bir kan örneğinde gözlenen FSL biyotin işaretli RBC sitleri burada solda gösterilmiştir, hücreler sağda ışık mikroskobu altında görüntülendi, aynı hücre alanı floresan altında görüntülendi ve mevcut iki sit yeşil renkte tanımlanabilir. Sitlerin etiketlenmemiş hücrelere oranının hesaplanması, hayatta kalmanın bir göstergesi olarak kullanılabilir. Bu son FSL biyotin etiketli hücre görüntüsü, azaltılmış boncuklara bağlanarak görselleştirilen canlı insan endometriyal biyotin sitlerini göstermektedir.

Bu son görüntü serisi, FSL'nin kan grubu belirteçleri ile yapı etkileşimlerini göstermektedir. İlk görüntü, insan serumunun seyreltilmesine karşı test edilen mililitre başına 500 mikrogram FSLG ile kaplanmış insan kırmızı hücre GLI sitlerine aittir. İnsan kırmızı hücreleri, Xena antijeni GALI antijeni ile doğal olarak reaksiyona girmez.

Bu nedenle, sitler serumdaki antikor seviyelerini ölçmek için kullanılabilir. Bu örnekte, hastanın FSL seviyeleri azalan sitler oluşturarak bir ila 32 arasında bir antiga titresine sahip olduğu belirlendi. Bir antijen titresi oluşturmaya benzer şekilde, antikoru tespit etmek için optimal bir antijen seviyesi belirlenebilir, hücreler yalnızca antikor seviyesi belirli bir titreyi aştığında pozitif bir sonuç verecek şekilde oluşturulabilir.

Pozitif bir sonuç vermek için gereken FSL antijen seviyesi, tespit edilen antikorun kalitesine ve seviyesine bağlıdır. Tipik olarak karbonhidrat antijenleri için, mililitre başına 100 mikrogramlık bir FSL çözeltisi, güçlü bir pozitif reaksiyona neden olacaktır. İnsan grubu O kırmızı hücreleri, belirli bir antijen seviyesine sahip olacak şekilde modifiye edilmiş veya standartlaştırılmış olarak adlandırılmıştır.

İnsan serumundaki antia'yı doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde kantitatif hale getirmek için bir sit kullanılır. Bu örnekte, sitler donörün kendi kırmızı hücrelerinden hazırlandı ve test edilen O grubu serumundaki antia seviyesi bir ila 32 arasında bulundu. Burada altıncı tüpte gösterilen, tek bir grup O kırmızı hücre örneğine aynı anda eklenen kan grubu A ve B antijenleri, bir hafta, B haftası sitleri oluşturmak için kullanıldı.

Bu sitler bir VO kalite kontrol amacıyla kullanılabilir. Antia ve anti B reaktiflerine karşı özel olarak formüle edilmiş bir hafta, B haftası sitinin analizi, tüplerin orta alt bölgesinde meydana gelen reaksiyonlarla bu şekilde kanıtlandığı gibi beklenen zayıf reaksiyonları verir. Bu basit teknik, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.