Name: Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Öğrenin, parafin gömülü bitki dokularında mRNA ifade desenlerini görselleştirmek için hassas yerinde hibridizasyon yöntemini. Bu teknik, gen ifadesini doku bağlamında yüksek duyarlılıkla incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MT laboratuvar Araştırma Ulusal Bilim Vakfı (DBI-0.820.610 ve IOS-1.022.102) ve New York Sağlık Dairesi (NYSTEM C024308) hibe tarafından desteklenmektedir. CM, Eğitim ve Bilim (2007-0937) ve Vakfı Rafael del Pino, İspanya İspanyol Bakanlığı, doktora sonrası burslar aldı.

<ol><li>Rensink, W. A., Buell, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+expression+profiling+resources+for+plant+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant.+Sci%22%5BJournal%5D)">Microarray expression profiling resources for plant genomics.</a> Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).</li>
<li>Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).</li>
<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
<li>Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-mediated+repression+of+rolled+leaf1+specifies+maize+leaf+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity.</a> Nature. 428, 84-88 (2004).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
<li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li>
<li>Kidner, C., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+as+a+tool+to+study+the+role+of+microRNAs+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development.</a> Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+of+KNOTTED1+mRNA+and+protein+reveals+multiple+potential+sites+of+protein+trafficking+in+the+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot.</a> 129, 1423-1429 (2002).</li>
<li>Jensen, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJensen%2C+WA+%22Botanical+Histochemistry%22">Botanical Histochemistry</a>. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Pathology%3A+A+Practical+Approach%22">Molecular Plant Pathology: A Practical Approach</a>. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).</li>
<li>Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+via+small+RNA+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation via small RNA mobility.</a> Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).</li>
<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
<li>Long, J. A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li>
<li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada özetlenen in situ hibridizasyon yöntemi büyük hücresel çözünürlük, yüksek duyarlılık ve özgüllük ile ilgi herhangi bir genin Spatiotemporal ifade deseninin doğrudan görselleştirme sağlar . Protokol genler arasında ekspresyon düzeyleri kantitatif bir karşılaştırma izin vermez. Ancak, yöntemin yüksek hassasiyet ve çözünürlük, gen ekspresyonu analiz diğer yöntemler ile mümkün olmayan bir doku 8, 18, ​​içinde, gen ekspresyonu degradeler ortaya çıkarabilir. Protokol, sorun giderme sorunlu yapabilirsiniz birçok adımları içerir. Protokolün en kritik adımlardan doku fiksasyon ve prob seçimi ve etiketleme. Düşük DIG dahil Kötü sızmış doku ve sondalar arka plan yukarıda tespit etmek zor olabilir çok zayıf sinyaller verecektir. Ilgi her yeni gen için, farklı türetilmiş bir kaç farklı problar denemek için tavsiye edilirtranskript bölgelerde kira. Bazen genin farklı bölgelerde küçük hedefleyen iki veya üç probları güçlü ve spesifik hibridizasyon sinyali elde etmek için bir araya gerekebilir. Buna ek olarak, hibridizasyon koşulları, sıcaklık ve hibridizasyon tamponu bileşimi olarak, hibridizasyon darlığı düşük ya da arttırmak için her bir gen ya da doku için optimize edilebilir. Ayrıca proteaz tedavi adım bir değişken ve farklı bitki türleri için ya da çok düşük bolluğu ile transkript tespiti için protokol adapte değiştirilebilir. Hem pozitif ve negatif kontrol probları dahil protokolün sorunlu noktaları belirlenmesinde yararlı olacaktır. Prosedür parafine gömülü bitki doku bölümleri için optimize edilmiştir, ancak küçük değişiklikler, in situ hibridizasyon tüm montaj için de kullanılıyor olabilir. In situ hibridizasyon hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar 19, tüm montaj yaygın olarak kullanılmasına karşın l olacakembriyolar, kökler veya genç Meristematik dokuların 20,21 gibi kolayca sızmış olabilir bitki dokularında imited. Protokol aynı zamanda, eş zamanlı olarak iki ayrı mRNA&#39;ların algılamak veya proteinleri 15,22,23 birlikte transkript lokalize kolayca değiştirilebilir. Sonuç olarak, bu yöntemin uygulama bitkilerin küçük RNA ekspresyonu görselleştirme uzatmak mümkündür. miRNA ekspresyonu, mısır ve Arabidopsis 8,14 hem de bu protokolü kullanılarak tespit edilmiştir . Daha yakın zamanlarda, in vitro transkripsiyonu probları yerini almış piyasada bulunan DIG etiketli kilitli nükleik asit (LNA) oligo probları artış hassasiyeti ve sinyal 18, 24 .

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Açıklamalar </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4oz </td><td> Balıkçı </td><td> 23-244-256 </td><td> Toluen-tabanlı 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Balıkçı </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Doku Yol paraplast Plus, </td><td> Balıkçı </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + naylon membran Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNaz OUT; 40 U / mcL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNaz-Alerjik DNaz, 1 U / ml </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG etiketli Kontrol RNA </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA etiketleme karışımı </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimeraz 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA polimeraz 1000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> gliserol 50% Tris 100 mM pH8.0 içinde çözülür </td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> 70 ° C TBS tampon kadar ısıtın. </td></tr><tr><td> Anti-Digoxygenin-AP, koyun 150 U Fab parçaları </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP stok solüsyonu </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> mini Hızlı Spin RNA Sütunlar </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> E. gelen tRNA coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Deiyonize formamid </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz gelen Streptomyces griseus Tip XIV. </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> MilliQ su ve pre-digest 4 saat içinde seyreltilir 37 ° C </td></tr><tr><td> Trietanolamin </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Su seyreltik HCl ile pH8.0 getirmek </td></tr><tr><td> Asetik anhidrit </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstran sülfat sodyum tuzu Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Dekstran Sülfat, 80 ° C çözülür ısıtılmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> Denhardt Solüsyonu 50x Konsantre </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumin - ≥% 98 </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin Y disodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Doymuş kadar 96-100% etanol içinde çözülür </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol mutlak 200 kanıtı </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fenol / kloroform </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baz kalıp </td><td> Elektronik Microsocpy Bilim </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Katıştırma halkaları </td><td> Balıkçı </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml tek sintilasyon şişeleri, kapakları </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Probe-on-artı slaytlar </td><td> Balıkçı </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Micro kapak gözlük 24x50 mm </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman kağıt 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Üç cam tabaklar ve bir stainless çelik slayt raf </td><td> Elektronik Microsocpy Bilim </td><td> 71420-25 </td><td> Histoclear tedavi için gerekli olan iki cam bombeli ve sonuncusu asetik anhidrit tedavisi için kullanılır </td></tr><tr><td> 18 temiz plastik kaplar </td><td> Elektronik Microsocpy Bilim </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 veya 3 yapışmalı, kapaklı büyük düz plastik kutular </td><td></td><td></td><td> hibridizasyon ve antikor adımlar için gerekli </td></tr><tr><td> İnce fırça </td><td></td><td></td><td> Balmumu şeritler teslim Yardım </td></tr><tr><td> Mikroskobik dilimleme aleti </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Kendi kendini temizleyen kuru vakum sistemi </td><td> Şartları yerine getirmemek </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcak kaydırın. </td><td> Balıkçı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isıtma bloğu </td><td></td><td></td><td> 60 ° C ve 85 ° C&#39;de gerekli</td></tr><tr><td> 58-60 az İnkübatör ° C </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> Erimiş paraplast adımlar için </td></tr><tr><td> Fırınlar veya su banyoları 55 ° C ile 37 ° C </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> Sıcaklıklar arasındaki hızlı değişim nedeniyle iki ihtiyacınız var </td></tr><tr><td> Santrifüj (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Davlumbaz </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bitkilerde transkriptler hassas yerelleştirme situ hibridizasyon

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Geçtiğimiz on yıl genomik araştırma gelişmelerle birlikte, bitki biyolojisi, gen ekspresyonu büyük ölçekli kantitatif analizleri gösteren çok sayıda çalışma gördü. Mikroarray ve yeni nesil sıralama yaklaşımlar, gelişimsel, fizyolojik ve stres yanıtı süreçlerini araştırmak, epigenetik ve küçük RNA yollar teşrih ve 1-3 büyük gen düzenleyici ağlar oluşturmak için kullanılmaktadır . Bu tekniklerin büyük gen setleri eşzamanlı analizi kolaylaştırmak iken, genellikle gen ekspresyonu değişiklikleri çok sınırlı uzaysal çözünürlüğü sağlar. Bu sınırlama kısmen lasermicrodissection ile birlikte ya da 4-7 sıralama floresan ile aktive olan hücre yöntemi kullanarak ya profil üstesinden gelinebilir . Ancak, tam bir genin biyolojik rolünü anlamak için, bir hücresel çözünürlükte ifade Spatiotemporal desen bilgisi şarttır. Özellikle, geliştirme veya çevre sti etkileri eğitimMuli ve mutantlar bir gen ifade deseninin ayrıntılı analizi gerekli olabilir. Örneğin, belirli bir hücre türleri ifade kaybı veya kazancı ile ilgili anahtar düzenleyici genlerin ekspresyon düzeyleri ince kantitatif farklılıklar dramatik fenotipleri yol açabilir. Çeşitli yöntemler rutin ayrıntılı inceleme için gen ekspresyonu kullanılır. Bir transgenik muhabiri hatlarının analizi yoluyla. Böyle bir analiz, birden fazla genin analiz veya dönüşüm inatçı tesislerinde çalışırken Ancak, zaman alıcı olabilir. Ayrıca, bağımsız bir doğrulama transgen ifade desen endojen gen taklit sağlamak için genellikle gereklidir. İmmünohistokimyasal protein yerelleştirme veya mRNA in situ hibridizasyon, gen ekspresyonu hücre ve dokuları içinde doğrudan görünüm için nispeten hızlı alternatifler sunuyoruz . Ikincisi kolayca u ayrı bir avantajı varilgi herhangi bir gen sed in situ hibridizasyon ilgi gen in vitro transkripsiyon elde prob etiketli anti-sense RNA hibridizasyon hücreleri hedef mRNA&#39;ların algılanmasını sağlar . Burada yüksek hassasiyet ve özel bitkilerde gen ekspresyonu in situ lokalizasyonu için bir protokol anahat. Paraformaldehid sabit, parafine gömülü bölümleri, histoloji mükemmel koruma sağlar ve immün algılama ve alkalin fosfataz kolorimetrik reaksiyon tarafından görüntülenmiştir DIG etiketli probları ile kullanım için optimize edilmiştir. Bu protokol bitki türlerinin geniş bir dokuların bir dizi başarıyla uygulanan ve mRNA&#39;ların yanı sıra küçük RNA&#39;lar 8-14 ifade analiz etmek için kullanılır.

<em&gt; Yerinde</emBurada açıklanan&gt; hibridizasyon protokolü, yüksek duyarlılık ve özgüllük ile hücresel düzeyde mRNA ve küçük RNA ifade doğrudan yerelleştirme sağlar. Prosedürü, parafine gömülü bitki doku bölümleri için optimize edilmiş, bitki ve dokuların geniş bir yelpazede uygulanabilir ve on gün içinde tamamlanabilir.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Geçtiğimiz on yıldaki genomik araştırma ilerlemeleriyle birlikte bitki biyolojisi, genlerin geniş ölçekli kantitatif analizlerini sunan çok sayıda çalışmaya tanık olmuştur...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mRNA ekspresyon paternlerini hücresel düzeyde yüksek hassasiyet ve özgünlükle görselleştirmektir. Bu işlem; öncelikle formalinle fikse edilmiş ve parafinle gömülmüş doku kesitlerinin, balmumu tabakasını uzaklaştırmak için bir dizi çözeltiden geçirilmesi, dokuların permeabilize edilmesi ve dokularda arka plan sinyali oluşturabilecek pozitif yüklü minör grupların bloklanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ilgilenilen gene özgü DIG etiketli RNA probları doku kesitlerine infiltre edilir ve lamlar gece boyunca hibridize edilir.Ardından, kesitlerden spesifik olmayan şekilde bağlanmış probları uzaklaştırmak için lamlar RNA'lar ile işleme tabi tutulur ve daha sonra anti DIG antikoru ile inkübe edilir. Bu işlem, hibridize olmuş probun kolorimetrik bir kimyasal reaksiyon aracılığıyla görüntülenmesini sağlar.Sonuçlar, ışık mikroskopu ile özellikle doku içindeki ilgili genin eksprese edildiği hücrelerde saptanabilen koyu mavi bir sinyal göstermektedir. Bu tekniğin R-T-P-C-R, mikroarray veya Yeni Nesil Dizileme yaklaşımları gibi diğer ekspresyon analizlerimize göre temel avantajı, burada gösterilen Hibridizasyon protokolünün ilgili bir genin ekspresyon paternini doku bağlamında ortaya çıkarmasıdır. Bu yöntemler, görsel gösterimlerle en iyi şekilde öğrenilen birçok adım içermektedir.Dokuların nasıl kesileceğini ve gömüleceğini, ayrıca Al Hibritleme pro protokolünde tek başına ustalaşılması zor olan temel adımları göstereceğiz. Paraldehit ile fikse edilmiş dokuların gömme yöntemi, analiz edilecek doku tipine göre değişiklik gösterecektir. Buradaki en önemli nokta, örneklerin daha sonraki kesim işlemi için doğru şekilde yönlendirildiğinden emin olmaktır.Gömme yöntemlerinden biri, plastik kalıplar ve halkalar kullanmaktır. Bu prosedüre başlamak için kalıpları 60 °C'lik bir ısıtıcı plaka üzerinde ısıtın ve ardından kalıpların içine eritilmiş parafin dökün. Daha sonra, ısıtılmış pensler kullanarak her bir kalıba bir doku örneği aktarın ve örneği istenen konumda yönlendirin.Kalıbı plaka üzerinden tezgaha dikkatlice taşıyın ve beyaz halkayı kalıbın üzerine yerleştirin. Ek mol ve balmumu ekleyin. Kesme işleminden önce balmumunun kademeli olarak soğumasına ve sertleşmesine izin verin.Blokları oda sıcaklığına getirip ardından her bir bloğu, numunenin etrafında yaklaşık bir milimetre balmumu kalacak şekilde yamuk formunda kesin. Kırpılan bloğu, iki paralel yüzeyden uzun olanı altta kalacak şekilde mikrotoma yerleştirin. Bloğu dikkatlice bıçağa yaklaştırın ve bloğun yüzeyinin bıçak kesitine paralel olduğundan emin olun.Sekiz ila 10 mikron kalınlığında. Parafin şeritlerini alüminyum folyo gibi yapışmaz bir yüzey üzerine hizalayın ve bir diseksiyon mikroskobu altında ilgi çeken bölümleri seçin. Ardından, prob bon plus lamlarını kurşun kalemle işaretleyin.INI iki hibridizasyon protokolü sırasında silinecekleri için işaretleyiciler üzerinde kalem kullanmayın. Her bir lamın üzerine bir mililitre temiz milli Q suyu dağıtın. İlgilenilen kesitleri oda sıcaklığında suyun yüzeyine dikkatlice bırakın.Parlak tarafın suya baktığından emin olun. Lamı yavaşça bir lam ısıtıcıya aktarın. 35 ila 37 °C'ye ayarlayın. Yaygın olarak kullanılan 42 °C'nin aksine bu sıcaklık aralığı, kesitlerin altında hava kabarcığı oluşumunu önler. Beş dakika sonra, şerit lamın üzerine inecek şekilde suyu dikkatlice ancak tek ve akıcı bir hareketle boşaltın. Dokunun yapışması ve doku kesitlerinin hazırlanması için lamları en az birkaç saat veya gece boyunca 37 °C'de kurumaya bırakın.In situ hibridizasyon için, deparafinizasyon işlemini tamamlamak amacıyla örnekler önce deparafinize edilir ve ardından rehidrate edilir. Lamları, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez histik clear çözeltisi ile inkübe edin. Doku kesitlerini rehidrate etmek için lamları, her birinde 30 saniye kalacak şekilde azalan konsantrasyonlu etanol serisinden geçirin.Bu videoda gösterilmeyen proteaz işlemi sırasında, 0,1 molar trietanolamin çözeltisi içeren bir cam kap hazırlayın ve bunu bir çeker ocak içindeki manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Metal lam rafını çözeltiye yerleştirmeden hemen önce, trietanolamin, tampon ve karıştırma düzeneğine 1,25 mililitre asetik anhidrit ekleyin. Ayrıca, lam rafını tutmak için sıkıştırma sistemini ve standı kurun.Starr klembinin hızını düşürün, lam rafını standa sabitleyin ve rafı, manyetik karıştırıcı çubuğun üzerinde kalacak şekilde çözeltiye daldırın. PBS ile durulandıktan ve tekrar bir etanol serisi ileye dehidre edildikten sonra 10 dakika boyunca yavaşça karıştırmaya devam edin. Doku kesitleri hibridizasyon için hazırdır.Lamları temiz bir yüzeye yerleştirin ve beş ila 10 dakika boyunca tamamen havada kurumaya bırakın. Denatüre edilmiş probu 80 µL hibridizasyon tamponuna ekleyerek prob hibridizasyon tamponu karışımını hazırlayın. Her bir lam için, hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek pipetleme yoluyla iyice karıştırın.Prob hibridizasyon tamponunu pipetleyin. Lamın sağ kenarına karıştırın. Hibridizasyon solüsyonunun tüm kesitleri baloncuk kalmadan kapladığından emin olarak, bir lamellenin yavaşça lam üzerine indirin.Tüm doku kesitlerindeki hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için, kabarcıkların oluştuğu yerlerde lam kapatma camına parmağınızla hafifçe vurun. Kapatma camını çekmeyin, aksi takdirde kesitler zarar görecektir. Lamları, UE suyu ile nemlendirilmiş Watman kağıdı içeren ve büyük ölçüde parafilm ile kapatılmış bir nem odasına yerleştirin.Kutuyu sıkıca kapatın ve lamları istenen hibridizasyon sıcaklığında, genellikle 16 ila 20 saat boyunca 50 ila 55 degrees Celsius'te inkübe edin. Hibridizasyon protokolü tamamlandığında, lamelleri lamların üzerinden dikkatlice kaldırın. Lam dik konuma getirildiğinde lamel kendiliğinden düşebilir; ancak düşmezse, kesitlere zarar vereceği için lameli çekerek çıkarmayın.Bunun yerine, lamel çıkarıldıktan sonra lameli temizlemek için bir veya iki dakika boyunca ılık 0.2 kat SSC içine daldırın, lamleri bir rafa yerleştirin ve 55 °C'de 0.2 kat SSC ile birkaç kez yıkayın. RNAse işlemi sonrası lamleri raftan düz plastik bir kutunun tabanına aktarın ve üzerini minimum hacimde bloklama çözeltisi ile kaplayın. Lamleri oda sıcaklığında, yavaşça sallanan bir platform üzerinde 45 dakika boyunca bloklayın.Ardından, her bir lama doğrudan minimum hacimde antikor çözeltisi uygulayın. Lamları oda sıcaklığında, karanlıkta iki ila üç saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, lamları temiz ve düz bir kutuya aktarın ve oda sıcaklığında, bir çalkalama platformu üzerinde minimum hacimde yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.Lamları bir kez TBS ile ve iki kez TN tamponu ile durulayın ve taze hazırlanmış boyama solüsyonunu lamlara uygulayın. Öncelikle, boyama solüsyonunu küçük bir plastik tartım kabına dökün. Ardından, iki lamı kesitler birbirine bakacak şekilde üst üste getirin.Sandviçi solüsyona daldırarak kılcal hareketin solüsyonu yukarı çekmesini sağlayın. Lamları bir kim wipe üzerinde süzün. Lamları boyama solüsyonu ile doldurun.Tekrar, solüsyon akarken kabarcıkları önlemek için lamlara hafifçe vurulması gerekebilir; lamları plastik bir kutuya yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta saklayın. Farklı problar ve arabidopsis dokuları ile elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Mor sinyal, ilgilenilen genin ekspresyon paterninin hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirilmesini sağlar.Panel A, vejetatif sürgün apeksindeki sürgün Meli one transkriptlerinin lokalizasyonunu göstermektedir. Meristemin belirsiz bölgesindeki mor mavi sinyale ve çevredeki yapraklarda sinyal eksikliğine dikkat ediniz. Panel B 2D, arabidopsis torpedo evresi embriyolarının kesitleridir; burada B, az sayıdaki embriyonik kök hücredeki covata üç ekspresyonunu göstermektedir.C, epidermal tabakada T ML one ekspresyonunu göstermekte ve D, rastgele bir negatif kontrol RNA ile incelenen kesitlerde sinyal eksikliğini göstermektedir. Sonraki görüntüler, mısır dokuları üzerinde farklı problarla elde edilen sonuçları göstermektedir. Panel E, gelişmekte olan mısır embriyosunda STM Humalog knotted one lokalizasyonunu göstermektedir.Panel F'de embriyonik mes gövde ve kök boyuna kesitlerindeki ve vejetatif sürgün apeksindeki güçlü sinyalin, ARF three A'nın aksiyal alt yaprak yüzeyinde ifade edildiğini ve panel G'de ATML one homologu OCL four'ün spesifik olarak epidermiste ifade edildiğini gözlemleyin. Beklendiği üzere, panel H'deki negatif kontrol probu için herhangi bir hibridizasyon sinyali gözlenmemiştir. Probların in vitro transkripsiyonu sırasındaki farklı kontrol noktalarının beklenen sonuçları burada gösterilmiştir. In situ hibridizasyon probları; DNA işlemi ve ardından in vitro transkripsiyon reaksiyonunun saflaştırılmasının ardından standart bir ARAZ jelinde kontrol edilir. Prob 1 gibi 250 baz çiftinden uzun problar için karbonat hidrolizi sonrası ve kullanıma hazır hale geldiklerinde, karbonat hidrolizi bir dizi daha küçük prob fragmanı oluşturacaktır.Bu şekil, 100 ng/µL konsantrasyondaki bir kontrol probu ile yeni işaretlenmiş üç DIG işaretli probun 10⁻¹ ile 10⁻⁵ arasında değişen dilüsyonlarının dot blot analizi ile yapılan renk ve metrik kalifikasyon sonuçlarını göstermektedir; proplar, anti-DIG antikor ve assay ile inkübe edilmiş bir transfer membranına damlatılmıştır. Analiz; prob iki için tahmini 100 ng/µL, prob üç için 10 ng/µL ve prob dört için 1 ng/µL konsantrasyon önermektedir; bu durum, prob dördün iyi bir in situ hibridizasyon sinyali verme olasılığının düşük olduğunu göstermektedir. Son olarak, mısırda vejetatif sürgün apeksinden alınan bu boyuna kesitler, spesifik olmayan bir arka plan sinyali ile iyi çalışan bir prob paneli arasında karşılaştırma sunmaktadır.A, spesifik olmayan bir arka plan sinyali gösterirken, B paneli dış hücre tabakasındaki OC five probu için spesifik bir in situ iki hibridizasyon sinyali göstermektedir. Bunu izledikten sonra, favori genlerinizin kesin basınç zamansal ekspresyon modellerini belirleyebilmeniz için in situ hibridizasyon protokollerindeki birçok kritik adımı nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız.

in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

Bu protokol başarıyla kantitatif omurgalı türlerin birden çok doku tipleri düzeyleri ve mRNA mekansal kalıpları tespit etmek için kullanılır. Yöntem, düşük bolluk transkript algılamak ve aynı anda slayt yüzlerce işleme izin edebilirsiniz. Biz örnek olarak kuş embriyonik beyin oluşumu ekspresyon profili kullanarak bu protokolü sunarız.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Bu protokol, inatçı bitki dokuları için yararlı olan basit bir Hibrit-Kesim doku kesitleme yöntemini tanımlar. Kaliteli doku kesitleri, anatomik çalışmalara ve in situ hibridizasyon (ISH) dahil olmak üzere diğer biyolojik çalışmalara olanak tanır.

Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Öğrenin, parafin gömülü bitki dokularında mRNA ifade desenlerini görselleştirmek için hassas yerinde hibridizasyon yöntemini. Bu teknik, gen ifadesini doku bağlamında yüksek duyarlılıkla incelemenizi sağlar.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet