Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mRNA ekspresyon paternlerini hücresel düzeyde yüksek hassasiyet ve özgünlükle görselleştirmektir. Bu işlem; öncelikle formalinle fikse edilmiş ve parafinle gömülmüş doku kesitlerinin, balmumu tabakasını uzaklaştırmak için bir dizi çözeltiden geçirilmesi, dokuların permeabilize edilmesi ve dokularda arka plan sinyali oluşturabilecek pozitif yüklü minör grupların bloklanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ilgilenilen gene özgü DIG etiketli RNA probları doku kesitlerine infiltre edilir ve lamlar gece boyunca hibridize edilir.

Ardından, kesitlerden spesifik olmayan şekilde bağlanmış probları uzaklaştırmak için lamlar RNA'lar ile işleme tabi tutulur ve daha sonra anti DIG antikoru ile inkübe edilir. Bu işlem, hibridize olmuş probun kolorimetrik bir kimyasal reaksiyon aracılığıyla görüntülenmesini sağlar.

Sonuçlar, ışık mikroskopu ile özellikle doku içindeki ilgili genin eksprese edildiği hücrelerde saptanabilen koyu mavi bir sinyal göstermektedir. Bu tekniğin R-T-P-C-R, mikroarray veya Yeni Nesil Dizileme yaklaşımları gibi diğer ekspresyon analizlerimize göre temel avantajı, burada gösterilen Hibridizasyon protokolünün ilgili bir genin ekspresyon paternini doku bağlamında ortaya çıkarmasıdır. Bu yöntemler, görsel gösterimlerle en iyi şekilde öğrenilen birçok adım içermektedir.

Dokuların nasıl kesileceğini ve gömüleceğini, ayrıca Al Hibritleme pro protokolünde tek başına ustalaşılması zor olan temel adımları göstereceğiz. Paraldehit ile fikse edilmiş dokuların gömme yöntemi, analiz edilecek doku tipine göre değişiklik gösterecektir. Buradaki en önemli nokta, örneklerin daha sonraki kesim işlemi için doğru şekilde yönlendirildiğinden emin olmaktır.

Gömme yöntemlerinden biri, plastik kalıplar ve halkalar kullanmaktır. Bu prosedüre başlamak için kalıpları 60 °C'lik bir ısıtıcı plaka üzerinde ısıtın ve ardından kalıpların içine eritilmiş parafin dökün. Daha sonra, ısıtılmış pensler kullanarak her bir kalıba bir doku örneği aktarın ve örneği istenen konumda yönlendirin.

Kalıbı plaka üzerinden tezgaha dikkatlice taşıyın ve beyaz halkayı kalıbın üzerine yerleştirin. Ek mol ve balmumu ekleyin. Kesme işleminden önce balmumunun kademeli olarak soğumasına ve sertleşmesine izin verin.

Blokları oda sıcaklığına getirip ardından her bir bloğu, numunenin etrafında yaklaşık bir milimetre balmumu kalacak şekilde yamuk formunda kesin. Kırpılan bloğu, iki paralel yüzeyden uzun olanı altta kalacak şekilde mikrotoma yerleştirin. Bloğu dikkatlice bıçağa yaklaştırın ve bloğun yüzeyinin bıçak kesitine paralel olduğundan emin olun.

Sekiz ila 10 mikron kalınlığında. Parafin şeritlerini alüminyum folyo gibi yapışmaz bir yüzey üzerine hizalayın ve bir diseksiyon mikroskobu altında ilgi çeken bölümleri seçin. Ardından, prob bon plus lamlarını kurşun kalemle işaretleyin.

INI iki hibridizasyon protokolü sırasında silinecekleri için işaretleyiciler üzerinde kalem kullanmayın. Her bir lamın üzerine bir mililitre temiz milli Q suyu dağıtın. İlgilenilen kesitleri oda sıcaklığında suyun yüzeyine dikkatlice bırakın.

Parlak tarafın suya baktığından emin olun. Lamı yavaşça bir lam ısıtıcıya aktarın. 35 ila 37 °C'ye ayarlayın.

Yaygın olarak kullanılan 42 °C'nin aksine bu sıcaklık aralığı, kesitlerin altında hava kabarcığı oluşumunu önler. Beş dakika sonra, şerit lamın üzerine inecek şekilde suyu dikkatlice ancak tek ve akıcı bir hareketle boşaltın. Dokunun yapışması ve doku kesitlerinin hazırlanması için lamları en az birkaç saat veya gece boyunca 37 °C'de kurumaya bırakın.

In situ hibridizasyon için, deparafinizasyon işlemini tamamlamak amacıyla örnekler önce deparafinize edilir ve ardından rehidrate edilir. Lamları, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez histik clear çözeltisi ile inkübe edin. Doku kesitlerini rehidrate etmek için lamları, her birinde 30 saniye kalacak şekilde azalan konsantrasyonlu etanol serisinden geçirin.

Bu videoda gösterilmeyen proteaz işlemi sırasında, 0,1 molar trietanolamin çözeltisi içeren bir cam kap hazırlayın ve bunu bir çeker ocak içindeki manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Metal lam rafını çözeltiye yerleştirmeden hemen önce, trietanolamin, tampon ve karıştırma düzeneğine 1,25 mililitre asetik anhidrit ekleyin. Ayrıca, lam rafını tutmak için sıkıştırma sistemini ve standı kurun.

Starr klembinin hızını düşürün, lam rafını standa sabitleyin ve rafı, manyetik karıştırıcı çubuğun üzerinde kalacak şekilde çözeltiye daldırın. PBS ile durulandıktan ve tekrar bir etanol serisi ileye dehidre edildikten sonra 10 dakika boyunca yavaşça karıştırmaya devam edin. Doku kesitleri hibridizasyon için hazırdır.

Lamları temiz bir yüzeye yerleştirin ve beş ila 10 dakika boyunca tamamen havada kurumaya bırakın. Denatüre edilmiş probu 80 µL hibridizasyon tamponuna ekleyerek prob hibridizasyon tamponu karışımını hazırlayın. Her bir lam için, hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Prob hibridizasyon tamponunu pipetleyin. Lamın sağ kenarına karıştırın. Hibridizasyon solüsyonunun tüm kesitleri baloncuk kalmadan kapladığından emin olarak, bir lamellenin yavaşça lam üzerine indirin.

Tüm doku kesitlerindeki hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için, kabarcıkların oluştuğu yerlerde lam kapatma camına parmağınızla hafifçe vurun. Kapatma camını çekmeyin, aksi takdirde kesitler zarar görecektir. Lamları, UE suyu ile nemlendirilmiş Watman kağıdı içeren ve büyük ölçüde parafilm ile kapatılmış bir nem odasına yerleştirin.

Kutuyu sıkıca kapatın ve lamları istenen hibridizasyon sıcaklığında, genellikle 16 ila 20 saat boyunca 50 ila 55 degrees Celsius'te inkübe edin. Hibridizasyon protokolü tamamlandığında, lamelleri lamların üzerinden dikkatlice kaldırın. Lam dik konuma getirildiğinde lamel kendiliğinden düşebilir; ancak düşmezse, kesitlere zarar vereceği için lameli çekerek çıkarmayın.

Bunun yerine, lamel çıkarıldıktan sonra lameli temizlemek için bir veya iki dakika boyunca ılık 0.2 kat SSC içine daldırın, lamleri bir rafa yerleştirin ve 55 °C'de 0.2 kat SSC ile birkaç kez yıkayın. RNAse işlemi sonrası lamleri raftan düz plastik bir kutunun tabanına aktarın ve üzerini minimum hacimde bloklama çözeltisi ile kaplayın. Lamleri oda sıcaklığında, yavaşça sallanan bir platform üzerinde 45 dakika boyunca bloklayın.

Ardından, her bir lama doğrudan minimum hacimde antikor çözeltisi uygulayın. Lamları oda sıcaklığında, karanlıkta iki ila üç saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, lamları temiz ve düz bir kutuya aktarın ve oda sıcaklığında, bir çalkalama platformu üzerinde minimum hacimde yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.

Lamları bir kez TBS ile ve iki kez TN tamponu ile durulayın ve taze hazırlanmış boyama solüsyonunu lamlara uygulayın. Öncelikle, boyama solüsyonunu küçük bir plastik tartım kabına dökün. Ardından, iki lamı kesitler birbirine bakacak şekilde üst üste getirin.

Sandviçi solüsyona daldırarak kılcal hareketin solüsyonu yukarı çekmesini sağlayın. Lamları bir kim wipe üzerinde süzün. Lamları boyama solüsyonu ile doldurun.

Tekrar, solüsyon akarken kabarcıkları önlemek için lamlara hafifçe vurulması gerekebilir; lamları plastik bir kutuya yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta saklayın. Farklı problar ve arabidopsis dokuları ile elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Mor sinyal, ilgilenilen genin ekspresyon paterninin hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirilmesini sağlar.

Panel A, vejetatif sürgün apeksindeki sürgün Meli one transkriptlerinin lokalizasyonunu göstermektedir. Meristemin belirsiz bölgesindeki mor mavi sinyale ve çevredeki yapraklarda sinyal eksikliğine dikkat ediniz. Panel B 2D, arabidopsis torpedo evresi embriyolarının kesitleridir; burada B, az sayıdaki embriyonik kök hücredeki covata üç ekspresyonunu göstermektedir.

C, epidermal tabakada T ML one ekspresyonunu göstermekte ve D, rastgele bir negatif kontrol RNA ile incelenen kesitlerde sinyal eksikliğini göstermektedir. Sonraki görüntüler, mısır dokuları üzerinde farklı problarla elde edilen sonuçları göstermektedir. Panel E, gelişmekte olan mısır embriyosunda STM Humalog knotted one lokalizasyonunu göstermektedir.

Panel F'de embriyonik mes gövde ve kök boyuna kesitlerindeki ve vejetatif sürgün apeksindeki güçlü sinyalin, ARF three A'nın aksiyal alt yaprak yüzeyinde ifade edildiğini ve panel G'de ATML one homologu OCL four'ün spesifik olarak epidermiste ifade edildiğini gözlemleyin. Beklendiği üzere, panel H'deki negatif kontrol probu için herhangi bir hibridizasyon sinyali gözlenmemiştir. Probların in vitro transkripsiyonu sırasındaki farklı kontrol noktalarının beklenen sonuçları burada gösterilmiştir. In situ hibridizasyon probları; DNA işlemi ve ardından in vitro transkripsiyon reaksiyonunun saflaştırılmasının ardından standart bir ARAZ jelinde kontrol edilir. Prob 1 gibi 250 baz çiftinden uzun problar için karbonat hidrolizi sonrası ve kullanıma hazır hale geldiklerinde, karbonat hidrolizi bir dizi daha küçük prob fragmanı oluşturacaktır.

Bu şekil, 100 ng/µL konsantrasyondaki bir kontrol probu ile yeni işaretlenmiş üç DIG işaretli probun 10⁻¹ ile 10⁻⁵ arasında değişen dilüsyonlarının dot blot analizi ile yapılan renk ve metrik kalifikasyon sonuçlarını göstermektedir; proplar, anti-DIG antikor ve assay ile inkübe edilmiş bir transfer membranına damlatılmıştır. Analiz; prob iki için tahmini 100 ng/µL, prob üç için 10 ng/µL ve prob dört için 1 ng/µL konsantrasyon önermektedir; bu durum, prob dördün iyi bir in situ hibridizasyon sinyali verme olasılığının düşük olduğunu göstermektedir. Son olarak, mısırda vejetatif sürgün apeksinden alınan bu boyuna kesitler, spesifik olmayan bir arka plan sinyali ile iyi çalışan bir prob paneli arasında karşılaştırma sunmaktadır.

A, spesifik olmayan bir arka plan sinyali gösterirken, B paneli dış hücre tabakasındaki OC five probu için spesifik bir in situ iki hibridizasyon sinyali göstermektedir. Bunu izledikten sonra, favori genlerinizin kesin basınç zamansal ekspresyon modellerini belirleyebilmeniz için in situ hibridizasyon protokollerindeki birçok kritik adımı nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız.