Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mRNA ekspresyon modellerini hücresel düzeyde yüksek hassasiyet ve özgüllük ile görselleştirmektir. Bu, ilk olarak, balmumunu çıkarmak, dokulara nüfuz etmek ve dokularda bir arka plan sinyali verebilen pozitif yüklü küçük grupları bloke etmek için bir dizi çözelti yoluyla resmi ve sabit ve parafine gömülü doku kesitleri alarak elde edilir. Daha sonra, ilgilenilen gene özgü bir DIG etiketli RNA probları doku bölümlerine sızar ve slaytlar gece boyunca hibritlenir.

Daha sonra, slaytlar RNA'lar ile muamele edilir. A, spesifik olarak bağlanmamış probu bölümlerden çıkarmak ve daha sonra anti DIG antikoru ile inkübe etmek için. Bu, hibritleştirilmiş probun bir renk metriği kimyasal reaksiyonu ile görselleştirilmesine izin verir.

Sonuçlar, özellikle ilgilenilen genin ifade edildiği doku içindeki hücrelerde ışık mikroskobu ile tespit edilebilen koyu mavi sinyali göstermektedir. Bu tekniğin, R-T-P-C-R, mikroray veya Yeni Nesil Dizileme yaklaşımları gibi diğer ekspresyon analizlerimizden temel avantajı, burada gösterilen I Hibridizasyon protokolünün, doku bağlamında ilgilenilen bir genin ekspresyon modelini ortaya çıkarmasıdır. Bu yöntemler, görsel gösterilerle en iyi şekilde öğrenilen birçok adımı içerir.

Dokunun nasıl kesileceğini ve gömüleceğini ve ayrıca Al Hybridization pro protokolünde kendi başınıza ustalaşması zor olan temel adımları göstereceğiz. Paraldehit sabit dokuları gömme yöntemi, analiz edilecek doku tipine bağlı olarak değişecektir. Buradaki en önemli nokta, numunelerin daha sonra kesit almak için doğru yönlendirildiğinden emin olmaktır.

Gömme yöntemlerinden biri plastik kalıplar ve halkalar kullanmaktır. Bu işleme başlamak için, kalıpları 60 derecelik bir ısıtma plakasında ısıtın ve ardından erimiş parafini kalıplara dökün. Ardından, bir doku örneğini her kalıba aktarmak ve istenen konuma yönlendirmek için ısıtılmış forseps kullanın.

Kalıbı dikkatlice plakadan tezgaha taşıyın ve beyaz halkayı kalıbın üzerine yerleştirin. Biraz mol ve balmumu ekleyin. Bölümlere ayırmadan önce balmumunun soğumasını ve yavaş yavaş sertleşmesini bekleyin.

Blokları oda sıcaklığına ısıtın, ardından her bloğu yamuk şeklinde kesin ve numunenin etrafında yaklaşık bir milimetre balmumu bırakın. Kesilmiş bloğu, iki paralel yüzden daha uzun olanı altta olacak şekilde mikrotomun üzerine yerleştirin. Bloğu dikkatlice bıçağa doğru getirin ve bloğun yüzeyinin bıçak bölümüne paralel olduğundan emin olun.

Sekiz ila 10 mikron kalınlığında olarak. Balmumu şeritlerini alüminyum folyo gibi yapışmaz bir yüzeye hizalayın ve bir diseksiyon kapsamı altında ilgilenilen bölümleri seçin. Ardından, prob bon plus slaytlarını bir kalemle işaretleyin.

INI iki hibridizasyon protokolü sırasında silinecekleri için işaretleyiciler üzerinde kalem kullanmayın. Her slayta bir mililitre temiz milli Q su dağıtın. İlgilenilen bölümleri su yüzeyinde oda sıcaklığında dikkatlice yüzdürün.

Parlak tarafın suya baktığından emin olun. Sürgüyü yavaşça bir sürgü ısıtıcısına aktarın. 35 ila 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Bu sıcaklık aralığı, yaygın olarak kullanılan 42 santigrat derecenin aksine, bölümlerin altında kabarcık oluşumunu engeller. Beş dakika sonra, suyu dikkatlice ancak tek bir yumuşak hareketle dökün, böylece şerit slaytın üzerine indirilir. Slaytları en az birkaç saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede kurumaya bırakın, böylece doku bölümleri hazırlamak için doku yapışır.

Yerinde hibridizasyon için, önce depa edilirler ve depa sonlandırması için yeniden sulandırılırlar. Slaytları, her biri 10 dakika boyunca iki santik berrak çözelti değişikliğinde inkübe edin. Doku bölümlerini yeniden sulandırmak için, slaytları her biri 30 saniye boyunca bir dizi azalan etanol konsantrasyonundan geçirin.

Bu videoda gösterilmeyen proteaz tedavisi sırasında, 0.1 molar triatlon amin çözeltisi içeren bir cam tabak hazırlayın ve bunu bir çeker ocakta bir karıştırma plakasına koyun. Metal sürgülü rafı çözeltiye yerleştirmeden hemen önce, triatlon amin, tampon ve merdiven boşluğuna 1.25 mililitre asetik anhidrit ekleyin. Ek olarak, sıkıştırma sistemini ayarlayın ve sürgülü rafı tutmak için sehpa.

Starr'ın hızını azaltın, sürgülü rafı standın üzerine sıkıştırın ve rafı, karıştırma çubuğunun üzerinde yüksekte tutarak çözeltiye indirin. PBS'de durulandıktan ve bir etanol serisinden tekrar kurutulduktan sonra 10 dakika boyunca yavaşça karıştırmaya devam edin. Doku bölümleri hibridizasyon için hazırdır.

Slaytları temiz bir yüzeye yerleştirin ve havanın beş ila 10 dakika tamamen kurumasını bekleyin. Denatüre probu 80 mikrolitre hibridizasyon tamponuna ekleyerek prob hibridizasyon tamponu karışımını hazırlayın. Her slayt için pipetleme ile iyice karıştırın, ayrıca kabarcık yapmaktan kaçının.

Prob hibridizasyon tamponunu pipetleyin. Slaytın sağ kenarına karıştırın. Hibridizasyon çözeltisinin herhangi bir kabarcık olmadan tüm bölümleri kapladığından emin olarak bir kapak kızağını kızağın üzerine kademeli olarak indirin.

Kabarcıkların oluştuğu yerde kapak parçasına parmağınızla hafifçe vurun ve onları tüm doku bölümlerinden uzaklaştırın. Bölümlere zarar vereceği için kapağı çekip çıkarmayın. Slaytları, UE suyu ile nemlendirilmiş ve büyük ölçüde param ile kaplanmış watman kağıdı içeren bir nem odasına yerleştirin.

Kutuyu sıkıca kapatın, slaytları istenen hibridizasyon sıcaklığında, tipik olarak 50 ila 55 santigrat derece arasında 16 ila 20 saat boyunca inkübe edin. Hibridizasyon protokolünün tamamlanmasının ardından, lamatörleri slaytlardan dikkatlice çıkarın. Sürgü dik olarak yerleştirildiğinde kapak kayması, kolayca düşebilir, ancak aksi takdirde, bölümlere zarar vereceği için kapak kızağını çekmeyin.

Bunun yerine, kapak fişlerini çıkardıktan sonra kapak fişini yıkamak için sürgüyü bir veya iki dakika boyunca 0,2 kez SSC'ye batırın, slaytları bir rafa yerleştirin ve 55 santigrat derecede 0,2 kez SSC'de birkaç kez yıkayın. RNA'lardan sonra, bir tedavi, slaytları raftan düz bir plastik kutunun dibine aktarın ve minimum hacimde bir engelleme çözeltisi ile örtün. Slaytları yavaşça sallanan bir platformda 45 dakikalık oda sıcaklığında bloke edin.

Daha sonra, her slayta doğrudan minimum miktarda antikor çözeltisi uygulayın. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, slaytları temiz bir düz kutuya aktarın ve slaytları oda sıcaklığında sallanan bir platformda minimum hacimde yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.

Slaytlara taze hazırlanmış boyama solüsyonu uygulamak için slaytları TBS'de bir kez ve TN tamponunda iki kez durulayın. İlk olarak, boyama solüsyonunu küçük bir plastik tartı kabına dökün. Ardından, bölümleri birbirine bakacak şekilde iki slaytı birlikte sandviçleyin.

Sandviçi çözeltiye batırın ve kılcal hareketin çözeltiyi yukarı çekmesine izin verin. Slaytları bir kim mendiliyle boşaltın. Slaytları boyama solüsyonu ile doldurun.

Yine, kabarcıkları önlemek, slaytları plastik bir kutuya yerleştirmek ve oda sıcaklığını karanlıkta saklamak için çözelti akarken slaytlara vurulması gerekebilir. Farklı problar ve arabidopsis dokuları ile elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Mor sinyal, ilgilenilen genin ekspresyon modelinin hücresel çözünürlüğünde doğrudan bir görselleştirme sağlar.

Panel A, vejetatif sürgün tepesindeki sürgün Meli one transkriptlerinin lokalizasyonunu göstermektedir. Meristemin belirsizliğinde mor mavi sinyalin varlığına ve çevredeki yapraklarda sinyal eksikliğine dikkat edin. Paneller B 2D, B'nin birkaç embriyonik kök hücrede covata üç ekspresyonu gösterdiği arabidopsis torpido aşaması embriyolarının bölümleridir.

C, epidermal tabakada bir T ML bir ekspresyon gösterir ve D, rastgele bir negatif kontrol RNA'sı ile incelenen bölümlerde sinyal eksikliğini gösterir. Bu sonraki görüntüler, labirent dokuları üzerinde farklı problarla elde edilen sonuçları gösterdi. Panel E, gelişmekte olan labirent embriyosunda düğümlenmiş olan STM Humalog'un lokalizasyonunu göstermektedir.

Özellikle embriyonik mes, gövde ve kök uzunlamasına kesitlerinde, vejetatif oluk tepesi boyunca güçlü sinyalin, ARF üç, A'nın panel F'deki eksenel alt yaprak yüzeyinde ifade edildiğini ve A, T, ML bir homolog, OCL dört'ün özellikle epidermiste ifade edildiğini gösterdiğine dikkat edin. Panel G.As beklendiği gibi, panel H'deki negatif kontrol probu için herhangi bir hibridizasyon sinyali gözlenmedi.Probların in vitro transkripsiyonu sırasında farklı kontrol noktalarının beklenen sonuçları burada gösterilmektedir. İn situ hibridizasyon probları, in vitro transkripsiyondan sonra standart bir ARAZ jeli üzerinde kontrol edilir, DNA'nın tedavisinden ve ardından in vitro transkripsiyon reaksiyonunun saflaştırılmasından sonra, karbonat hidrolizinden sonra ve prob bir gibi 250 baz çiftinin üzerindeki problar için kullanıma hazır olduğunda, karbonat hidrolizi bir dizi daha küçük prob parçası verecektir.

Bu şekil, mikrolitre başına 100 nanogramlık bir kontrol probunun 10 ila eksi bir ila 10 ila eksi beş arasında değişen nokta leke analizi seyreltmeleri ile probların renk ve metrik kalifikasyonunun sonuçlarını ve üç, yeni etiketlenmiş DIG etiketli probların anti DIG antikoru ve tahlili ile inkübe edilmiş bir transfer membranı üzerinde lekelenmiştir. Analiz, ikinci sonda için mikrolitre başına 100 nanogram, sonda üç için mikrolitre başına 10 nanogram ve sonda dördüncü için mikrolitre başına bir nanogram tahmini bir konsantrasyon önermektedir, bu da dördüncü sondanın hibridizasyon sinyaline iyi bir inea verme olasılığının düşük olduğunu göstermektedir. Son olarak, Mace'den gelen vejetatif oluk tepesinden geçen bu uzunlamasına kesitler, spesifik olmayan bir arka plan sinyali ile iyi çalışan bir prob paneli arasında bir karşılaştırma sağlar.

A, spesifik olmayan bir arka plan sinyalini gösterirken, panel B, dış hücre katmanındaki OC beş probu için spesifik bir yerinde iki hibridizasyon sinyalini gösterir. Bunu izledikten sonra, en sevdiğiniz gençlerin kesin basınç zamansal ifade kalıplarını belirleyebilmeniz için init hibridizasyon protokollerindeki birçok zor adımı nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.