Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bir molekülün eksize edilmiş gövde nöral krist hücrelerinde kemotaksi ve diğer göç yanıtlarını uyarma yeteneğini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle yaklaşık sekiz ve 15 somit uzunluğundaki gövde seviyesi nöral tüplerin izole edilmesi ve nöral krist göçüne izin vermek için her bir nöral tüpün ayrı fibronektin kaplı lameller üzerinde gece boyunca kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, optimal bir nöral krist kültürü seçilir.

Sinir tüpü kültürden çıkarılır ve kültürü içeren lamel, kültürün en düz kenarı, kültür boyunca uygulanacak moleküler gradyan vektörüne paralel olacak şekilde modifiye edilmiş bir zigmund odasına yerleştirilir. Üçüncü adım, kültür boyunca bir moleküler gradyan oluşturmak ve ardından periferik nöral krest hücrelerinin, kültürün önceden seçilen düz kenarı boyunca göçünü kaydetmektir. Son adım ise, Image J yazılımı kullanılarak kültürün seçilen kenarı boyunca konumlandırılan periferik nöral krest hücrelerinin göçünü takip etmek ve analiz etmektir.

Nihayetinde, elde edilen hücre yörünge verilerinin analizi yoluyla, seçilen molekülün hücre yönelimini veya hız gibi diğer göç özelliklerini değiştirip değiştiremeyeceği belirlenebilir. Bu tekniğin Boyden odacığı deneyi gibi mevcut tekniklere karşı temel avantajı, çok düşük maliyetli olmasıdır. Bu yöntem, zaman ayarlı görüntüleme kullanılarak primer eksplant kültürlerinin çevresindeki halihazırda polarize olmuş hücrelerin göçünü analiz etmek için kullanılabilir.

Civciv yumurtaları 38 °C'de 56 saat boyunca inkübe edildikten sonra, yumurtaları inkübatörden çıkarın, üzerlerine hafifçe %70 etanol püskürtün ve ardından yumurtaların kurumasına izin verin. Bir steril plastik Petri kabını Civciv ringer çözeltisi ile doldurun ve bir cam tepsiyi UV ile sterilize edin. Beş santimetrelik bir cam Petri kabını dis ekranları ile doldurun.

Şimdi yumurtaları UV sterilizasyonlu cam tepsiye kırın. Kavisli makasla embriyonun kan adacıklarının etrafını keserek her bir embriyoyu sarısından çıkarın. Ardından künt pensle embriyoyu ekstra embriyonik membranından tutun ve embriyoyu ringers içeren hazırlanmış Petri kabına yerleştirin.

Ardından, Hamburger ve Hamilton evreleri 15 ile 17 arasında olan yaklaşık dokuz embriyo seçin. Tungsten bir iğne ile 10. somitin önündeki tüm embriyonik dokuları kesin ve en yeni oluşmuş beşinci somit civarından başlayarak tüm kordal embriyonik dokuları uzaklaştırın. Daha sonra, ekstra embriyonik membranları embriyodan yaklaşık iki milimetre kalacak şekilde budayın.

İzole edilen embriyo gövdelerini dis baylarına yerleştirin ve embriyo gövdeleri inkübe olurken bunları 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında bir saat 15 dakika boyunca inkübe edin. Kültür için altı adet lamelyi hazırlayın. Öncelikle bunları %70 etanol ile durulayın ve kurumaya bırakın.

Ardından, her bir lamelin aynı yüzeyinde, daha sonra fibrin bağlantı kılıfının tanımlanabilmesi için laboratuvar kalemi kullanarak merkezine yaklaşık bir santimetre çapında bir daire çizin. Lamelin üst ve alt kısımlarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için çizilen dairenin dışına asimetrik bir kelime veya sembol yazın. Şimdi, her bir lameli etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde 40 by 10 milimetrelik ayrı steril kaplara yerleştirin ve kapları açık halde germisidal bir UV lambasının altında 10 dakika bekletin.

Ardından, dairenin tüm alanının kaplandığından emin olarak, lamelin işaretlenmemiş yüzeyindeki bir santimetrelik dairenin içine 60 µL fibronectin uygulayın. Kapları 37 °C'deki inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. İnkübasyon süresinin ardından, her lameldeki fibronectin'i dikkatlice aspire edin.

Ardından, FI nin kaplanmış alanına 250 µL kültür ortamı ekleyin. Lamelleri kapatın ve nöral tüpler izole olana kadar lamelleri tekrar inkübe edin. Lameller inkübe olurken, beş santimetrelik bir cam petri kabını L 15 ortamı ile doldurun.

Şimdi inkübe edilen tüm embriyo gövdelerini hazırlanmış Petri kabına aktarın. İnce pensetler ile keskin bir bistüri ve iğne kullanarak, iğne ile nöral tüp ve somitlerin sınırı boyunca dikkatlice keserek nöral tüpü çıkarın. Örtü camlarını inkübatörden çıkarın.

En uzun ve en düz altı nöral tüpü seçin ve ardından kültür ortamıyla önceden doldurulmuş bir mikropipet ucu kullanarak, her bir laminele bir nöral tüp aktarın. Bir mikropipet yardımıyla her nöral tüpün ilgili lamelin fibronektin kaplı alanı içinde olduğundan emin olun ve gece boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksitte inkübe edin. Ardından, serumsuz en az 2 mL kültür ortamını steril bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.

Besiyerinin pH seviyesinin ayarlanmasına izin vermek için, tüpü 37 °C ve %5 karbon dioksit altında gece boyunca inkübe ederken kapağı hafifçe gevşek bırakın. Gece boyu süren kültürlemeden sonra, üç kültür arasından en az bir uzun düz kenara sahip olan en iyi üç nöral krista hücresi kültürünü seçin. İlk hazneye yüklemek için bunlardan birini seçin ve diğerlerini daha sonra kullanmak üzere inkübatöre geri koyun.

Ardından, pamuklu çubuk kullanarak, modifiye edilmiş bir sigmund odasının rezervuarları ve köprü çevresindeki bölgelere ince ve eşit bir tabaka vazelin uygulayın. Sonra, tungsten bir iğne ile, seçilen nöral krest hücresi kültürü içeren lamelden, çevreleyen nöral krest hücrelerini fibronectin kaplamaya yapışık halde bırakarak nöral tüpü nazikçe çıkarın. Nöral krest hücresi kültürünün en düz kenarının yönünü hatırlamak için petri kabını bir laboratuvar markeriyle işaretleyin.

Ardından, önceden inkübe edilmiş ortamdan birkaç damlayı modifiye edilmiş zigmund odacığının köprüsüne yerleştirin. Sonra lamine camı ince uçlu bir pensle alın. Eski kültür ortamının çoğunu temizlemek için lamine camın kenarını bir Kim wipe ile kurulayın ve ardından lamine camı, filme alınacak olan düz nöral krista hücresi sınırı köprü uzunluğuna ortalanacak ve köprü rezervuar sınırına yaklaşık olarak dik olacak şekilde modifiye edilmiş zigmund odacığına hemen yerleştirin.

Bir evirtilmiş mikroskop kullanarak, düz nöral krest hücresi sınırını köprünün rezervuara en yakın olan tarafına taşıyın. Bu işlem, şüpheli kemotaktik faktörü hapsedecek ve düz nöral krest hücresi sınırının köprü rezervuar sınırına dik olarak daha hassas bir şekilde hizalanmasını sağlayacaktır. Şimdi, lamın üzerindeki kapatma camını, Zigmund odasında bulunan vazelin üzerine dikkatlice ancak sıkıca bastırarak, odanın tamamen mühürlendiğinden emin olun.

Ardından, hava sızdırmazlığından tamamen emin olmak için lamelin kenarlarına ek vazelin sürün. Tavan oluşturma işlemi sırasında meydana gelebilecek herhangi bir kaymayı düzeltmek için nöral krist hücre sınırının açısını yeniden ayarlayın. Sonra, yaklaşık 300 µL ön inkübe edilmiş medyumu bir mililitrelik bir şırıngaya çekin.

25 gauge ve 1,5 inç boyutunda takılı bir iğne ile; herhangi bir kemotaktik madde içermeyecek olan rezervuara, tamamen dolana kadar ortamı enjekte edin. Rezervuarda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Ardından, bir sonraki rezervuarı doldurmadan önce her iki taraftaki rezervuarı yeterli miktarda vazelin ile tıkayın. Şimdi, ikinci bir şırıngayı istenen kemotaktik maddeyi içeren 300 µL önceden inkübe edilmiş besiyeri ile doldurun. Sonra besiyerini karşıdaki rezervuara aynı şekilde enjekte edin.

Rezervuar, vazelin ile tekrar dikkatlice mühürlenir. Görüntüleme öncesinde, doldürülmüş Sigmund haznesi 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edilir. Ardından, yaklaşık 37 °C'de inkübasyon sürerken, kontrol grubu için nöral krist hücre kültürünün en düz kenarı üç saat boyunca 90 saniyelik aralıklarla görüntülenir; diğer en iyi iki nöral krist hücre kültürünü içeren zigmund hazneleri de gösterildiği gibi doldurulur.

Rezervuarların doldurulması ve köprünün ön hazırlığı için uygun kontrol uygulamalarını kullanın. Periferik nöral krist hücrelerinin kültürün düz kenarı boyunca göçünü izlemek için Image J manual tracking eklentisini kullanın. Elde edilen göç yörüngelerinin çeşitli parametrelerini analiz etmek için chemotaxis and migration tool eklentisini kullanın.

Uzamış gövde nöral krist hücre kültürleri, nöral tüplerin gece boyunca kültüre edilmesiyle hazırlanmış ve sonuç olarak en az bir uzun düz kenara sahip olan nöral krist hücre kültürleri deneyler için seçilmiştir. Seçilen bir kültürün en uzun düz kenarı, köprü rezervuar kenarına dik ve böylece gelecekte uygulanacak gradyan vektörüne paralel olacak şekilde konumlandırılmıştır. Şüphelenilen kemoatraktan maddeyi içermeyen ve burada eksi işaretiyle gösterilen rezervuar önce doldurulmuş ve mühürlenmiştir.

Ardından, diğer rezervuar artı işaretiyle temsil edilen şüpheli kemo atraktan ile dolduruldu ve önceden seçilen sınır boyunca mühürlenmiş periferik nöral krist hücreleri, Image J'nin manuel takip eklentisi kullanılarak görüntülendi ve takip edildi. Uygulanan gradyana yanıt olarak ortaya çıkan çok sayıda göç özelliği, bu grafikte gösterildiği gibi elde edilen takip verilerine dayanarak değerlendirilebilir. Örneğin, bir hücrenin x ekseni boyunca olan yer değiştirmesinin, göç ettiği toplam mesafeye bölünmesiyle bir kemotaksi indeksi türetilebilir. Takip edilen tüm hücrelerin çekici yanıtı, burada gösterilen hücre yörüngesi grafiği ile kanıtlanmıştır.

Her bir kırmızı iz, şüpheli bir kemoatrakta ile yüklü rezervuara doğru göç eden bir hücrenin yörüngesidir. Bu şekilde, siyah izlere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kırmızı iz bulunmaktadır. Başka bir testte, modifiye edilmiş bir sigmund odasının moleküler gradyanı koruma yeteneği doğrulanmıştır.

Sol rezervuara bir Alexa Fluor 488 IGM konjugatı eklendi ve köprü boyunca floresan yoğunluğu çeşitli zamanlarda ölçüldü. Gradyan en az 26 saat boyunca korundu. Videoyu izledikten sonra, modifiye edilmiş bir Zigmund odacığı deneyi kullanarak, eksize edilmiş gövde nöral krist hücre kültürlerinde bir molekülün kemotaksi ve diğer migratuar davranışları uyandırma yeteneğinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.