Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bir molekülün ekilen gövde nöral krest hücrelerinde kemotaksis ve diğer göç tepkilerini ortaya çıkarma yeteneğini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak gövde seviyesindeki nöral tüplerin kabaca sekiz ila 15 somit uzunluğunda izole edilmesi ve nöral krest göçüne izin vermek için nöral tüplerin her birinin gece boyunca ayrı fibronektin kaplı örtü kaymaları üzerinde kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, optimal bir nöral krest kültürü seçilir.

Nöral tüp kültürden çıkarılır ve kültürü içeren örtü kayması, kültürün en düz kenarı, kültür boyunca uygulanacak moleküler gradyanın vektörüne paralel olacak şekilde modifiye edilmiş bir zigmund odasına monte edilir. Üçüncü adım, kültür boyunca moleküler bir gradyan oluşturmak ve daha sonra periferik nöral krest hücrelerinin kültürün önceden seçilmiş düz sınırı boyunca göçünü filme almaktır. Son adım, Image J yazılımını kullanarak kültürün seçilen sınırı boyunca konumlandırılmış periferik nöral krest hücrelerinin göçünü izlemek ve analiz etmektir.

Sonuç olarak, seçilen molekülün, elde edilen hücre yörüngesi verilerinin analizi yoluyla hücre yönlülüğünü veya hız gibi diğer göç özelliklerini değiştirip değiştiremeyeceği belirlenebilir. Bu tekniğin Boyden odası testi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, çok düşük bir maliyetle olmasıdır. Bu yöntem, hızlandırılmış görüntüleme kullanarak birincil explan kültürlerinin çevresinde zaten polarize olmuş hücrelerin göçünü analiz etmek için kullanılabilir.

Civciv yumurtalarını 38 santigrat derecede 56 saat kuluçkaya yatırdıktan sonra, yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın, üzerlerine hafifçe %70 etanol püskürtün ve yumurtalar kururken yumurtaların kurumasını bekleyin. Bir steril plastik Petri kabını Civciv zil solüsyonu ile doldurun ve bir cam tepsiyi UV ile sterilize edin. Beş santimetrelik bir cam Petri kabını ekranlarla doldurun.

Şimdi yumurtaları UV ile sterilize edilmiş cam tepsiye kırın. Önce embriyonun kan adalarının etrafını kavisli bir makasla keserek her embriyoyu sarısından çıkarın. Daha sonra künt forsepslerle, embriyoyu ekstra embriyonik zarından alın ve embriyoyu halkalar içeren hazırlanmış Petri kabına yerleştirin.

Ardından, hamburger ve Hamilton arasında olan yaklaşık dokuz embriyo seçin. 15 ila 17. aşamalar, bir tungsten iğnesi ile akar 10'un önündeki embriyonik dokuları keser ve en yeni oluşan beşinci akardan başlayarak tüm kordal embriyonik dokuları çıkarır. Daha sonra ekstra embriyonik zarları embriyodan yaklaşık iki milimetre uzakta kesin.

İzole edilmiş embriyo gövdelerini bölmelere yerleştirin ve embriyo gövdeleri kuluçkaya yatarken 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat 15 dakika inkübe edin. Kültür için altı kapak fişi hazırlayın. Önce %70 etanol içinde durulayıp kurumaya bırakarak.

Daha sonra, bir laboratuvar kalemi kullanarak, her bir kapak astarının aynı yüzündeki fibrin bağlantı katının daha sonra tanımlanması için her bir kapak fişinin ortasına yaklaşık bir santimetre çapında bir daire çizin. Kapak fişinin üst ve alt kısmının tanımlanmasını kolaylaştırmak için çizilen dairenin dışına asimetrik bir kelime veya sembol yazın. Şimdi her bir kapak fişini, etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde 40 x 10 milimetrelik ayrı bir steril tabağa yerleştirin ve tabağın mikrop öldürücü bir UV lambası altında 10 dakika açık kalmasına izin verin.

Daha sonra, bir santimetrelik daire içindeki kapak kaymasının işaretsiz yüzeyine 60 mikrolitre fibronektin uygulayın ve dairenin tüm alanının kaplandığından emin olun. Bulaşıkları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Kuluçka süresinden sonra, her bir örtü fişinden finini dikkatlice aspire edin.

Daha sonra, FI nin kaplı alana 250 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Kapak kayması ve ardından nöral tüpler izole edilene kadar kapak fişlerini tekrar inkübe edin. Kapak fişleri inkübe edilirken, beş santimetrelik bir cam petri kabını L 15 medium ile doldurun.

Şimdi tüm inkübe edilmiş embriyo gövdelerini hazırlanan Petri kabına aktarın. Nöral tüpün kenarı boyunca ve somitleri iğne ile dikkatlice keserek nöral tüpü incelemek için ince forseps ve keskin bir dil ve iğne kullanın. Kapak fişlerini inkübatörden çıkarın.

En uzun ve en düz nöral tüplerden altı tanesini seçin ve ardından kültür ortamı ile astarlanmış bir mikro pipet ucu kullanarak, altı örtü fişinin her birine bir nöral tüp aktarın. Her bir nöral tüpün, bir mikro pipet kullanarak ilgili kapak kaymasının fibronektin kaplı alanı içinde olduğundan emin olun ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, serumsuz en az iki mililitre kültür ortamını steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Tüpü gece boyunca 37 santigrat derecede ve ortamın pH'ının ayarlanmasına izin vermek için %5 karbondioksitte inkübe ederken buzağıyı hafifçe vidasız bırakın. Gece boyunca kültürden sonra, üç kültürün dışında en az bir uzun düz kenarı olan en iyi üç nöral krest hücre kültürünü seçin. İlk hazneyi yüklemek için birini seçin ve diğerlerini daha sonra kullanmak üzere inkübatöre geri koyun.

Daha sonra pamuklu çubuğumuzu kullanarak, rezervuarları çevreleyen alanlara ve modifiye edilmiş bir sigmund odasının köprüsüne ince, eşit bir vazelin tabakası uygulayın. Daha sonra bir tungsten iğnesi ile, nöral tüpü, seçilen nöral krest hücre kültürünü içeren kapak fişinden nazikçe çıkarın ve çevrelenmiş nöral krest hücrelerini fibronektin kaplamasına bağlı bırakın. Nöral krest hücre kültürünün en düz sınırının yönünü hatırlamak için çanağı bir laboratuvar kalemi ile işaretleyin.

Daha sonra, önceden inkübe edilmiş ortamdan birkaç damla modifiye edilmiş zigmund odasının köprüsüne yerleştirin. Ardından kapak fişini ince forseps ile alın. Eski kültür ortamının çoğunu çıkarmak için kapak mendilinin kenarını bir Kim mendiline bastırın ve kapak fişini hemen modifiye edilmiş zigmund haznesine yerleştirin, böylece filme alınacak düz nöral krest hücre sınırı köprünün uzunluğu boyunca ortalanır ve kabaca köprü rezervuar sınırına dik olur.

Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, düz nöral krest hücre sınırını köprünün rezervuara en yakın tarafına hareket ettirin. Bu, şüpheli kemoterapi inceliğini içerecek ve köprü rezervuar sınırına dik olan düz nöro tepe hücre sınırını daha ince bir şekilde hizalayacaktır. Şimdi dikkatlice ama güvenli bir şekilde kapağa bastırın, zigmund haznesinde bulunan vazelinin içine kaydırın ve hazneye tamamen sızdırmaz olduğundan emin olun.

Ardından, hava geçirmez şekilde ince olacağından emin olmak için kapak fişinin kenarı boyunca ek vazelin yerleştirin. Tavan işlemi sırasında herhangi bir hareketi düzeltmek için nöral kret hücre sınırının açısını tekrar ayarlayın. Daha sonra, yaklaşık 300 mikrolitre önceden inkübe edilmiş ortamı bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin.

25 gauge x 1,5 inç ekli iğne ile. Besiyeri, dolana kadar herhangi bir kemoterapi inceliği içermeyecek olan rezervuara enjekte edin. Rezervuarda herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.

Ardından, bir sonraki rezervuarı yüklemeden önce rezervuarı her iki taraftan yeterli miktarda vazelin ile tıkayın. Şimdi, istenen kemoterapi inceliğini içeren 300 mikrolitre önceden inkübe edilmiş ortam içeren ikinci bir şırınga yükleyin. Daha sonra ortamı aynı şekilde karşı rezervuara enjekte edin.

Yine, rezervuarı vazelin ile dikkatlice kapatın. Yüklü Sigmund odasını çekimden önce bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra. Daha sonra, kontroller için 92. aralıklarla üç saat boyunca nöral krest hücre kültürünün en düz sınırı olan kabaca 37 santigrat derece görüntüde inkübe edilirken, az önce gösterildiği gibi diğer iki en iyi nöral krest hücre kültürünün her birini içeren zigmund odalarını yükleyin.

Rezervuarları doldurmak ve köprüyü astarlamak için uygun kontrol işlemlerinin kullanılması. Kültürün düz sınırı boyunca periferik nöral krest hücrelerinin göçünü izlemek için image J manuel trackin eklentisini kullanın. Elde edilen göç yörüngelerinin çeşitli parametrelerini analiz etmek için kemotaksis ve göç aracı eklentisini kullanın.

Uzamış gövde nöral krest hücre kültürleri, nöral tüplerin gece boyunca kültürlenmesiyle hazırlandı ve elde edilen nöral krest hücre kültürleri, deney için en az bir uzun düz kenarlığa sahip seçildi. Seçilen bir kültürün en uzun düz sınırı daha sonra köprü rezervuar sınırına dik olarak konumlandırıldı ve bu nedenle gelecekte uygulanan gradyanın vektörüne paralel olarak konumlandırıldı. Burada eksi işareti ile temsil edilen şüpheli kemoterapi cezbedici maddeyi içermeyen rezervuar önce yüklendi ve mühürlendi.

Daha sonra diğer rezervuar, bir artı işareti ile temsil edilen şüpheli kemoterapi cezbedici ile yüklendi ve daha önce seçilen sınır boyunca mühürlü periferik nöral krest hücreleri daha sonra görüntülendi ve görüntü J için manuel izleme eklentisi kullanılarak izlendi. Örneğin, bir kemotaksis indeksi, x ekseni boyunca bir hücre yer değiştirmesinin taşındığı toplam mesafeye bölünmesiyle elde edilebilir. İzlenen tüm hücrelerin çekici tepkisi, burada gösterilen hücre yörüngesi grafiği ile gösterilir.

Her kırmızı iz, şüpheli bir kemoterapi cezbedici ile yüklü rezervuara doğru göç eden bir hücrenin yörüngesidir. Bu şekilde, siyaha kıyasla önemli ölçüde daha fazla miktarda kırmızı iz var. Başka bir testte, modifiye edilmiş bir sigmund odasının moleküler bir gradyanı koruma yeteneği doğrulandı.

Sol rezervuara bir Alexa Fluor 4 88 IGM konjugatı eklendi ve köprü boyunca floresan yoğunluğu çeşitli zamanlarda ölçüldü. Gradyan en az 26 saat kaldı Videoyu izledikten sonra, modifiye edilmiş bir zigmund odası testi kullanarak bir molekülün ekilen gövde nöral krest hücre kültürlerinde kemotaksis ve diğer göç davranışlarını ortaya çıkarma yeteneğinin nasıl analiz edileceğini iyi anlamalısınız.