Name: Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin hücresel biyoaktif lipid metabolitlerinin kararlı izotop seyreltme ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile hassas kantitatif analizini. Bu yöntem hücresel metabolik yolakları anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biyoaktif lipidlerin ölçümü için mevcut olan mevcut biyoanalitik yöntemlerin çoğu, kiral normal faz kromatografisi veya SID içermedikleri için o kadar kapsamlı değildir. Kiral normal faz LC, enantiyomerlerin ayrılması ve enzim veya ROS aracılı metabolizmayı ayırt edebilmek için kritik öneme sahiptir. SID kullanımı, ekstraksiyon veya analiz sırasında ortaya çıkan insan hatası veya komplikasyonların miktar tayini sırasında dikkate alınmasını sağlar. ECAPCI-MRM ile birlikte eklenen bu bileşenler, bunu biyoaktif lipitlerin analizi için mevcut olan en hassas, seçici yöntem haline getirir.

1. Standart ve Dahili Standart Karışımlar
<ol>
	<li>Lipid ekstraksiyonundan önce, bir standart karışım (SM) ve bir dahili standart karışım (ISM) hazırlanmalıdır. SM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her standarttan (toplam 25) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye ayırın. Standartları nitrojen altında kurutun ve 10 mL asetonitril (ACN) içinde sulandırın. Standart karışımın nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olacaktır. 1 mL'lik alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Bu standart karışımdan, toplam 7 kalibrasyon standardı (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL ve 100 pg/ μL) için 6 standart seyreltme yapılabilir. Bu standartlar, kantitatif analizde kullanılan kalibrasyon eğrisini geliştirmek için hazırlanan her bir numune partisi ile birlikte çalıştırılacaktır.</li>
	<li>ISM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her bir IS'den (toplam 14) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye alın ve nitrojen altında kurutun. ISM'yi 10 mL ACN'de yeniden oluşturun ve 1 mL alikotlara bölün. ISM'nin nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olmalıdır. 1000 numuneyi işlemek için yeterli ISM vardır.</li>
	<li>SM ve ISM'yi -80°C'de saklayın.</li>
</ol>
2. Medya ve Hücre Lizatı Koleksiyonu
<ol>
	<li>Her 10 cm'lik yapışık hücre plakası için (~ 1 X 107), 10 mL'lik bir cam santrifüj tüpünde 3 mL ortam toplayın. Daha sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kez yıkayın. Plakaya 1 mL PBS ekleyin ve hücreleri plakadan kazıyın ve ikinci bir 10 mL cam santrifüj tüpüne pipetleyin. Bu noktada, prosedür şu anda devam etmeyecekse hücreler ve medya saklanabilir. Numuneleri uzun süreli saklama için -80°C'de veya bir haftadan daha kısa bir süre için -20°C'de saklayın.</li>
</ol>
3. Ortamdan Lipitlerin Ekstraksiyonu
<ol>
	<li>Serbest biyoaktif lipitler hücre ortamında bulunur ve bunlar tek aşamalı bir l-l ekstraksiyon prosedürü ile kolayca ekstrakte edilir. Toplanan ortama (2.1), 10 μL ISM ekleyin. Şu anda, 8 adet ek 10 mL cam santrifüj tüpü, kalibrasyon standartları için #0-7 olarak etiketlenmelidir. Bu tüplerin her birine 3 mL PBS ekleyin ve daha sonra 1-7 tüplerine (1.1'den 1-7) 10 μL uygun SM ekleyin.</li>
	<li>ISM'nin her kalibrasyon standardında dengelenmesine izin verin ve 10 dakika numune alın ve ardından 5 mL dietil eter ekleyin. Numuneler ve kalibrasyon standartları daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düşük hızda çalkalayıcıya yerleştirilir.</li>
	<li>Çalkalandıktan sonra, tüm kalibrasyon standartları ve numuneler 1935 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak üst fazı (organik) yeni bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın ve nitrojen altında kurutun.</li>
</ol>
4. Hücre Lizatından Lipitlerin Ekstraksiyonu
<ol>
	<li>Hücre örneklerini cam santrifüj tüplerinde 1935 X g'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı atın; her tüpe 2 mL PBS ekleyin ve kısaca girdaplayın. Protein miktar tayini için 25 μL numune alın. Hücre lizat normalizasyonu için toplam protein kullanılacaktır.</li>
	<li>Daha sonra, lizat / PBS karışımının yarısını ayrı bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın. Her örneğe 10 μL ISM ile birlikte 2 mL daha PBS ekleyin. 3.2 ve 3.3'teki ortamlar için açıklanan l-l ekstraksiyon işlemini izleyin. Bu alikot, hücrelerdeki serbest lipitleri ölçmek ve prostaglandinler gibi lipitlerin alkali bozunmasını önlemek için kullanılacaktır. Bu alikot, aşağıda açıklanan 4.3 ve 4.4 adımlarından geçmeyecektir.</li>
	<li>Esterleştirilmiş lipid ll ekstraksiyon işleminin ilk adımı, numunelerin her birine 5 mL CHCl3/MeOH (2:1) eklenmesini gerektirir. Numuneler, 30 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalayıcıya ayarlanır. Çalkalandıktan sonra, numuneler 10 dakika boyunca 1935 x g'da santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, ll'lik ekstraksiyonun alt (organik) katmanını yeni bir 10 mL'lik cam santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi nitrojen altında kurutun.</li>
	<li><li></ol><ol><li></li><li></ol><ol><li><li></li><li><li><li><li></ol><img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Şekil 1"> <tablo kenarl><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody><tablo kenarl><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody><tablo kenarl><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></tablo></tablo></tablo>

<ol><li>Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid metabolism.</a> Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).</li>
<li>Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereochemical+nature+of+the+products+of+linoleic+acid+oxidation+catalyzed+by+lipoxygenases+from+potato+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).</li>
<li>Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-derived+eicosanoids%3A+the+neglected+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Metastasis.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer.</a> Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+eicosanoids%3A+role+of+prostaglandin+F%282alpha%29+and+F-isoprostanes+in+inflammation+and+oxidative+stress+related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology.</a> Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).</li>
<li>Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+and+arachidonic+acid+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).</li>
<li>Hersberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+lipoxygenase+derived+lipid+mediators+in+atherosclerosis%3A+leukotrienes%2C+lipoxins+and+resolvins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins.</a> Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).</li>
<li>Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+implications+for+nutrigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutrigenet.+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics.</a> J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).</li>
<li>Capdevila, J. H., Falck, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+properties+of+the+cytochrome+P450+arachidonic+acid+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+IA+%22Encyclopedia+of+Mass+Spectrometry%22">Encyclopedia of Mass Spectrometry</a>. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Bu protokolde kullanılan standartlar ve dahili standartlar, hedeflenen bir lipidomik yöntemin temsilini sağlar. LC-MS analizi için bir Waters 2695 ayırma modülü ve Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra kullanıldı ve optimum parametre ayarları Tablo 1 ve 2'de bulunabilir. Ek olarak, bu ekstraksiyon protokolü yapışık hücreler için tasarlanmıştır, ancak diğer hücre tiplerinin yanı sıra idrar, kan ve doku dahil olmak üzere diğer biyolojik matrisler için değiştirilebilir. Birçok lipid standardı tic...

<table><tbody><tr><td>5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-6,8,9,11,12,14,15-d7 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td> <td>[2H 7] -5-ox & # 8211;TE Dahili Standart</td></tr><tr><td>5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td> <td>[2 H 8] -5 ( S)-HETE İç Standart</td></tr><tr><td>12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-5, 6,8,9,11,12,14,15-d8 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE Dahili</td></tr><tr><td>Standart 15S-hidroksi-5Z,8Z,11Z,13E-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE İç Standart</td></tr><tr><td>20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-16,16,17,18,18-d6 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td> <td>[2H 6 ] -20-HETE Dahili Standart</td></tr><tr><td>9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td> <td>[2H 4] -9 ( S)-HODE Dahili Standart</td></tr><tr><td>13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td> <td>[2H 4] -13 (S) -HODE Dahili Standart</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-trihidroksi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; </alt> Dahili Standart</td></tr><tr><td>9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>316350</td> <td>[2H4] -8-iso-PGF2a Dahili Standart</td></tr><tr><td>9&alpha;, 11 & # 946;., 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>10008989</td><td>[2H4] -11&#946;-PGF2 Dahili Standart</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,19,19,20,20,20-d4 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td> <td>[2H 4] -PGD2 Dahili Standart</td></tr><tr><td>9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td> <td>[2H4]-PGE< alt>2</alt> İç</td></tr><tr><td>Standart 5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-6,7,14,15-d4 asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>320110</td> <td>[2H 4]-LTB4 Dahili Standart</td></tr><tr><td>9 & alfa; , 11,15S-trihidroksi-tromba-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Dahili Standart</td></tr><tr><td>5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-oxo&#8211;TE Standardı</td></tr><tr><td>12-okso-5Z,8Z,10E,14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34580</td><td>12-öküz&#8211;TE Standardı</td></tr><tr><td>15-okso-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34730</td><td>15-ox & # 8211; TE Standardı</td></tr><tr><td>5R-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34225</td><td>5 ( R ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34230</td><td>5 ( S ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>8R-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34350</td><td>8 ( R ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>8S-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34360</td><td>8 ( S ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>11R-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34505</td><td>11 ( R) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>11S-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34510</td><td>11 ( S) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>12R-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34560</td><td>12 ( ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34570</td><td>12 ( S ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>15R-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34710</td><td>15 ( R ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>15S-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>34720</td><td>15 ( S ) -HETE Standardı</td></tr><tr><td>20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>90030</td><td>20-HETE Standardı</td></tr><tr><td>9R-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asit</td><td>Cayman Kimya</td><td>38405</td><td>9 ( R ) -HODE Standardı</td></tr><tr><td>9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>38410</td><td>9 ( S ) -HODE Standardı</td></tr><tr><td>13R-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>38605</td><td>13 ( R) -HODE Standardı</td></tr><tr><td>13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>38610</td><td>13 ( S) -HODE Standardı</td></tr><tr><td>9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF 2 & alfa; < / alt> Standart</td></tr><tr><td>9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>16350</td><td>8- iso-PGF2 ve alfa; Standart</td></tr><tr><td>9 & alfa ;, 11 & # 946;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11 & # 946 ; -PGF 2 Standart</td></tr><tr><td>9 & alfa ;, 15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD 2 Standart</td></tr><tr><td>9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2< / alt> Standart</td></tr><tr><td>9-okso-11 ve alfa;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>14010</td><td>PGE2 Standart</td></tr><tr><td>5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>20110</td><td>LTB4 Standart</td></tr><tr><td>9&alfa;,11,15S-trihidroksitromba-5Z,13E-dien-1-oik asit</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Standart</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dietil Eter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>susuz</td></tr><tr><td>N, N-diizopropiletil amin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Pentaflorilbenzil bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Cam Santrifüj Tüpleri</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Vidalı kapak</td></tr><tr><td>Fenolik Vidalı Kapaklar</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Chiralcel ADH Kolon Kiral</td><td>Teknolojileri</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişeleri</td><td>Sular</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>HPLC uçlar</td><td>Sular</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

hücresel lipid ekstraksiyon hedefli kararlı İzotop seyreltme sıvı kromatografi-kütle spektrometresi analizi

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Araşidonik asit (AA) ve linoleik asit (LA) gibi yağ asitlerinin metabolizması, çok sayıda stereoizomer1,2 dahil olmak üzere oksitlenmiş biyoaktif lipidlerin oluşumuyla sonuçlanır. Bu metabolitler serbest veya esterlenmiş yağ asitlerinden oluşturulabilir. Bu oksitlenmiş metabolitlerin çoğu biyolojik aktiviteye sahiptir ve kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar, astım ve kanser3-7 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynamaktadır. Oksitlenmiş biyoaktif lipitler enzimatik olarak veya reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oluşturulabilir. Yağ asitlerini metabolize eden enzimler arasında siklooksijenaz (COX), lipoksijenaz (LO) ve sitokromlar P450 (CYP'ler)1,8 bulunur. Enzimatik metabolizma enantiyoselektif oluşuma neden olurken, ROS oksidasyonu ürünlerin rasemik oluşumuna neden olur.
Bu protokol temel olarak AA- ve bazı LA türevli biyoaktif metabolitlerin analizine odaklanırken; diğer yağ asitlerinin metabolitlerine de kolayca uygulanabilir. Biyoaktif lipitler, sıvı-sıvı (l-l) ekstraksiyonu kullanılarak hücre lizatından veya ortamdan ekstrakte edilir. L-l ekstraksiyon işleminin başlangıcında, numune hazırlama sırasındaki hataları hesaba katmak için kararlı izotop iç standartları eklenir. Kararlı izotop seyreltmesi (SID), kütle spektrometresi (MS) analizi 9 sırasında metabolitlerin yaşayabileceği iyon baskılanması gibi farklılıkları da hesaba katar9. Ekstraksiyondan sonra, bir elektron yakalama (EC) reaktifi ile türevlendirmeden sonra, algılama hassasiyetini artırmak için pentaflorilbenzil bromür (PFB) kullanılır10,11. MS analizinin seçiciliğini artırmak için çoklu reaksiyon izleme (MRM) kullanılır. MS analizinden önce, lipitler kiral normal faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır. HPLC koşulları, izlenen lipitlerin12 enantiyomerlerini ve çeşitli stereoizomerlerini ayırmak için optimize edilmiştir. Bu spesifik LC-MS yöntemi, prostaglandinleri (PG'ler), izoprostanları (isoP'ler), hidroksieikosatetraenoik asitleri (HETE'ler), hidroksioktadekadienoik asitleri (HODE'ler), oksoeikosatetraenoik asitleri (oksoETE'ler) ve oksooktadekadienoik asitleri (oksoODE'ler) izler; bununla birlikte, HPLC ve MS parametreleri herhangi bir yağ asidi metabolitini içerecek şekilde optimize edilebilir13.
Şu anda mevcut olan biyoanalitik yöntemlerin çoğu, enantiyomerlerin ayrı ayrı miktar tayinini hesaba katmamaktadır. Bu, metabolitlerin enzimatik olarak mı yoksa ROS tarafından mı oluşturulduğunu anlamaya çalışırken son derece önemlidir. Ek olarak, enantiyomerlerin oranları, belirli bir enzimatik oluşum yolu için kanıt sağlayabilir. SID kullanımı, metabolitlerin doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir ve hazırlama sırasındaki herhangi bir numune kaybının yanı sıra iyonizasyon sırasında yaşanan farkları da hesaba katar. PFB elektron yakalama reaktifinin kullanılması, algılama hassasiyetini geleneksel APCI yöntemlerine göre iki kat artırır. Genel olarak, bu yöntem, SID-LC-EC-atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon APCI-MRM/MS, biyoaktif lipitler için en hassas, seçici ve doğru miktar tayini yöntemlerinden biridir.

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Yöntem, kararlı izotop seyreltmesi, cnor fazı, sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik basınç, kimyasal iyonizasyon ve kütle spektrometresinin kombinasyonu ile hücresel biyoaktif lipid metabolitlerini doğru bir şekilde ölçmeyi amaçlar. Hem ortam hem de hücre örneklerini hasat ederek başlayın ve dahili standart karışım etiketli ağır bir izotop ekleyin. Biyoaktif lipitleri organik çözücü ile ekstrakte edin, daha sonra biyoaktif lipitleri bir elektron yakalama reaktifi ile türetin, biyoaktif lipitleri sıvı kromatografisi ile hassas bir şekilde ölçmeye devam edin.Hem hücre lizatının hem de ortam sonuçlarının LCMS analizi yoluyla kütle spektrometresi, hedeflenen biyoaktif lipidlerin konsantrasyonunu ve bireysel Anant ER'lerin seviyelerini kesin olarak belirler. Bu tekniğin ters fazlı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve diğer LCMS yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bireysel ve anterlerin araba normal faz kromatografisi ve stabilize izotop seyreltmesi kullanılarak doğru bir şekilde ölçülmesidir. Elde edilen veriler, hücrede işleyen enzimatik yollar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.Bir yapıştırıcının her 10 santimetrelik plakası için, hücreler 10 mililitrelik bir cam santrifüj tüpünde üç mililitre ortam toplar. Daha sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra bir mililitre PBS ekleyin, hücreleri plakadan kazıyın ve numuneyi ikinci bir ila 10 mililitre cam santrifüj tüpüne aktarın.Kalibrasyon eğrisi için üç mililitre PBS içeren sekiz ek tüp hazırlayın. Daha sonra her tüpe uygun kalibrasyon standardından 10 mikrolitre ekleyin. Serbest biyoaktif lipitlerin ekstraksiyonu için toplanan üç mililitrelik hücre kültürü ortamının her bir test örneğini hizalayın.Her kalibrasyon standardına 10 mikrolitre dahili standart karışım ekleyin ve numuneleri beş mililitre dathyl eterde işlemek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca numune dengeleyin ve 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Numuneleri santrifüjleyin ve üst organik fazı 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri nitrojen altında kurutmaya devam edin İlk olarak, hasat edilen hücre numunelerini santrifüjleme ile toplayın ve hücre lizat normalizasyonu için her numuneden 25 mikrolitre Vortex Reserve ile her paleti iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Şimdi her bir lizatı 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerine eşit olarak bölün. Serbest hücresel lipidleri ölçmek ve prostaglandinler gibi lipitlerin alkali bozunmasını önlemek için her numuneye ek iki mililitre PBS ve 10 mikrolitre ISM ekleyin, daha önce gösterildiği gibi datil eter ekstraksiyonlarını gerçekleştirmek için her numune kopyasından birini kullanın. Esterlenmiş lipitleri çıkarmak için, kalan numunelerin her birine beş mililitre kloroform metanol karışımı ekleyin.30 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin, ardından 10 dakika santrifüjleyin. Şimdi, alt organik tabakayı toplayın ve esterlenmiş lipitleri sterilize etmek için numuneleri nitrojen altında kurutun. Her tüpe %80 metanol içinde 0,5 mililitre 0,4 normal potasyum hidroksit ekleyin.Numuneleri bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Sonra iki mililitre PBS ekleyin ve pH'ı iki altı konsantre hidroklorik asit ile ayarlayın. Son olarak, her numuneye 10 mikrolitre ISM ekleyin ve kurumuş numunelere ve kalibrasyon standartlarına datil eter ekstraksiyonlarına devam edin.Türevlendirme reaktiflerini belirtilen sırayla ekleyin. Daha sonra numuneleri girdaplayın ve bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, depolama ve analizden önce numuneleri nitrojen altında kurutun.Bu yöntem, kararlı izotop seyreltme, chii, sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik basınç, kimyasal iyonizasyon ve kütle spektrometresi analizinin bir kombinasyonunu kullanır. Numuneleri ve kalibrasyon standartlarını 100 mikrolitre hekzan etanolde yeniden oluşturun ve tüm numuneleri HPLC şişelerine aktarın, numuneleri soğutulmuş otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Analiz için örnek bir liste oluşturun.Ardından, normal faz ayrımı için beraberindeki yazılı protokolde tablo bir ve tablo iki'de açıklanan parametreleri kullanarak HPLC ve MS yöntemlerini ayarlayın. Bir kiral paket, 30 santigrat dereceye kadar bir DH sütunu, numuneyi enjekte edin ve çalışmaya başlayın. Şimdi A PCI kaynağını kullanarak MS'yi negatif iyon moduna ayarlayın.Sütunu dengelemek için onaltılık bir boşlukla başlayın. Ardından, artan SM konsantrasyonu sırasına göre kalibrasyon standart örneklerini çalıştırın. HBLC ayrılmasından sonra kültür ortamının test numunelerini işlemeye devam edin.Korona iğnesi üzerinde birikmeyi önlemek için metanol post sütunu ekleyin. Standartlardan üretilen verileri kullanarak. Y ekseninde örnek alanı çizen bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve x eksenindeki standart konsantrasyon, Y'ye eşittir MX artı B denklemini türetin.Son olarak, hücre için biyoaktif lipitlerin test numunesi konsantrasyonlarını belirleyin. Lizatlar. Belirlenen biyoaktif lipid konsantrasyonunu plaka başına hücre sayısına veya önceki adımlarda normalize edilen toplam proteine bölerek bu değerleri normalleştirin. Çoklu reaksiyon izlemeden elde edilen veriler, birkaç linoleik ve araşidonik asidi gösterir.Oksitlenmiş metabolitler. 13 ve dokuz, karşılık gelen 13 ve dokuz Oxo ode ile birlikte linoleik asitten türetilir. Ek olarak, bir araşidonik asit ısı metabolitleri ve bunların oksitlenmiş ürünleri de beklendiği gibi mevcuttur.Değeri düşürülmüş dahili standardın saklama süresinde, etiketlenmemiş standarda kıyasla küçük bir değişiklik vardır. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda ısıyı ve anterleri ayırır ve bir araşidonik asidin enzimatik oksidasyonundan veya reaktif oksijen türleriyle reaksiyondan kaynaklanabilecek stereo izomerler için benzersiz geçişleri belirler. Örneğin, bu kromatogram, beşin r ve s stereo izomerleri arasındaki ayrımı gösterir.Isı lipidomik analizi, çok sayıda lipid türünün analizi için güçlü bir tekniktir. Örneğin, bu deney prostaglandinleri, isop senes'i ve lökotrien B'yi dört değerlendirir ve ölçer. Oxo'nun yediği ısılara ve omega hidroksillenmiş metabolitlere ek olarak, bu yöntem plazma, idrar ve doku gibi diğer biyolojik matrislerden biyoaktif lipitlerin ekstraksiyonu için optimize edilebilir.Bazı durumlarda, biyoaktif lipitler oksidatif stresin yanıt biyobelirteçleri olarak kullanılmıştır.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Bu makalede doku lipidomik ve transkriptomik için modüler bir protokol ve inflamasyon ve nöronal aktivitenin altında kalan lipitleri, membran lipitlerini, aşağı akış habercilerini ve lipid fonksiyonu altında bulunan mRNA kodlayıcı enzimleri/reseptörleri hedefleyen nörolojik hastalık fare modellerinde plazma lipidomikleri sunulmaktadır. Örnekleme, numune işleme, ekstraksiyon ve nicelik prosedürleri özetlenmiştir.

Nörolojik Hastalıklarda Lipidomik ve Transkriptomik

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Canlı Hücrelerde Lipid Değişim Testi

Öğrenin hücresel biyoaktif lipid metabolitlerinin kararlı izotop seyreltme ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile hassas kantitatif analizini. Bu yöntem hücresel metabolik yolakları anlamak için güçlü bir araç sunar.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

Daha fazla video keşfet