Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

Yöntem, kararlı izotop seyreltmesi, cnor fazı, sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik basınç, kimyasal iyonizasyon ve kütle spektrometresinin kombinasyonu ile hücresel biyoaktif lipid metabolitlerini doğru bir şekilde ölçmeyi amaçlar. Hem ortam hem de hücre örneklerini hasat ederek başlayın ve dahili standart karışım etiketli ağır bir izotop ekleyin. Biyoaktif lipitleri organik çözücü ile ekstrakte edin, daha sonra biyoaktif lipitleri bir elektron yakalama reaktifi ile türetin, biyoaktif lipitleri sıvı kromatografisi ile hassas bir şekilde ölçmeye devam edin.

Hem hücre lizatının hem de ortam sonuçlarının LCMS analizi yoluyla kütle spektrometresi, hedeflenen biyoaktif lipidlerin konsantrasyonunu ve bireysel Anant ER'lerin seviyelerini kesin olarak belirler. Bu tekniğin ters fazlı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve diğer LCMS yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bireysel ve anterlerin araba normal faz kromatografisi ve stabilize izotop seyreltmesi kullanılarak doğru bir şekilde ölçülmesidir. Elde edilen veriler, hücrede işleyen enzimatik yollar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Bir yapıştırıcının her 10 santimetrelik plakası için, hücreler 10 mililitrelik bir cam santrifüj tüpünde üç mililitre ortam toplar. Daha sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra bir mililitre PBS ekleyin, hücreleri plakadan kazıyın ve numuneyi ikinci bir ila 10 mililitre cam santrifüj tüpüne aktarın.

Kalibrasyon eğrisi için üç mililitre PBS içeren sekiz ek tüp hazırlayın. Daha sonra her tüpe uygun kalibrasyon standardından 10 mikrolitre ekleyin. Serbest biyoaktif lipitlerin ekstraksiyonu için toplanan üç mililitrelik hücre kültürü ortamının her bir test örneğini hizalayın.

Her kalibrasyon standardına 10 mikrolitre dahili standart karışım ekleyin ve numuneleri beş mililitre dathyl eterde işlemek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca numune dengeleyin ve 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Numuneleri santrifüjleyin ve üst organik fazı 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri nitrojen altında kurutmaya devam edin İlk olarak, hasat edilen hücre numunelerini santrifüjleme ile toplayın ve hücre lizat normalizasyonu için her numuneden 25 mikrolitre Vortex Reserve ile her paleti iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Şimdi her bir lizatı 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerine eşit olarak bölün. Serbest hücresel lipidleri ölçmek ve prostaglandinler gibi lipitlerin alkali bozunmasını önlemek için her numuneye ek iki mililitre PBS ve 10 mikrolitre ISM ekleyin, daha önce gösterildiği gibi datil eter ekstraksiyonlarını gerçekleştirmek için her numune kopyasından birini kullanın. Esterlenmiş lipitleri çıkarmak için, kalan numunelerin her birine beş mililitre kloroform metanol karışımı ekleyin.

30 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin, ardından 10 dakika santrifüjleyin. Şimdi, alt organik tabakayı toplayın ve esterlenmiş lipitleri sterilize etmek için numuneleri nitrojen altında kurutun. Her tüpe %80 metanol içinde 0,5 mililitre 0,4 normal potasyum hidroksit ekleyin.

Numuneleri bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Sonra iki mililitre PBS ekleyin ve pH'ı iki altı konsantre hidroklorik asit ile ayarlayın. Son olarak, her numuneye 10 mikrolitre ISM ekleyin ve kurumuş numunelere ve kalibrasyon standartlarına datil eter ekstraksiyonlarına devam edin.

Türevlendirme reaktiflerini belirtilen sırayla ekleyin. Daha sonra numuneleri girdaplayın ve bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, depolama ve analizden önce numuneleri nitrojen altında kurutun.

Bu yöntem, kararlı izotop seyreltme, chii, sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik basınç, kimyasal iyonizasyon ve kütle spektrometresi analizinin bir kombinasyonunu kullanır. Numuneleri ve kalibrasyon standartlarını 100 mikrolitre hekzan etanolde yeniden oluşturun ve tüm numuneleri HPLC şişelerine aktarın, numuneleri soğutulmuş otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Analiz için örnek bir liste oluşturun.

Ardından, normal faz ayrımı için beraberindeki yazılı protokolde tablo bir ve tablo iki'de açıklanan parametreleri kullanarak HPLC ve MS yöntemlerini ayarlayın. Bir kiral paket, 30 santigrat dereceye kadar bir DH sütunu, numuneyi enjekte edin ve çalışmaya başlayın. Şimdi A PCI kaynağını kullanarak MS'yi negatif iyon moduna ayarlayın.

Sütunu dengelemek için onaltılık bir boşlukla başlayın. Ardından, artan SM konsantrasyonu sırasına göre kalibrasyon standart örneklerini çalıştırın. HBLC ayrılmasından sonra kültür ortamının test numunelerini işlemeye devam edin.

Korona iğnesi üzerinde birikmeyi önlemek için metanol post sütunu ekleyin. Standartlardan üretilen verileri kullanarak. Y ekseninde örnek alanı çizen bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve x eksenindeki standart konsantrasyon, Y'ye eşittir MX artı B denklemini türetin.

Son olarak, hücre için biyoaktif lipitlerin test numunesi konsantrasyonlarını belirleyin. Lizatlar. Belirlenen biyoaktif lipid konsantrasyonunu plaka başına hücre sayısına veya önceki adımlarda normalize edilen toplam proteine bölerek bu değerleri normalleştirin. Çoklu reaksiyon izlemeden elde edilen veriler, birkaç linoleik ve araşidonik asidi gösterir.

Oksitlenmiş metabolitler. 13 ve dokuz, karşılık gelen 13 ve dokuz Oxo ode ile birlikte linoleik asitten türetilir. Ek olarak, bir araşidonik asit ısı metabolitleri ve bunların oksitlenmiş ürünleri de beklendiği gibi mevcuttur.

Değeri düşürülmüş dahili standardın saklama süresinde, etiketlenmemiş standarda kıyasla küçük bir değişiklik vardır. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda ısıyı ve anterleri ayırır ve bir araşidonik asidin enzimatik oksidasyonundan veya reaktif oksijen türleriyle reaksiyondan kaynaklanabilecek stereo izomerler için benzersiz geçişleri belirler. Örneğin, bu kromatogram, beşin r ve s stereo izomerleri arasındaki ayrımı gösterir.

Isı lipidomik analizi, çok sayıda lipid türünün analizi için güçlü bir tekniktir. Örneğin, bu deney prostaglandinleri, isop senes'i ve lökotrien B'yi dört değerlendirir ve ölçer. Oxo'nun yediği ısılara ve omega hidroksillenmiş metabolitlere ek olarak, bu yöntem plazma, idrar ve doku gibi diğer biyolojik matrislerden biyoaktif lipitlerin ekstraksiyonu için optimize edilebilir.

Bazı durumlarda, biyoaktif lipitler oksidatif stresin yanıt biyobelirteçleri olarak kullanılmıştır.