Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik örneklerdeki her bir Sfingomyelin türünün miktarını ve yapısını hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu yöntem, lipid biyolojisi ve lipid ile ilgili lipid alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyolojik numunelerde çeşitli Sfingomyelin türlerini kromatografi kütle spektrometresi sistemi ile karakterize edebilmemizdir. Başlamak için, kültür ortamını HeLa hücreleri içeren 10 santimetrelik bir doku kültürü kabından çıkarın ve hücreleri altı mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez durulayın.

Daha sonra 10 santimetrelik doku kültürü kabına bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri toplamak için bir hücre sıyırıcı kullanın. Tabağın yüzeyinden çıkarıldıktan sonra, hücreleri iki mililitrelik silikonlu plastik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve her hücre peletine bir mililitre metanol ekleyin.

Sonra tüpleri kısaca girdaplayın. Daha sonra, numuneleri banyo tipi bir sonikatör içine yerleştirin ve beş dakika boyunca 200 watt'ta sonikasyon yapın. Bittiğinde, tüm hücre homojenatını Teflon kaplı vidalı kapaklarla donatılmış test tüplerine aktarın.

Şimdi her bir test tüpüne bir mililitre metanol, bir mililitre kloroform, 0.8 mililitre çift damıtılmış su 50 mikrolitre 10 mikromolar bir iç standart ekleyin. Tüpleri kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2.500 rpm'de kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra her tüpe bir mililitre kloroform ve bir mililitre çift damıtılmış su ekleyin.

Yine, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2.500 rpm'de kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra, sulu ve organik fazları tamamen ayırmak için numuneleri santrifüjleyin. Alt fazı tek kullanımlık cam tüplere aktarın.

Test tüplerine iki mililitre kloroform ekleyin. Daha sonra tüpleri, üst faz ve interfazyal tüy ile yeterince karıştırmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2.500 rpm'de kuvvetlice girdaplayın. İkinci bir santrifüjlemenin ardından, modifiye edilmiş alt fazı, ilk alt faz ile birlikte tek kullanımlık cam tüplere aktarın.

Şimdi cam tüpleri yaklaşık 60 dakika boyunca bir nitrojen akışı altına yerleştirin ve toplanan alt fazdaki organik çözücüleri tamamen çıkarın. Son olarak, numuneleri 500 mikrolitre metanol veya etanol ile sulandırın. Elde edilen karışımı 0.02 mikronluk bir filtre ile cam şişelere süzün.

Ardından numuneyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Standart bileşiğin seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve her konsantrasyondan 50 mikrolitreyi ayrı test tüplerine ekleyin. Daha sonra, ilk numuneye standart eğrinin alt sınırının üç katı içinde bir miktar, ikinci numune için eğrinin merkezine yakın bir miktar ve üçüncü numune için standart eğrinin üst sınırına yakın bir miktar ekleyerek üç kalite kontrol numunesi hazırlayın.

Daha sonra, hücre homojenatını her bir test tüpüne bir mililitre metanol içinde ekleyin ve az önce gösterilen yöntemi kullanarak her numuneden toplam lipit fraksiyonunu çıkarın. Başlamak için mobil aşamayı hazırlayın. Sulu faz için asetonitril, metanol ve çift damıtılmış suyu iki ila iki ila bir oranında karıştırın.

Teflon kaplı vidalı kapaklı cam şişelerde organik faz için izopropanol kullanın. Ardından, her iki mobil fazı da banyo tipi bir sonikatör içinde beş dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, her bir mobil faza 26.4 milimolar nihai konsantrasyona formik asit ve 14.9 milimolar'da amonyum hidroksit ekleyin.

Kalitatif analiz için yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemini etkinleştirin. Giriş tüplerini mobil fazları içeren cam şişelere koyun ve HPLC hatlarını temizleyin. Ardından bir C18 HPLC kolonunu HPLC sistemine bağlayın.

Kolon fırınındaki sıcaklığı 50 santigrat derecede tutun ve kolonu sulu mobil faz ile dakikada 100 mikrolitre olarak şartlandırın. Çalışma sırasında, numuneleri otomatik numune alma cihazının numune rafına yerleştirin. Üç aşamalı kütle spektrometrisi analizi için üçlü dörtlü ve dörtlü doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometrisi sisteminin parametrelerini, beraberindeki metin protokolünün tablo bir ve tablo ikisinde listelendiği gibi ayarlayın.

Ayrıca, ilgilenilen SM türlerinin birinci ve ikinci öncü iyonları için parametreleri, ekteki metin protokolünde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. Sıvı kromatografisi, elektrosprey iyonizasyonu, tandem kütle spektrometrik analizi ile her bir Sfingomyelin türünün MS üç ürün iyon spektrumunun verilerini elde etmek için bir toplu iş dosyası oluşturun ve toplu iş dosyasını gönderin. Sıvı kromatografisi, elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi analizi ile ilgilenilen Sfingomyelin türünün üç fazlı MS ürün iyon spektrumlarını elde edin.

Daha sonra, Sfingoid uzun zincirli bazın tam kütlesi ve ilgilenilen n-asil kısmındaki ürün iyon spektrumlarının kütle / yük oranını karşılaştırarak her bir MS'ye Sfingomyelinin üç ürün iyon spektrumunu atayın. Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi sıvı kromatografisi, elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi analizi kullanarak Sfingomyelini kantitatif olarak analiz edin. Ardından, her bir Sfingomyelin türünün ekstrakte edilen iyon kromatogramı için tepe alanının verilerini elde etmek için veri entegrasyonu için yazılımı kullanarak çoklu reaksiyon izleme verilerini işleyin.

Her bir Sfingomyelin türünü ölçün ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi standart eğrileri oluşturun. HeLa hücrelerinden ekstrakte edilen lipid örneklerinde hem kimyasal olarak sentezlenen Sfingomyelin hem de Sfingomyelin spektrumu burada gösterilmektedir. Dikkat çekici bir şekilde, demetillenmiş sfingosilfosforilkolinin spektrum yoğunluğu, her iki numunede de SM n-asil kısmınınkinden daha büyüktür.

Ayrıca ilgi çekici olan, sfingosin-1-fosfata karşılık gelen spektrum, Sfingomiyelinin sfingoid uzun zincirli tabanının karbon sayısını ve çift bağlarını tahmin etmek için yararlıdır. Mevcut kantitatif yöntemde, bu yöntemin doğrulanmasında kalibrasyon eğrisinin oluşturulması için numunelerin hassas bir şekilde hazırlanması kritik öneme sahiptir. Düşük konsantrasyona uyan eğri, bir veya x üzerinde bir ağırlıklandırma faktörü kullanılarak karşılaştırıldığında, x kareye bir eşittir ağırlıklandırma faktörü kullanılarak açıkça iyileştirildi.

Bu teknik, biyoloji ve endüstri alanındaki araştırmacıların biyolojik örneklerde ve kozmetik gibi endüstri ürünlerinde çeşitli Sfingomyelin türlerini karakterize etmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik örneklerdeki her bir Sfingomyelin türünün miktarını ve yapısını tam olarak nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Emicilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun cam aşınmaları kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Ek olarak, ellerinizden türetilen lipitlerin kirlenmesini önlemek için eldiven giymek önemlidir.