Name: Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, LC-MS/MS ve üç aşamalı kütle spektrometrisi kullanarak biyolojik örneklerde sfingomiyelin türlerinin nicel ve nitel analizini. Bu yöntem lipid biyolojisi araştırmalarında hassas lipid karakterizasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya (KAKENHI) K.H. (#15 K 01691) için Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) ve bir hibe Bakanlığı inatçı hastalığı projeden incelenmesi için bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Sağlık, iş gücü ve refahı (K.Y. #201510032A). Edanz grubu (www.edanzediting.com/ac) bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Örnek bulaşma deri kaynaklı SM tarafından en aza indirmek için eldiven giymek. HeLa hücreleri % 10 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM Ltamamlanan kartal'ın en az gerekli ortamda yetiştirilen mevcut iletişim kuralı uygulandığı-glutamin, 1000 U/L penisilin ve 100 mg/L streptomisin.
1. hazırlanması Lipid örnekleri
Not: Test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapakları dahil olmak üzere tüm cam ürünleri deterjan-Alerjik olması önemlidir.
<ol><li>Toplam lipid kesir çekme--dan Bligh & Dyer yöntem7 kullanarak hücre homogenate<ol>
<li>Kültür kaldırma (veya şartına) medya 10 cm doku kültürü çanak ve durulama buz gibi PBS 6 mL ile iki kez.</li>
		<li>Buz gibi PBS 1 mL P1000 pipet tarafından 10 cm doku kültürü çanak içine ekleyin. Hücreleri hücre Kazıma aletleri ile hasat ve 2.0 mL silikonlu plastik tüpler içine toplamak.</li>
		<li>(1000 × g, 5 dk, 4 ° C) aralıklarla sonra süpernatant P1000 pipet tarafından kaldırın.</li>
		<li>1 mL metanol ekleyin. Kısaca tüpler ve 200 W 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide. Not: hücre Pelet verimli bir şekilde homojen bir banyo tipi sonicator su seviyesi ayarlayın.</li>
		<li>Metanol içinde hücre homogenate pipet tarafından test tüpleri (13 mm x 100 mm) Teflon kaplı vidalı kapağı içine aktarın.</li>
		<li>1 mL metanol, kloroform, Çift Kişilik distile su 0.8 mL ve 50 µL 10 µmol/L iç standart d18:1 /(D31)-16, 1 mL ekleyin: 0 SM her tüp içine.</li>
		<li>Girdap test tüpleri şiddetle oda sıcaklığında 5 min için. Not: Bu noktada, bir tek fazlı (kloroform/metanol/su 1/2/0.8 (v/v/v) =) oluşur.</li>
		<li>1 mL kloroform ve 1.0 mL Çift Kişilik distile su ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle girdap tüpler. Not: Bu noktada, sulu (üst) faz ve organik (alt) faz ayrılır.</li>
		<li>(Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve daha düşük faz tek kullanımlık cam tüpler (ilk alt aşaması) içine aktarın. Not: Pasteur pipet ve bir emanet pipet filtresi kullanarak alt aşaması toplamak. Pipet ucu alt aşama Ekle, üst aşaması ve pipet ucu içinde interfacial kabartmak sunmak için 'E' Vana yanındaki küçük ampul sıkmak ve pipet daha düşük faz sifon.</li>
		<li>Kloroform test tüpleri ve girdap içine 2 mL tüpler yeterince üst aşaması ve interfacial kabartmak ile karışımı oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle ekleyin.</li>
		<li>(Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve değiştirilen düşük faz adım 1.1.10 açıklandığı gibi ilk alt aşaması ile tek kullanımlık cam tüplerin içine aktarın.</li>
		<li>Cam tüpler bir azot akış altında yerleştirin ve organik çözücüler toplanan alt aşamasında tamamen kaldırmak.</li>
		<li>Örnekleri sulandırmak 500 µL etanol ve metanol ile filtrate ile 0,02-µm filtre ve mağaza-20 ° C'de cam şişe içinde</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrasyon eğrisi oluşturma ve doğrulama yöntemi için numune hazırlama<ol>
<li>0.1, 0.5, 1, 5, 10 veya standart bileşik 50 µmol/L, 50 µL ekleyin (d18:1 /(D9)-18:1 SM) test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapağı içine.</li>
		<li>Hücre homogenate her test tüpüne ekleyin ve 1 mL metanol ekleyin. Not: Cep homogenate bir matris olarak her deney göre değişebilir. 10 cm kültür tabağına hücrelerden türetilmiş örneklerinde SM tür düzenli olarak analiz edilir, hücre homogenate her test tüpü içinde miktarı bu hücre 10 cm kültür tabağına yakın olması gerekir.</li>
		<li>Toplam lipid kesir adımları 1.1.6-1.1.14 içinde açıklandığı gibi ayıklayın.</li>
		<li>Kalite kontrol (QC) örnekleri gibi adımları 1.2.1-1.2.3 descried yöntemi doğrulamak için hazır olun. Üç QC örnek standart bileşik farklı konsantrasyonları ile hazırlamak (d18:1 /(D9)-18:1 SM): bir 3 x (QC düşük, QC-L), Merkezi yakın bir standart eğri alt sınır içinde (QC-orta, QC-M) ve üst sınırına yakın bir Standart eğri (QC-yüksek, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analiz LC-ESI-MS/MS tarafından
<ol><li>Mobil faz hazırlanması<ol>
<li>Solvent karışımı (Asetonitril/metanol/GKD2O sulu faz ve isopropanol için organik faz için = 1/2/2 (v/v/v)) içinde cam şişe Teflon kaplı vidalı kapakları ve 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Formik asit (son konsantrasyonu 26,4 mmol/L) ve NH4OH ekleyin (14,9 mmol/L) her mobil faz içine.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS3 SM kalitatif analiz<ol>
<li>Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sistemi etkinleştirmek, giriş tüpler mobil aşamalarını içeren cam şişe koymak ve HPLC satırları temizle. HPLC sistemi bir C18 HPLC sütun (1.5 mm kimlik × 100 mm Uzunluk, parçacık boyutu 3.0 µm) bağlantı, sıcaklığı 50 ° C sütun fırında tutmak ve sütun ile 100 µL/dak örnekleri autosampl bir örnek rafa koymak, sulu mobil faz durumu er.</li>
		<li>Triple quadrupole ve birinci ve ikinci habercisi yanı sıra Tablo 1 ve Tablo 2 iyonları ilgi SM türlerin listelendiği gibi MS3 analizi için quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistemi parametrelerini ayarlamak.<ol>
<li>Veri toplama yazılımı simgesini çift tıklatın, çift tıklayın 'Donanım yapılandırma', 'LC + QTRAP4500 + Vana' seçin ve 'Profil' etkinleştir'i tıklatın.</li>
			<li>'Yeni alt projesi' ve 'Tamam' ı tıklatarak yeni bir alt klasör oluşturun.</li>
			<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MS/MS/MS (MS3)' tıklatın, oranı 10.000 Da/s, 'Negatif' olarak polarite ve sürekli olarak ' süre' analiz (dk) olmak inceden inceye gözden geçirmek. M/z 'Start (Da)' ve 'Dur (Da)' taranacak aralığı ayarlayın. SM tür ilgi hedefinin 1 ve 2 habercisi iyonların m/z ayarlayın. Not: birden fazla SM tür analiz için vurgulamak '-MS3' simgesi, sağ tıklatın, 'Bu deney Kopyala' seçin ve daha sonra diğer SM türlerin 1. ve 2 habercisi iyonların m/z koyun.</li>
			<li>'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: tarama modu 'Profil', adım boyu 0,12 (Da), çözünürlük Q1 ve Q3 olarak olarak sırasıyla seçme yoğunluğu eşik 0, ayar süresi 50 (ms), 1,5 ms olarak kitle aralıkları arasında duraklama olarak 'Birimi' ve 'Edebiyat', ' dinamik doldurmak saat ', Q3 giriş engel olarak 8 V ve uyarma zamanı 25 ms olarak.</li>
			<li>'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklayın ve select 'kaynak/gaz' sekmesini perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 parametrelerini ayarlamak. Sonra select 'Bileşik' sekmesini declustering potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji, uyarma enerji ve Tablo 2' de listelenen yayılmış çarpışma enerji parametrelerini ayarlamak.</li>
			<li>'Entegre Valco Vana' vurgulayın ve 'Pozisyon adı için adım 0' A olarak seçin ve 'B' olarak pozisyon için toplam 5.0 dk zaman. Ayrıca pozisyon için toplam olarak 'A' ayarla 70.0 dk zaman.</li>
			<li>'Shimadzu LC sistemi' vurgulayın. 'Pompa' sekmesini seçin ve pompalama modunu ayarlayın ikili akış, 0,28 mL/dk ve en fazla baskı limitler 20,0 MPa olarak olarak toplam akış olarak. 'Otomatik Örnekleyici' sekmesini seçin ve durulama 200 µL ayarlamak, 35 µL/s hızda durulama, örnekleme hızı 5.0 µL/s olarak kontur olarak 52 mm, iğne, 25,0 min zamanda tasfiye, 'Önce ve sonra aspirasyon' olarak 5 s ve durulama modu olarak dip zamanı durulayın.<ol>
<li>Ayrıca, soğutucu birimi etkinleştirmek, soğutucu sıcaklık 4 ° C ayarlayın ve denetim şişe iğne kontur 52 mm. seçtiğinizde 'Fırın' sekmesinde, fırın etkinleştirmek ve fırın sıcaklık ve en yüksek sıcaklığı 50 ° C ile 85 ° C anılan sıraya göre ayarla.</li>
				<li>'Denetleyicisi' sekmesini seçin ve 'Güç' kutuyu işaretleyin. 'Zaman programı' sekmesini seçin ve solvent degradeleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çözücüler A / B 100/0 oranında 5 min için 80/20 için doğrusal değişiklik program üzerinde 4 dk 35/65 üzerinde 50 dk ve 25/75 için 1 dk. sonra , 25/75 10 dk sonra doğrusal olarak 100/0 tutunuz 4 dak. Sonra yöntem kaydedin.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toplu iş dosyası oluşturun<ol>
<li>'Satın alma toplu yapı' simgesini çift tıklatın, 'Set Ekle','ı tıklatın 'Örnekleri' eklemek, yeni örnekleri ayarlamak ve 'Tamam' ı tıklatın.</li>
			<li>' Yöntemi Düzenleyicisi ' düğmesini tıklatın ve kullanılacak yöntemi seçin. Bir toplu iş dosyasında birden çok yöntemi kullanılırsa, 'Birden fazla yöntemleri kullan' kutuyu işaretleyin ve her örnek için edinme yöntemini seçin. ' Örnek yeniden adlandırın ', 'Şişe konumunu' uygun bir sayı belirleyin ve enjeksiyon Birim miktar koymak. Ardından toplu iş dosyasını kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>MS3 ürün iyon spectra ilgi SM türlerin LC-ESI-MS3 analizi tarafından elde.<ol>
<li>Toplu iş dosyasında 'Gönder' sekmesini seçin, örnekleri analiz satırı vurgulayın ve 'Gönder' düğmesini tıklatın.</li>
			<li>Tıklatın "View Quene' simgesini, 'Equilibrate' simgesi, kullanılması, saat 1 dk. ayarla ve 'Tamam' ı tıklatın için satın alma yöntemi seçin.</li>
			<li>'İnce ayarlar için rezerv araç' karşılık gelen simgeyi tıklatarak devre dışı bırakın. Sonra toplu sırayı "Basit Başlat" simgesini tıklatarak yürütmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her MS3 ürün iyon spectra SM oranı (m/z) çarpımı iyon spectra şarj etmek için kitle ve sphingoid tam kitle karşılaştırarak atamak LCB ve N-asil yan ilgi. Karbonlar ve çift sayı Tahvil sphingoid LCB ve Nbelirlemek-ilgili ürün iyonları göre asil yan.<ol>
<li>Uygun alt proje klasörün işaretlendiğinden emin olun, 'Açık veri dosyası' simgesini çift tıklatın ve analiz edilecek örnekleri seçin. Zirve Kromatografik her hedef SM türler için sürükleyin ve sonra çift tıklatın. Elde edilen MS3 ürün iyon spectra sürüklenen alanı içinde sunulacak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kantitatif analiz LC-ESI-MS/MS tarafından SM<ol>
<li>Mobil aşamaları ve HPLC sütun 2.1 ve 2.2.1. adımda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
		<li>Triple quadrupole ve quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistem izleme (MRM) çözümlemesi Tablo 1 ve Tablo 2içinde listelendiği gibi birden çok tepki için parametrelerini ayarlamak.<ol>
<li>2.2.2.1 ve 2.2.2.2. adımda açıklandığı gibi ve prosedürlerini yürütecektir.</li>
			<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MRM', 'Pozitif' olarak polarite'yi seçin. 'Süre' çözümlenmesi için tüm zaman olarak ayarlayın. [M + H]+ m/z ve 184 'Q1 kitle (Da)' ve 'Q3 kitle (Da)' hedef SM tür ilgi anılan sıraya göre ayarlayın. 'Zaman' 10 ms ve hedef SM tür adı olarak ' ID' olarak ayarlayın.</li>
			<li>'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: çözünürlük Q1 her ikisini ve Q3 'Birimi', yoğunluk eşik 0, olarak olarak saat (ms) 0 ayarlanması ve duraklatma 5 ms olarak kitle aralıkları arasında.</li>
			<li>'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklatın ve parametre perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 koymak ' Kaynak/gaz' sekmesini seçin. Sonra potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji ve Tablo 2' de listelenen çarpışma hücre çıkış potansiyel declustering parametreleri koymak 'Bileşik' sekmesini seçin.</li>
			<li>Vana 2.2.2.6 adımda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
			<li>LC koşulu 2.2.2.7. adımda açıklandığı gibi ayarlayın. Sonra yöntem kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3. adımda açıklandığı gibi toplu iş dosyası oluşturun.</li>
		<li>2.2.4. adımda açıklandığı gibi LC-ESI-MS/MS analizi tarafından her SM türlerin MRM verileri alır.</li>
		<li>Veri tümleştirmesi için yazılım kullanarak MRM verileri işlemek ve ayıklanan iyon Kromatografik her SM türler için en yüksek alan verileri elde etmek.<ol>
<li>Veri tümleştirmesi kantitatif analiz yazılımı simgesini çift tıklatın, 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve Tümleştirme Kullanıcı Varsayılanlarını seçin. Gauss pürüzsüz genişlik 1,0 punto ayarlayın ve 'Tamam' ı tıklatın. 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve 'Yeni sonuçları tablo' seçin. Entegre edilebilir, bir ok düğmesini tıklatın ve 'İleri' düğmesini tıklatın örnek seçin. 'Yeni yöntem Oluştur' seçin, yöntemin adını ayarla ve 'İleri' yi tıklatın. 'İleri' düğmesini tıklatın ve d18:1 /(D31)-16 kutuyu işaretleyin: 0 SM olduğu gibi 'İleri' düğmesini tıklatın ve '' Son'u tıklatın.</li>
			<li>'Tepe inceleme görüntüler' tıklatın ve Kromatografik doruklarına uygun şekilde tanındığını onaylayın. Bu unutulmamalıdır bu d18:1 /(D31)-16 tutma zamanı: SM tarafından genellikle daha küçük 0 ~ 34-1 SM biri ile karşılaştırıldığında 0.3 min (genellikle oluşur d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1 /(D31)-16 her SM türlere zirvesine her SM tür oranı göre ölçmek: 0 SM iç standart.<ol>
<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, 'Ver' seçin, 'Sonuçları tablo' seçin, Biçim 'MultiQuant', 'tüm sütunları vermek gibi' sütun onaylamak, satır olarak 'Bu açıkça gizli dışında tüm satırları Aktar' ve 'Tamam' tıklatın.</li>
			<li>Dışa aktarılan dosyayı Excel yazılımında açın. SM tür hedef alan IS alanına göre normalize (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Sonra hedef eklenen örnek SM türler miktarını hesaplamak için IS enjekte örnek teorik miktarıyla çarpın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Standart eğri oluşturmak yoluyla<ol>
<li>D18:1 /(D9)-18 MRM veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 SM örneklerde standart eğri LC-ESI-MS/MS analizi tarafından adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi oluşturmak için.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18 pik alanının veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 2.3.5. adımda açıklandığı gibi SM.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.6 olarak eklenen örnek.</li>
		<li>/(D9)-18 x ekseni ve y ekseni nominal tutar ve d18:1 hesaplanan miktarı ayarlayarak eğilim çizgisini oluşturmak: 1 SM ve eğilim çizgisi formül elde edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Nicel yöntemi Excel yazılımı kullanarak doğrulama<ol>
<li>Yöntem doğrulamak için d18:1 /(D9)-18 miktarını ölçmek: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 QC SM örnekleri her QC analiz ederek örnek en az üç kez 1 günde ve adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi en az 3 gün tekrarlayın.</li>
		<li>En yüksek alan verileri elde etmek ve d18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.5 ve 2.3.6 olarak eklenen örnek.</li>
		<li>Kalibrasyon eğrisi elde göre d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM enjekte örnek.</li>
		<li>Hassas değerlendirilmesi<ol>
<li>Ortalama ve standart sapma d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM içi günün veri kümesinde 2.5.3. adımda elde edilen ve arası gün Excel yazılımı kullanarak.</li>
			<li>2.5.4.1 adımda elde ortalama standart sapma tarafından bölünmüş ve % ifade.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Doğruluk değerlendirilmesi<ol>
<li>Her veri doğruluğunu aşağıdaki gibi hesaplar: [(2.5.3. adımda elde hesaplanan tutar.) / (Nominal tutar) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Veri kümesi içi günlük ve arası gün üzerinde doğruluk mutlak değerini ortalamasını hesaplamak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li>
<li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li>
<li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+pathways%2C+functions%2C+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li>
<li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipidomics%3A+high-throughput%2C+structure-specific%2C+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li>
<li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li>
<li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/10.1139/o59-099#.WlOY-N-nHIU">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS%2FMS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability%2C+data+quality%2C+and+assay+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+dissociation%3A+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li>
<li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li>
<li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li>
<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Mevcut nitel yöntemde, biz MS3 ürün iyonları bir SPC ve bir Nelde edilen-asil yan. Düzgün bir SPC ve bir Natamak için önemlidir-asil yan. Bu amaçla, bu diğer phosphorylcholine içeren moleküller de MS3 ürün iyonları tespit edilebilir olması gerekmektedir. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) ve plasmalogen-PC bol memeli hücrelerinde varsa ve onların hydrophobicity SM benzemektedir. Bu nedenle, diacyl-PC ve plasmalogen-PC ile bir izotop (genellikle 13C) teorik olarak aynı anda ...

Sphingomyelin (SM) memeli hücrelerinde ortak bir sphingolipid var. Sphingosine-1-fosfat ve bir ceramide bağışıklık içinde çok önemli rolleri olan kaçakçılığı hücre ve bariyer Homeostazı, sırasıyla2deri gibi SM sentezlenmiş intracellularly1 ve diğer organizmalardandır için bir habercisi olarak hediye. 3. Böylece, SM metabolizma kesin analizini organizmalardandır fizyolojik ve patolojik rolleri elucidating için önemlidir.
SM bir ceramide ve daha da bir sphingosine ve bir Noluşan ceramide 1-hidroksi grubuna bağlı bir phosphorylcholine oluşur-asil yan. Sphingosine ve Nkarbon ve çift bağ sayıları içinde a değişiklik-asil yan sonuç sütun sayısı ve ceramide (SM) tür. Son gelişmeler LC-ESI-MS/MS / SM4,5nicel ve nitel analiz sağladı. Kalitatif analiz, karbon sayısı ve çift bağı bir sphingoid SM LCB ürün iyon spectra LCB in atayarak tespit edilmiştir. Ancak, yapısal bilgi N-asil yan doğrudan elde değil onun karşılık gelen ürün iyonları rapor değil çünkü ve bu nedenle N-asil moieties habercisi iyonlar arasındaki fark analizi tarafından sonuca vardım ve Ürün iyonları LCB için her iki pozitif ve negatif iyon modları4,5' te karşılık gelen. Bu raporda, biz ürün iyonları LCB ve Nalgılamak için bir yöntem mevcut-asil yan triple quadrupole ve hassas yapısal kolaylaştırır quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak modunda aynı anda MS3 spekülasyon her SM türler6.
Biyolojik örnekler matrisinde neden iyon bastırma (veya geliştirme) etkileri LC-ESI-Bayan analizi doğru miktar engel ve bu nedenle, aynı matris ilgi bütün analitler için kalibrasyon eğriler oluşturmak için arzu edilir biyolojik örneği. Ancak, hemen hemen bütün SM türlerin biyolojik örneklerde, özellikle de kapsamlı bir analiz hazırlamak mümkün olduğundan bu strateji mümkün değil. Böylece, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak ve biyolojik örneklerde çivili bir temsilcisi SM türler kullanarak sayısal Aralık belirlemek pratiktir. İki isotopically etiketli SM türler bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan; bir dahili bir standart diğeri bir standart bileşik kullanıldı. Küçük bir miktar isotopically etiketli SM türlerin biyolojik örnekleri çivili ve başarıyla bir kalibrasyon eğrisi ve nicel aralığı6elde edilen standart bir bileşik tespit ettik.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm doku kültürü kabı</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Silikonlu 2.0 mL tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon astarlı vidalı kapak</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık cam tüp</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 & mikro; m 1,5 mm İç Çap x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Koruma kartuşu, kartuş tutucuya takılır ve C18 sütununa bağlanır</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm KORUMA KARTUŞU</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Kartuş tutucu</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (İzopropil Alkol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>%28 Amonyak suyu</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör (banyo tipi)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Cam test tüpü için girdap karıştırıcı</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL cam flakon</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Numuneler, vidalı kapakla kapatılmış 1.4 mL cam şişede ve -20 ° C'de 8 mm septumda saklanır; C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Numuneler analiz edildiğinde, vidalı kapaklar yarık septumlu vidalı kapaklarla değiştirilir</td></tr><tr><td>1,4 mm cam flakon için vidalı kapak</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Yarık septumlu vidalı kapak</td><td>Shimadzu</td><td>GLC GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &mikro; m filtre</td><td>Kırlangıç</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Üçlü dört kutuplu ve dört kutuplu doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometresi</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>Ürün iyon spektrumlarının veri toplama ve analizi için yazılım</td><td>SCIEX</td><td>Analisti</td><td></td></tr><tr><td>Kantitatif analizde veri entegrasyonu için yazılım</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sistemi</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sfingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sfingosilfosforilkolin</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutamin</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Kartal' s minimum esansiyel ortam</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

sphingomyelin türler sphingomyelin lc-ms iki kararlı isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Biz sphingomyelin (SM) niteliksel çözümleme ve kantitatif sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) tarafından bir yöntem mevcut. SM bir phosphorylcholine ve bir ceramide hidrofilik ve hidrofobik bileşeni olarak sırasıyla oluşan bir ortak sphingolipid var. SM türlerinin sayısı sphingoid uzun zincirli temel (LCB) içinde a değişiklik nedeniyle memeli hücreleri mevcut ve bir N-asil yan ceramide içinde. Bu raporda, biz karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısı tahmin etme yöntemi gösterir-asil yan onların karşılık gelen ürün iyonları MS/MS/MS (MS3) deneylerde dayalı. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi SM tür biyolojik örnekler ve kozmetik gibi endüstriyel ürünlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.

Kimyasal sentez d18:1 / 24:0 SM (şekil 1A) ve d18:1 / 24:0 SM lipid örneklerinde HeLa hücreleri (şekil 1B) elde analiz LC-ESI-MS3 [M + HCOO]- istihdam ve [M-CH3] tarafından- birinci ve ikinci habercisi iyonları, olarak anılan sıraya göre. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) spektrum yoğunluğunu SM Ndaha büyük olduğ...

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik örneklerdeki her bir Sfingomyelin türünün miktarını ve yapısını hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu yöntem, lipid biyolojisi ve lipid ile ilgili lipid alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyolojik numunelerde çeşitli Sfingomyelin türlerini kromatografi kütle spektrometresi sistemi ile karakterize edebilmemizdir. Başlamak için, kültür ortamını HeLa hücreleri içeren 10 santimetrelik bir doku kültürü kabından çıkarın ve hücreleri altı mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez durulayın.Daha sonra 10 santimetrelik doku kültürü kabına bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri toplamak için bir hücre sıyırıcı kullanın. Tabağın yüzeyinden çıkarıldıktan sonra, hücreleri iki mililitrelik silikonlu plastik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve her hücre peletine bir mililitre metanol ekleyin.Sonra tüpleri kısaca girdaplayın. Daha sonra, numuneleri banyo tipi bir sonikatör içine yerleştirin ve beş dakika boyunca 200 watt'ta sonikasyon yapın. Bittiğinde, tüm hücre homojenatını Teflon kaplı vidalı kapaklarla donatılmış test tüplerine aktarın.Şimdi her bir test tüpüne b

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.

Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi

Tahmin edilen birçok (fosfo)lipaz, substrat özgüllükleri ve fizyolojik fonksiyonları açısından zayıf bir şekilde karakterize edilir. Burada enzim aktivitelerini optimize etmek, doğal substratları aramak ve bu enzimler için fizyolojik işlevler önermek için bir protokol sunuyoruz.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT'ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.

Kütle Spektrometrisi Analizi için Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiğine Gömülü İnsan Dokularının Hazırlanması

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

Öğrenin, LC-MS/MS ve üç aşamalı kütle spektrometrisi kullanarak biyolojik örneklerde sfingomiyelin türlerinin nicel ve nitel analizini. Bu yöntem lipid biyolojisi araştırmalarında hassas lipid karakterizasyonu sağlar.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Daha fazla video keşfet