Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Bu prosedürün genel amacı, fosfoinositid fonksiyonunu ve regülasyonunu anlamak için çeşitli genetik ve çevresel koşullar altında hücrelerdeki her bir fosfoinositid türünün miktarını ölçmektir. Fosfoinositid lipidleri, göç, replikasyon ve bellek trafiği gibi hücre fonksiyonlarını kontrol eder. Bu yöntem, fosfoinositidleri etkileyen genetik ve çevresel koşulları tanımlar ve bunların düzenlenmesi ve işlevleri hakkındaki bilgimizi artırır.

Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin içindeki tüm fosfoinositidlerin doğru, eşzamanlı ölçümüne izin vermesidir. Bu yöntem, mayalardaki fosfoinositidlerin düzenlenmesi hakkında fikir verebilse de, kültürlenmiş memeli hücrelerine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler, etiketleme, işleme ve analiz için gereken birçok adım nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Önce radyoaktif etiket olmadan pratik yapmanızı öneririz. Başlamak için, maya türünün 20 mililitrelik sıvı bir kültürünü, 30 santigrat derecede tam sentetik ortamda, orta log fazına kadar sürekli çalkalayarak SEY6210 büyütün. Daha sonra, maya hücrelerinin toplam 10 ila 14 OD'sini 12 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin.

Ortamı boşaltın. Ve peleti 2 mililitre inositol içermeyen ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri tekrar santrifüj edin.

Ve sonra peleti 440 mikrolitre inositol içermeyen ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 60 mikrolitre trityum etiketli miyo-inositol ekleyin ve hücreleri sürekli çalkalama ile 30 santigrat derecede bir ila üç saat daha büyütün.

Hücre süspansiyonunu 500 mikrolitre% 9 perklorik asit ve 200 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü tekrar tekrar ters çevirerek karıştırın ve ardından beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, tüpü 10 dakika boyunca maksimum hızda girdaplayın.

Daha sonra, cam boncukların aspire edilmesini önlemek için bir jel yükleme ucu kullanarak lizatı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri tamamen dağılana kadar bir mililitre buz gibi soğuk 100 milimolar EDTA'da sonikasyon yapın ve tekrar santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, EDTA'yı radyo etiketli peleti içeren tüpten aspire edin. Peleti yeniden askıya almak için 50 mikrolitre su ve sonikat ekleyin. Metin protokolüne göre taze deasilasyon reaktifi hazırlayın.

Daha sonra tüpe 500 mikrolitre deasilasyon reaktifi ekleyin ve karıştırmak için sonikat ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, numuneyi 50 dakika boyunca 53 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna aktarın.

Daha sonra, numuneyi bir vakumlu santrifüje yerleştirin ve en az üç saat kurumasını bekleyin. 300 mikrolitre suda sonikasyon yaparak peleti yeniden askıya alın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, numuneyi en az üç saat boyunca bir vakumlu santrifüjde tamamen kurutun.

Kuruduktan sonra, tüpe 450 mikrolitre su ekleyin ve peleti tamamen dağılana kadar sonikasyon yaparak tekrar askıya alın. Metin protokolüne göre taze ekstraksiyon reaktifi hazırlayın. 300 mikrolitre ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve beş dakika boyunca maksimum hızda girdap yapın.

Tüpü iki dakika boyunca 18000 kez G'de santrifüjleyin ve alt sulu tabakayı dikkatlice yeni bir tüpe pipetleyin. Daha sonra, son sulu fraksiyonu en az üç saat boyunca vakumlu santrifüjleme ile kurutun. Daha sonra, 50 mikrolitre suda sonikasyon yaparak peleti tamamen dağıtın ve numuneyi 20 santigrat derecede saklayın.

Son olarak, 6 mililitrelik bir polietilen sintilasyon şişesinde dört mililitre sintilasyon sıvısına iki mikrolitre ekleyerek numunenin radyoaktivitesini belirleyin. Açık pencereli bir sıvı parıldama sayacı kullanarak şişenin CPM'sini kaydedin. Trityum etiketli glisero-inotidlerin ayrılması için HPLC sistemini kurmak için önce A ve B tamponlarını ve metin protokolüne göre kromatografi kolonunu hazırlayın.

Daha sonra, numunenin 10 milyon CPM'sini, yaylı 250 mikrolitrelik bir ek ile donatılmış iki mililitrelik bir enjeksiyon şişesine yükleyin ve toplam 55 mikrolitrelik bir hacim için su ekleyin. Şişeyi, PTFE silikon septum ile donatılmış bir vidalı kapakla kapatın ve benzer bir şişedeki bir su boşluğu ile birlikte HPLC sisteminin otomatik örnekleme tepsisine yerleştirin. HPLC sistemindeki yazılımı kullanarak bir elüsyon protokolü programlayın.

Beş dakika boyunca yüzde bir B, kırk dakika boyunca yüzde bir ila 20 B, on dakika boyunca yüzde 20 ila 100 B, beş dakika boyunca% 100 B, yirmi dakika boyunca yüzde 100 ila yüzde bir B ve sonra on dakika boyunca yüzde bir B. Pompa akış hızını 90 dakika boyunca dakikada 1,0 mililitre ve basınç sınırını 400 bar'a ayarlayın. Bunu, akış sintilatöründe dakikada 60 dakika çalışacak, parıldama sıvısı akış hızı dakikada 2,5 ve 8,57 saniyelik bir bekleme süresi ile bir algılama protokolü ayarlayarak takip edin.

Ardından, dengeleme protokolünü çalıştıran su boşluğu ile başlamak için HPLC üzerinde otomatik bir enjeksiyon dizisi programlayın, ardından elüsyon protokolündeki radyo etiketli numune ile devam edin. Dengeleme protokolü tamamlanmadan önce, elüsyon protokolü tarafından tetiklenen algılama protokolünü kullanarak tüm numuneleri ölçmek için akış sintilatöründe bir parti dizisi oluşturun. HPLC verilerini analiz etmek için önce kromatograf kantitasyon yazılımını kullanarak her numune için ham veri dosyasını açın.

Kromatogramlar sekmesinde, zaman çözünürlüğünü korurken daha küçük tepe noktalarını uzatmak için yakınlaştırın. Analiz için her bir tepe noktasını vurgulamak için ROI ekleme aracını kullanın ve ardından tepe noktalarını elüsyon sürelerine göre belirleyin. Her zirvenin alanını bulmak ve kaydetmek için bölgeler tablosu sekmesini kullanın.

Aynı zamanda, her zirvenin başlangıç ve bitiş zamanını not edin. Ardından, aynı süreyi kapsayan, zirveye bitişik bir bölgeyi vurgulayarak her tepe için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin. Elektronik tablo yazılımını kullanarak, o bölge için sayım sayısını ilgili tepe noktasının sayımlarından çıkarın.

Her bir zirvenin alanını ebeveyn gliserasyonlu inositol zirvesine karşı normalleştirin ve ebeveyn fosfatidilinositolün yüzdesi olarak kaydedin. Ardından, her bir deney koşulundaki tepe noktalarının her birini kontrol koşuluna göre normalleştirin ve kontrole kıyasla uç kat artışı olarak ifade edin. Dosyaları Dosya'ya tıklayarak ve Farklı Kaydet'e tıklayarak ve CSV biçimini seçerek dışa aktarın.

Son olarak, verileri çizmek için CSV dosyasını bir elektronik tablo programında açın. Radyo işaretli maya fosfoinositidlerinin analizi HPLC ile yapıldı. Maya hücreleri sadece dört fosfoinositid ürettiğinden, bir saatlik çift gradyanlı elüsyon yöntemi ile çözünürlük elde edilebilir.

Sekiz ila dokuz dakika arasında ima edilen gliserasyonlu inositol zirvesi, diğer tüm fosforile türlerden gelen sinyali gölgede bıraktı. Bu nedenle, radyoaktif sinyalleri entegre etmeden önce izin diğer tepe noktalarını içeren kısmını yakınlaştırmak gerekir. Yabani tip, ATG18 silinmiş ve VAC14 silinmiş maya suşları, bu HPLC yöntemi kullanılarak fosfatidilinositol 3, 5-bifosfattaki değişiklikler için test edildi.

ATG18 silinmiş mutantın en fazla fosfatidilinositol 3, 5-bifosfat ürettiği ve VAC14 silinmiş mutantın en az üretildiği gösterildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, belirli maya suşuna veya hücre tiplerine göre büyüme ve etiketleme koşullarını optimize etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, fosfoinositidlerin tespiti için HPLC akış sintilasyonunu tamamlamak için GFP ile kaynaşmış biyosensörler gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, HPLC bağlantılı akış sintilasyonu ile fosfoinositidlerin nasıl radyo etiketleyeceğinizi, çıkarılacağını ve ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Radyoaktivite ve organik çözücülerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek ve uygun eğitim gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.