Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Bu yöntemin genel amacı, fisyon mayasındaki tüm eşeyli üreme sürecini ışık mikroskobu ile izlemektir. Bu yöntem, çiftleşme partneri seçimi, polarize büyüme, hücre-hücre füzyonu, miyoz ve sporülasyon gibi cinsel yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarının hızlandırılmış görüntülenmesi için fisyon maya hücrelerinin hazırlanmasını açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücreli görselleştirme sağlaması ve böylece hücrelerin eşzamanlı olarak cinsel farklılaşmaya girmemesi sorununun üstesinden gelmesidir.

Bu yöntem çok basittir, ancak görsel gösterim, mikroskopi için birkaç suşun paralel olarak nasıl monte edileceğini göstermek için yararlıdır. Doktora öğrencim Omaya Dudin ile prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Laura Merlini olacak. Bu protokolün, homotalik veya heterotalik suşlar kullanılarak cinsel yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarını incelemek için uyarlanabilen çeşitli varyasyonları vardır.

Bu gösteride homotalik H90 suşları kullanılacaktır. Bu suşlarda, çiftleşme tipi değiştirme, nitrojen yoksunluğundan sonraki son mitotik bölünme sırasında gerçekleşir ve bu da iki çiftleşme tipinin bir karışımı ile sonuçlanır. Akşamları, çiftleşme deneyinden iki gün önce, katı ortamdan taze çizgili suşları nitrojen veya MSL artı N ile 3 mililitre minimum sporülasyon ortamı içeren kültür tüplerine aşılayın. Gece boyunca 25 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.

Ertesi sabah, gerekirse, gün boyunca üstel büyümeyi sağlamak için hücre süspansiyonlarını MSL artı N'de seyreltin. Akşamları, optik yoğunluğu ölçün ve hücreleri 20 mililitre MSL artı N ortamındaki 100 mililitrelik şişelerde 025 optik yoğunluğa seyreltin Vahşi tip hücre kültürleri, ertesi sabah yaklaşık 8'lik bir optik yoğunluğa 600'e ulaşmalıdır. Bu nedenle, daha uzun üretim sürelerine sahip suşlarla çalışılıyorsa, seyreltme buna göre ayarlanmalıdır.

Kültürleri gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ertesi sabah, her kültürün 8 civarında 600 optik yoğunluğa sahip olduğunu doğrulamak için optik yoğunluğu ölçün. Hücreleri bir dakika boyunca 1000 x g'da pellet yapın ve 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri nitrojen veya MSL eksi N olmadan 1 mililitre minimum sporülasyon ortamında üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, hücreleri 3 mililitre MSL eksi N ortamında yeniden süspanse edin. Optik yoğunluğu ölçün ve hücreleri 1.5'in 600'ü optik yoğunluğa seyreltin. Agaroz pedlerinin hazırlanmasına başlamak için, önce 95 derece Celsius'luk bir ısı bloğunda 10 ila 15 dakika boyunca yüzde 2 oranında MSL eksi N agaroz Aliquat'ı eritin.

Bu arada, daha önce 1000 x g'da bir dakika boyunca hazırlanan hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve kalan 2 ila 4 mikrolitre ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreler tezgahta beklerken, iki ara parça arasına bir cam slayt üzerine 200 mikrolitre erimiş ortam ekleyin.

Erimiş agarın üzerine yavaşça başka bir slayt yerleştirin. Agaroz katılaştıktan sonra, ara parçaları dikkatlice çıkarın. Üst cam sürgüyü çıkarmak için yavaşça döndürün ve yana doğru çekin.

Aynı anda birkaç suş görüntülenecekse, ped dört mini pede bölünebilir. Bunun için bir tıraş bıçağı kullanın ve parçaları yaklaşık 1 milimetre kenara çekerek pedi ortadan ayırın ve dik yönde tekrarlayın. Agaroz pedine 1 mikrolitre hücre ekleyin ve yaklaşık bir dakika bekleyin.

Hücreleri bir kapak fişi ile örtün ve kapak fişinin tüm çevresini ısıtılmış VELAP ile kapatın. Pedin kurumasını önlemek için tüm kapak sürgüsünün sızdırmaz hale getirilmesi önemlidir. Görüntülemeden önce pedi en az 30 dakika bekletin.

Protokolün başarısını ve yüksek çiftleşme verimliliğini sağlamak için, hücreler nitrojen açlığına kadar üstel büyümede tutulmalı ve fazla sıvı olmadan monte edilmelidir, böylece agaroz pedi üzerinde sabit kalırlar. Çiftleşen maya hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi daha sonra protokol metninde açıklanan prosedürü izleyerek 25 santigrat derecede veya oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Hızlandırılmış görüntüleme, nitrojen açlığını takip eden 24 saat içinde shmooing, füzyon ve sporülasyon geçiren hücrelerin görselleştirilmesine izin verir.

Bu işlem, bu temsili filmde sol alt iç kısımda büyütülmüş iki hücre ile gösterilmiştir. Bu protokol, çiftleşen hücrelerde floresan etiketli proteinlerin dinamiklerini izlemek için de kullanılabilir. Burada, 3GFP ile etiketlenmiş myo52'yi eksprese eden bir heterotalik H-suşu, kırmızı floresan tdTomato proteinine ve ayrıca sitozolik GFP'ye kaynaşmış myo52'yi eksprese eden heterotalik bir H+ suşu ile eşleştirildi.

Sitozolik GFP, H hücresine girişi ile görselleştirilen füzyon zamanlamasının izlenmesine izin verir. Bu hızlandırılmış görüntüler, myo52'nin başlangıçta hücre korteksi boyunca dinamik bölgelere oluştuğunu göstermektedir. Myo52 sinyali daha sonra füzyon olayından hemen önce tek bir odakta stabilize edildi.

Bu videoyu izledikten sonra, fisyon mayasının çiftleşme sürecinin verimli çiftleşme ve canlı hücre araştırması için hücrelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.