İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Bu deneyin genel amacı, optimize edilmiş transfeksiyon ve nükleer etkileşim protokolleri kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde yüksek transfeksiyon verimliliği elde etmektir. Bu, öncelikle insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin feeder-free (besleyici hücre içermeyen) kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Transfeksiyon için, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler gecelik olarak gelt, TRX veya matrigel üzerine ekilir.

Çekirdek etkileşimi için tripsin ile küçük hücre kümeleri elde edilirken, ekilmiş hücrelere plazmid DNA ve gen suyu transfeksiyon reaktifi karışımı eklenir ve ardından plaka santrifüj edilerek 37 °C'de inkübe edilir. İnsan iPS hücre süspansiyonu, bir çekirdek etkileşim cihazında çekirdek etkileşimine tabi tutulur, hücreler meth koşullu besiyerinde yeniden süspanse edilir ve 37 °C'de inkübe edilir. Sonuç olarak, insan iPS hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği yoluyla etkili genetik manipülasyonu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, önceden tanımlanmış transfeksiyon elektroporasyonu ve nükleer affeksiyon yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, laboratuvarımızda insan IPS hücrelerinde tutarlı sonuçlarla yüksek transfeksiyon verimliliğinin rutin olarak sağlanabilmesidir. Protokollerimiz ayrıca genetik modifikasyon sonrası minimum hücre ölümünü garanti eder. Bu nedenle, protokollerimiz transgenik insan IPS hücre hatlarının hızlı ve büyük ölçekli bir şekilde üretilmesine olanak tanır. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini besleyici hücre içermeyen kültürlere adapte etmeden önce, gelt TRX kaplı kaplar hazırlayın.

Ardından, daha önce besleyici hücreler üzerinde kültüre edilmiş insan IPC'lerini kuyuk başına 1 mL Accutane ile masajlayın ve hücrelerin çoğu ayrılmaya başlayana kadar 37 °C'de bir dakika inkübe edin; hücrelere 10 ila 15 adet cam boncuk ekleyin ve plakayı nazikçe sallayın. Sonra 2 mL knockout D-M-E-M-F 12 ekleyin ve nazikçe trite edin. Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 800 RPM hızda santrifüjleyin. İnsan iPSC peletine dokunmadan süpernatantı aspire edin. Hücre peletini nazikçe dağıtmak için tüpü hafifçe vurun.

Reese, insan IPSC peletini uygun hacimde STEM pro medyumda süspanse et ve gel TRE kaplı bir plakanın kuyucuklarına dağıt. Proliferasyon hızına bağlı olarak, insan IPC'leri bir ikiye veya bir altıya oranında pasajlanabilir. Plakayı dikkatlice %5 karbon dioksitli, 37 degrees Celsius bir inkübatöre yerleştir ve hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılmasını sağlamak için plakayı nazikçe salla.

Hücreleri günlük olarak besleyin. Hücreler %80 konfluense ulaştığında, yeni bir jele tekrar pasajlanmaya hazır hale gelirler. Optimal transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, bir e iki oranında bölünen ve Rex ile kaplanmış kuyucuktaki hücreler, transfeksiyon günü yaklaşık %40 ila %50 konfluens düzeyinde olmalı ve jel kaplı kuyucuğa eşit şekilde dağılmış küçük koloniler halinde bulunmalıdır.

Bu prosedüre başlamak için, steril bir 1,5 mililitrelik eppendorf tüpünde 100 µL nakavt besiyeri hazırlayın. 27 µL gene juice transfeksiyon reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, dört µg plazmid DNA ekleyin.

Plazmid seçimi, optimal transfeksiyon verimliliği için kritiktir. Burada kullanılan plazmid, insan IPC'lerinde transkripsiyonel olarak aktif olan güçlü bir promotör olan CAG promotörü tarafından yönlendirilen geliştirilmiş yeşil floresan proteine sahiptir. Tüpü 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

15 dakika sonra, gen suyu DNA karışımını hücrelere ekleyin ve plakayı şişirin. Transfeksiyon karışımının kuyucuktaki insan IPC'leri ile temasını artırmak için plakayı 1.200 RPM hızında beş dakika boyunca döndürün. Hücreleri 37 °C'de ertesi güne kadar gece boyunca inkübe edin.

Nükleer transfeksiyondan önce, insan IPC'lerini 37 °C'de en az bir saat boyunca 10 µM ROCK inhibitörü ile ön işlemden geçirerek transfeksiyon verimliliğini izleyin. Steril 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpünde 82 µL insan kök hücresi nükleer efektör çözeltisi hazırlayın. 80 µL ekleyin.

Ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Çözeltiyi 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Daha önce hazırlanmış feeder hücre koşullandırılmış ortamını ve %0,25 tripsin-EDTA'yı steril kabin altında 37 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun.

Bir adet steril 15 mililitrelik konik tüpü önceden etiketleyin. Çekirdek transferi yapılacak insan iPSC kültüründeki besiyerini dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve tripsin ekleyerek hücreleri 37 °C'de üç dakika inkübe edin.

Başarılı bir çekirdek enfeksiyonu için, hücrelerin tripsin ile tekil hücrelere ayrılmaması kritik önem taşır. Bunun yerine, hücreler iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler halinde tritüre edilmelidir. Hücreleri bir P 1000 pipet ucuyla nazikçe tekrar geçirerek iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler haline getirin.

Tüm insan IPC'lerinin tamamen ayrıldığından emin olmak için kuyucuğun tabanını tekrarlanan pipetleme ile yıkayın. Ardından hücre süspansiyonunu etiketlenmiş 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Sonrasında, dokuz mililitre fare embriyonik fibroblast ortamı ekleyin.

Tripsini inaktive etmek için hücreleri 800 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin. Hücreleri, önceden ısıtılmış bir insan kök hücre nükleer efektör solüsyonunun 100 microliters hacmindeki kısmında süspanse edin.

1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri nükleer efektör tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonuna 4 µg plazmid DNA ekleyin; hücreleri ve DNA'yı hafifçe çalkalayarak karıştırın. Tüpü steril kabin yüzeyine iki kez hafifçe vurun.

Veti, nükleer efektör cihazının nükleer efektör tutucusuna yerleştirin. x düğmesine basarak B 0 1 6 nükleer efekt hücreleri programını seçin; ekranda Okay görüntülenecektir. Genellikle bir ila beş saniye süren nükleer efekt işlemi tamamlandığında, nükleer efekt kitinde sağlanan plastik pasta pipeti ile nükleer efekt uygulanmış hücreleri vetten geri alın. Hücreleri, önceden ısıtılmış CM ve rock inhibitörü içeren steril 1,5 mililitrelik bir eend orph tüpüne resüspansiyon yoluyla askıya alarak geri kazanın. Hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

10 dakika sonra, hücreleri besleyici tabakalara damla damla aktarmak için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün transfeksiyon verimliliğini izleyin.

Burada, plazmit DNA transfeksiyondan 12 saat sonra, GeneJuice kullanılarak transfekte edilmiş EGFP eksprese eden RIV one insan iPSC hücrelerinin fotomikrografları gösterilmektedir. İnsan iPSC'lerinin GeneJuice kullanılarak yapılan DNA transfeksiyonda, güçlü bir promotör kullanımı, geçici transfeksiyon analizinde tipik olarak %60'tan fazla EGFP raporcu eksprese eden hücre sağlar.

EGFP eksprese eden hücreler, B 0 1 6 nükleer transfeksiyon programı veya A 0 2 3 nükleer transfeksiyon programı kullanılarak gerçekleştirilen nükleer transfeksiyon sonrası besleyici hücreler üzerine ekilen ve oluşturulan RIV one insan IPC'lerinin bu görüntülerinde örneklendiği gibi, nükleer transfeksiyon yoluyla da elde edilebilir. B 0 1 6 programının kullanımı %80'e kadar EGFP pozitif hücre ile sonuçlanırken, A 0 2 3 programı %10'dan daha az EGFP pozitif hücre sağlamıştır. Ayrıca, trends genini eksprese eden transgenik insan iPSC'lerin stabil klonları türetilebilir.

Burada, Gene Juice'dan türetilmiş yaygın EGFP ekspresyonuna sahip, stabil EGFP eksprese eden insan iPSC kolonlarına bir örnek gösterilmektedir. Bu hücreler, embriyo gövde farklılaşması sırasında konstitütif EGFP ekspresyonunu sürdürürler. Bu videoyu izledikten sonra, insan iPS hücrelerinin nasıl nukleekt edildiği ve transfekte edildiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Verimli genetik manipülasyon, kök hücre biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için temel bir araçtır ve rejeneratif tıpta insan IPS hücre hatlarının kullanımını hızlandıracaktır.