İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Bu deneyin genel amacı, optimize edilmiş transfeksiyon ve nükleer sevgi protokollerini kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde yüksek transfeksiyon verimliliği elde etmektir. Bu, ilk olarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin besleyici serbest kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Transfeksiyon için, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler gece boyunca jelt, TRX veya matrigel üzerine yerleştirilir.

Nükleer sevgi için, tripsin ile küçük hücre kümeleri elde edilirken, kaplanmış hücrelere bir plazmit DNA ve gen suyu transfeksiyon reaktif karışımı eklenir ve daha sonra plaka döndürülür ve 37 santigrat derecede inkübe edilir. İnsan IPS hücre süspansiyonu, nükleerden etkilenen bir cihazda nükleerden etkilenir ve hücreler, metamfetamin şartlandırılmış, orta ve 37 santigrat derecede inkübe edilir. Sonuç olarak, insan IPS hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği yoluyla verimli genetik manipülasyon gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin daha önce açıklanan transfeksiyon, elektroporasyon ve nükleer affeksiyon yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, insan IPS hücrelerinde tutarlı sonuçlara sahip yüksek transfeksiyon verimliliğinin laboratuvarımızda rutin olarak elde edilebilmesidir. Protokollerimiz ayrıca genetik modifikasyonu takiben minimum hücre ölümü sağlar. Bu nedenle, protokollerimiz, transgenik insan IPS hücre hatlarının hızlı ve büyük ölçekli bir şekilde üretilmesine izin verir: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri besleyici serbest kültürlere uyarlamadan önce, jelt TRX kaplı tabaklar hazırlayın.

Daha sonra, daha önce besleyici hücrelerde oyuk başına bir mililitre Accutane'de tutulan insan IPC'lerine masaj yapın ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve çoğu hücre ayrılmaya başlayana kadar, hücrelere 10 ila 15 cam boncuk ekleyin ve plakayı hafifçe şişirin. Sonra iki mililitre nakavt D-M-E-M-F 12 ekleyin ve hafifçe tritrate edin. Hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 800 RPM'de döndürün. Supinatı aspire edin, insan IPSC peletini sağlam bırakın. Hücre peletini nazikçe dağıtmak için tüpü hafifçe vurun.

Reese, insan IPSC peletini uygun bir hacimde STEM pro ortamında askıya alın ve bir jel TRE kaplı plakanın kuyuları arasına dağıtın. Çoğalma hızına bağlı olarak, insan IPC'leri bir ila iki, bir ila altı arasında bir bölünme oranında geçirilebilir. Plakayı dikkatlice %5 karbondioksit, 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin kuyucuklar boyunca eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe döndürün.

Hücreleri günlük olarak besleyin. Hücreler %80 co akıcılığına ulaştığında, tekrar yeni bir jele geçmeye hazırdırlar. Bir ila iki hücrenin bölünme oranında iyi kaplanmış Rex, yaklaşık% 40 ila 50 birleşme olmalı ve optimum transfeksiyon verimliliği elde etmek için transfeksiyon gününde jel kaplı kuyu üzerine eşit olarak dağıtılan küçük koloniler halinde olmalıdır.

Bu işleme başlamak için, steril bir 1,5 mililitrelik eend orph tüpünde 100 mikrolitre nakavt ortamı hazırlayın. 27 mikrolitre gen suyu transfeksiyon reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, dört mikrogram plazmit DNA ekleyin.

Plazmid seçimi, optimum transfeksiyon verimliliği için kritik öneme sahiptir. Burada kullanılan plazmid, insan IPC'lerinde transkripsiyonel olarak aktif olan güçlü bir promotör olan bir CAG promotörü tarafından yönlendirilen gelişmiş bir yeşil floresan proteine sahiptir. Tüp oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

15 dakika sonra, gen suyunu, DNA karışımını hücrelere ekleyin ve plakayı şişirin. Transfeksiyon karışımının kuyudaki insan IPC'leri ile temasını artırmak için plakayı beş dakika boyunca 1.200 RPM'de döndürün. Hücreleri ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Nükleer sevgi gününde transfeksiyon verimliliğini izleyin, insan IPS CS'leri ön işleme tabi tutulurken, insan IPC'lerini en az bir saat boyunca 37 mikromolar kaya inhibitörü ile 10 mikromolar kaya inhibitörü ile ön işleme tabi tutun. Steril 1.5 mililitrelik eend orph tüpünde 82 mikrolitre insan kök hücre nükleer efektör çözeltisi hazırlayın. 80 mikrolitre ekleyin.

Birini destekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Çözeltiyi 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Savaş öncesi, önceden hazırlanmış besleyici hücre şartlandırılmış ortam ve EDTA'da kaputun altında 37 santigrat dereceye kadar %0,25 açma.

Bir steril 15 mililitrelik konik tüpü önceden etiketleyin. Nükleer etkilenecek ortamı insan IPSC kültüründen dikkatlice çıkarın ve hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve tripsin inkübe hücrelerini üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Başarılı bir çekirdek sevgisi için, hücreleri tek hücrelere tripsin yapmamak çok önemlidir. Bunun yerine, hücreler iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler halinde ezilmelidir. Hücreleri bir P 1000 pipet ucuyla iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler halinde nazikçe yeniden boyutlandırın.

Tüm insan IPC'lerinin tamamen ayrıldığından emin olmak için kuyunun dibini tekrar tekrar pipetleyerek yıkayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu etiketli 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, dokuz mililitre fare embriyonik fibroblast ortamı ekleyin.

Tripsini etkisiz hale getirmek için, hücreleri üç dakika boyunca 800 RPM'de döndürün. Hücre peletini bozulmadan bırakarak SUP natantını dikkatlice aspire edin. Hücreleri, savaş öncesi bir insan kök hücre nükleer efektör çözeltisi olan 100 mikrolitrede askıya alın.

Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak hücreleri bir nükleer efektör damara aktarın. Vete karışım hücrelerindeki hücre süspansiyonuna ve DNA'ya hafifçe döndürerek dört mikrogram plazma DNA'sı ekleyin. Vete'yi davlumbaz yüzeyine iki kez vurun.

Vete'yi nükleer efektör cihazının nükleer efektör tutucusuna yerleştirin. X düğmesine basarak B 0 1 6 nükleer etki hücrelerini seçin Tamam görüntülenecektir Nükleer sevgi süreci tamamlandığında, bu genellikle bir ila beş saniye sürer. Nükleer sevgi kitinde verilen plastik makarna pipetini kullanarak, nükleer etkilenen hücreleri Resus'un geri kazanım hücrelerinden geri alın, bunları 1.5 mililitrelik steril bir eend orph inkübe hücresinde 1.5 mililitrelik eend orph inkübe hücrelerinde 10 dakika boyunca ön ısıtma CM ve kaya inhibitörü içinde askıya alın.

10 dakika sonra, hücreleri besleyici katmanlarına damla damla aktarmak için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Hücreleri ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyon verimliliğini izleyin.

Burada, transfeksiyon plazmidinden 12 saat sonra jel Rex üzerinde gen suyu kullanılarak transfekte edilen RIV bir insan IPSC hücresini eksprese eden EGFP'nin fotoğraf mikrografları gösterilmektedir. İnsan IPC'lerinin DNA transfeksiyonu. Güçlü bir promotör ile gen suyunun kullanılması, tipik olarak, geçici bir transfeksiyon testinde EGFP raportör eksprese eden hücrelerin% 60'ından fazlasını verir.

EGFP eksprese eden hücreler, B 0 1 6 nükleer sevgi programı veya A 0 2 3 nükleer sevgi programı kullanılarak nükleer sevgiyi takiben besleyiciler üzerine kaplanan ve oluşturulan RIV bir insan IPC'sinin bu görüntülerinde gösterildiği gibi nükleer sevgi yoluyla da elde edilebilir. B 0 1 6 programının kullanılması, EGFP pozitif hücrelerin %80'ine kadar sonuçlanır, ancak A 0 2 3 programı, EEG FP pozitif hücrelerin %10'undan daha azını vermiştir. Ayrıca, eğilim genini ifade eden transgenik insan I PSC'lerinin kararlı klonları türetilebilir.

Gen suyundan türetilen her yerde bulunan EGFP ekspresyonu ile insan IPSC kolonilerini eksprese eden stabil EGFP'nin bir örneği burada gösterilmiştir. Bu hücreler, embriyo vücut farklılaşması sırasında yapısal EGFP ekspresyonunu korur. Bu videoyu izledikten sonra, insan IPS hücrelerinin nasıl çekirdek etkisi yapılacağı ve transfekte edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Etkili genetik manipülasyon, kök hücre biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için önemli bir araçtır ve rejeneratif tıpta insan IPS hücre hatlarının kullanımını hızlandıracaktır.