Name: Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri Drosophila Larva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin termal nosisepsiyon değerlendirme yöntemlerini Drosophila larvalarında yerel ve küresel uyarım teknikleri kullanarak. Bu davranışsal nörobilim protokolü duyusal işlemeyi incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının eleştirel okuma için ısı plakası tayini, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyeleri öneren larva ısı probu tayini, Sean Sweeney geliştirmek için ısı probu tasarımı, Daniel Babcock için Hıristiyan Landry teşekkür ederim. Bu çalışma MJG ve araştırma kariyerleri (AVG) azınlık erişim için bir NIH MARC U-STAR Eğitim Grant (Houston-Downtown Alimler Akademisi Üniversitesi T34GM079088) ile NIH R01 NS069828 tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan deneyleri kalitatif ve kantitatif olarak zararlı termal uyaranlara yanıt için farklı genotipleri larvaları değerlendirmek için kullanılabilir. Isı prob assay of bir ana özelliği uyaran yalnızca tek bir loküsündeki verilir olmasıdır. Bu, muhtemelen belki de sadece küçük bir prob ile iletişim segmentinde sınıf IV nöronlar-olanlar alt ve hemen komşu segment 11 bulunanların ateş neden olur. Çünkü yerel stimülasyon, ısı probu test bölgeye böyle bir sıcak soba başvurmadan bir el gibi belirli bir vücut için lokalize bir zararlı uyaran tespit ortak duyusal deneyimi taklit eder. I)) kullanıcı larva için prob uygulandığı ile basınç, ii prob hassas konum: ısı probu testin dezavantajı ise muhtemelen şu üç faktörden kaynaklanıyor olabilir bazı kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır altta yatan nosiseptif nöronlar, ve, iii) hassas ang göre larva onle hangi prob temas larva yüzeyinde. Biz daha önce verilen bir sıcaklıkta 1 olarak çekmede gecikme dayalı cevaps, yavaş yanıt ve hızlı yanıt kategorize larvalarının nicel bir strateji bildirdi. Burada da yüksek sıcaklıklarda larva yanıt rapor. İlginçtir, biz larva termal nosiseptif yanıtları için bir tavan olduğunu bulmak ve bu tavan 52 ve 54 arasında yattığını ° C Bu geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) 52 daha yüksek sıcaklıklarda yolluk yeteneğine kanal ° C&#39;ye sahip olmadığı larva gösterebilir Alternatif olarak, kullanılan nöronlar veya kasları başlatmak veya onlar bile caydırıcı yoksunluk içinde çalışabilmesi için önce motor yanıt hasar yürütmek olduğunu hatırlatıyoruz. Ayrıca, geri çekme amplitüd cevabı farklı bir analizi kullanılarak-yanıt &quot;sağlamlığı&quot; göstergesi olarak rulo sayısını da sunulmaktadır. Saf, birBu parametrelerin stimülasyon artan sıcaklık veya zamanla artacağı beklenebilir. Hayret, biz bu durumda olmadığını bulmak. Larva zararlı aralığı (42 ° C) düşük sonunda bir sıcaklıkta uzun süre uyarılmış daha rulo göstermek ve daha fazla zaman larvaların yüksek sıcaklıklarda (48-52 ° C) probed daha haddeleme geçirdi. Bu zehirli sıcaklığında pencere içerisinde öncelikle amplitüd cevabı belirler maruz kalma süresi olduğunu göstermektedir. Larvaları son derece zararlı sıcaklıklara maruz beri (48-52 ° C) çok hızlı bir şekilde ortalama yanıt, onlar uzun bir süre boyunca daha az zararlı sıcaklığa maruz larva gibi birçok rulo şeklinde göstermezler. Burada bildirilen yanıt genlik analizi farklı genotipleri veya çevresel manipülasyonlar göre edilebileceği birlikte başka bir nicel boyut katıyor. Isı plakası testin bir diğer temel özelliği, zararlı bir küresel maruz içeriyor olmasıısı. Bunun gibi, bir sıcak soba dokunmadan daha ısıtma kazanı oturan hayvan daha yakındır. Bir larva bu küresel maruz davranışsal tepkileri, yerel stimülasyonu üzerine gözlenen bu daha karmaşık laboratuar, vahşi bir küresel zararlı uyaranın yaşayabilirsiniz zaman net olmamakla beraber. Ayrıca diğer 3 kaydetti ısı plakası testin bir gücü, larva dokunmadan protokolünün bir parçası değildir çünkü az kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır. Sadece önemli varyans her bir davranış başlar ve bu tekrarlanan görüş / aşinalık ile minimize edilebilir tanımlarken gibi görünüyor. Testleri arasında ilginç bir farklılık caydırıcı davranışlar başlaması hangi sıcaklıkları. Bu ısı probu ile daha ısı plakası tayininde daha düşüktür. Isı probu (baş ve kuyruk yükseltme) ile temas larva tarafından sergilenen davranış, bir ön ° C ısı plat yılında ~ 27 gözlenen baş thrash bağlılaşığı olabilire testi. Bu yanıt &quot;acı&quot; daha &quot;rahatsızlık&quot; yansıtıyor olması mümkündür. Biz bile yüksek de, nöbet kırbaçlanan bağlılaşığı ve felç gözlenen değil (en fazla 48 ° C) ısı probu test sıcaklıkları ve vücudun birden fazla bölgeden ateş duyu nöron kritik bir kütle olduğunu olabilir Bu davranışları getirmek gerekiyordu. Küresel stimülasyon yerel davranışı tetiklemek için yeterli değildir nöronal yanıtlar toplanarak içerebilir gösteren ısı probu ile gözlenen nosiseptif eşik alt ucunun altına - İlginçtir, nöbet ve felç davranışları sıcaklıklarda (37 ° C ~ 34) gözlemlenmiştir ısı probu uygulaması. Bu sıcaklıklarda aslında larvaları için zararlı olarak algılanan bu çoğu durumda değilsiniz felç davranışı başlar ve daha sonra sinek gıda kurtarmak için izin verilen larvaları (Şekil 5C) hayatta olduğu gözlem tarafından desteklenmektedir. Ayrıca argümanı destekleyen bu ısı plyedik tahlil nosiseptif tepkiler okuyor bilinen nosiseptif duyu nöronlar sinaptik iletimi bloke gözlemlenen davranışları (Şekil 6) çoğunun gecikme artırdığı bir gerçektir. Yüksek sıcaklık kırbaçlanan davranış için gecikme hiçbir artış olmadığını gözlem md-gal4 ifade değil diğer duyusal nöronları bu davranışı için gerekli olabileceğini düşündürmektedir. Küresel tayininde hızlı ısıtma suyu bir damla yerel tahlil ve daldırma küçük bir metal prob tüyosu - Özetle, her iki çalışma tanımlanan sıcaklık bir zararlı termal uyarana bireyin larva açığa içerir. Genetik geçmişleri ve / veya değişen çevre koşulları (örneğin artı ya da eksi doku hasarı için) değişen maruz kalan Drosophila larva davranışsal tepkiler, okudu ve bu testler kullanılarak ölçülebilir. Sonuçta, bu testlerin sonuçlarının daha iyi noc kontrol genetik ağları anlamanıza yardımcı olacaktırDrosophila ve ilgili diğer türler iception.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Termal Sensör </td><td> Pro-Dev Mühendislik </td><td> İsteğe bağlı Özel-inşa </td><td> İletişim bilgileri istek üzerine temin edilebilir </td></tr><tr><td> Kuru Banyo İnkübatör </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 katı ısıtma bloğu ve 16mm kuyuları ile 1 ısıtma bloğu </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Renkli kamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Herhangi bir denk kamera yapacağız. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ6 zoom vücut için Parça numarası (optik taşıyıcı) 10.445.614 olduğu </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Ünitesi </td><td> Schott North America, Inc </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Çift Gooseneck 23 inç Fiber Optik Işık Kılavuzu </td><td> Schott North America, Inc </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Isı Kontrol Ünitesi </td><td> TSCI corp. </td><td> Özel Yapım </td><td> Detaylar istek üzerine temin edilebilir </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000 mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Herhangi bir denk mikroskopyapacağız. </td></tr><tr><td> Forseps </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm örgü </td><td> Genesee Bilimsel </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Boya fırçası </td><td> Dick Blick Sanat Malzemeleri </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV çaprazbaglayıcı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Kavanozlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml beher </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Dietil eter </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm Polistren Petri Dish </td><td> Şahin </td><td> 351008 </td><td> Biz test değil alternatif yemekler. </td></tr><tr><td> Cam Mikroskop Slayt </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termokupl </td><td> Omega Engineering, Inc </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Vinil Piece of </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüp </td><td> Denville BilimselA.Ş. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

termal nosisepsiyon değerlendirilmesi yerel ve küresel yöntemleri<em&gt; drosophila</em&gt; larva

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Bu yazıda, Drosophila larva termal nosisepsiyon okumak için testler göstermektedir. Ikinci en toptan (global) aktivasyonu veya bütün bu nöronlar 3 içerirken Bir tahlil termal nosiseptörleri 1,2 (yerel) mekansal kısıtlı stimülasyon içerir. Birlikte, bu teknikler Drosophila nosiseptif duyu nöronlarının davranışsal işlevlerin görüntülenmesi ve ölçümü sağlar. Drosophila larva termal nosisepsiyon, evrimsel türler 1,2 arasında korunur zararlı sıcaklıklara duyusal yanıt çalışmak için kurulmuş bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmaların Drosophila avantajları düzelen, tüm metazoans olduğu gibi, bu sinir sisteminin göreceli olarak basit ve Drosophila yatan biyolojisi 4-6 moleküler temeli incelemek için kullanılabilir genetik teknikler sofistike olanzehirli termal uyarılara e genellikle sunulan uyaran 7 için bir &quot;nocifensive&quot; itici çekilmesi içerir. Bu tür uyaranlar serbest sinir uçları veya nosiseptörleri aracılığı ile algılanır ve organizma yanıt genlik zararlı uyaranın 8 alma nosiseptörlerin sayısına bağlıdır edilir. Drosophila, bu fotoreseptör 10 olarak yeni keşfedilen rolüne ek olarak zararlı termal ve mekanik uyarıcılar 9 algılamak sınıf IV dendritik arborization duyusal nöronlar. Çok iyi gelişim düzeyinde incelenmiştir bu nöronlar, epidermal bariyer tabaka üzerine arborize ve 11,12 neredeyse tüm epidermal hücreler ile temas edin. Bu ikinci derece nöronlar bağlanabilir merkezi sinir sistemi 11 ventral sinir kordonu içine her sınıf IV nöron projelerin tek akson bu beyin projesi. Bazal koşullar altında, nosiseptif duyu nöronispeten yüksek bir eşik ulaşılana kadar ns yanmaz. Burada anlatılan testler araştırmacı temel davranışsal tepkileri ya da, muhtemelen, aşağıdaki doku hasarı gelişir sensitizasyon. Ölçmek için izin Her test zararlı termal uyaranlara farklı ama ilişkili lokomotor davranışsal tepkileri kışkırtır ve Drosophila larva termal nosisepsiyon çeşitli yönleriyle görselleştirmek ve ölçmek için araştırmacı izin verir. Testler istenilen genotiplerinin larva veya nosisepsiyon etkileyebilecek farklı çevresel koşullar altında büyüdü larva uygulanabilir. Termal nosisepsiyon türler arasında korunmuş olduğundan, Drosophila da genetik ayrımında toplanan bulgular olasılıkla omurgalılar dahil, diğer türlerde de termal nosisepsiyon anlayışımızı bilgilendirecektir.

Bu yazıda, tayinlerde termal nosisepsiyon çalışma göstermek<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva. Bir test termal nosiseptörleri (yerel) mekansal kısıtlı stimülasyonu gerektirir<sup&gt; 1,2</sup&gt; Ise ikinci en toptan (global) aktivasyonu veya bütün bu nöronlar içerir<sup&gt; 3</sup&gt;. Hep birlikte, bu tekniklerin davranışsal işlevlerin görselleştirme ve miktar izin<em&gt; Drosophila</em&gt; Nosiseptif duyu nöronlarının.

Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Bu makalede, Drosophila larvalarında termal nosisepsiyonu incelemek için kullanılan analiz yöntemlerini gösteriyoruz. Analizlerden biri, ...'nın mekansal olarak kısıtlanmış (lokal) stimülasyonunu içermektedir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila larvalarında termal nosisepsiyonu analiz etmektir. Bu işlem, drosophila larvalarının toplandığı ve ardından isteğe bağlı ikinci bir adım olarak zararlı termal uyarılara maruz bırakıldığı yöntemle gerçekleştirilir. Larvalara, doku hasarına ve termal nosiseptif duyarlılaşmaya neden olan UV ışınlaması uygulanabilir. Sonrasında, nicel olarak ölçülebilen nosiseptif yanıtları tetiklemek amacıyla larva, bir ısı probu ile lokal olarak veya bir ısı plakası kullanılarak global olarak sorgulanabilir.Isı probu, larvaların ısıya karşı verdikleri nosiseptif tepkinin bir üst sınırı olduğunu ve girdi sıcaklığı ile tetiklenen tepkinin genliği arasında şaşırtıcı bir ilişki bulunduğunu göstermektedir. Isı plakası deneyi, larvaların çevredeki suyun sıcaklığına ve nosiseptif duyusal nöronların aktivitesine bağlı olarak stereotipik bir nosiseptif davranış dizisi sergilediğini göstermektedir. Burada açıklanan yöntemler, hayvanların lokal veya global olarak sunulan zararlı termal stimuluslara farklı tepki verip vermedikleri gibi, termal nosisepsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Genel olarak, ısı probu deneyiyle yeni tanışan bireyler; uygulanan probun basıncındaki, konumundaki ve iletim açısındaki varyasyonları minimize etmek için pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayacaklardır. Isı plakası deneyinin görselle gösterilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü artan sıcaklıkla ortaya çıkan davranışların en iyi şekilde anlaşılması için görülmesi gerekir. İlgilenilen tanımlı bir genotipten yeterli sayıda yavru larva elde etmek için, istenen stokları doğrudan büyütün veya yumurtlama gününden beş gün sonra, 20 ila 30 bakire dişi ve 15 ila 20 erkek kullanarak sinek besiyeri içeren şişelerde çaprazlamalar kurun; yumuşak sinek besiyerini kepçeyle çıkarıp 630 mikron gözenek boyutuna sahip bir elekten nazikçe akan suyla süzerek erken üçüncü instarda bulunan larvaları toplayın ve temizleyin; açlığı ve kurumayı önlemek için erken üçüncü instar larvaları küçük, nemli bir besiyeri pedine aktarın.Bir anestezi odası oluşturduktan sonra, bir pens veya boya fırçası kullanarak 10 adet erken üçüncü instar larvayı nazikçe kapağın iç kısmına yerleştirin ve kapatın. Bir çeker ocak içinde, anestezi odasını, içinde 1,5 mililitre dietil eterle ıslatılmış bir pamuk topu taşıyan 10 mililitre kapasiteli bir beher bulunan bir bağlantı kavanozunun içine yerleştirin. Larvaları iki ila 2,5 dakika boyunca eter buharlarına maruz bırakmak için bağlantı kavanozunun kapağını vidalayarak kapatın.Anestezinin ardından, anestezi odasını Coplan kavanozundan çıkarın ve kalıntı eter buharlarının dağılması için çeker ocak altında birkaç saniye bekletin. Larvaları anestezi odasından küçük bir Petri kabına nazikçe aktarmak için bir su püskürtme şişesi kullanın. Anestezize edilmiş larvaları kurutmak için tampon yapın ve ardından onları, üç inç çarpı bir inç boyutundaki cam mikroskop lamına sabitlenmiş çift taraflı şeffaf bant şeridine sırtları yukarı bakacak şekilde nazikçe yerleştirin.Lamı bir UV ışınlama haznesinin alt yüzeyine yerleştirin ve larvaları 20 millijoules per centimeter squared yoğunluktaki UV ışığına altı saniye boyunca maruz bırakın. Işınlamadan sonra, larvaların çift taraflı yapışkan banttan nazikçe ayrılıp yüzeye çıkmalarını sağlamak için lamı suya daldırın. Işınlanmış larvaları 15 by 45 millimeter boyutundaki bir kaba nazikçe yerleştirmek için pens veya resim fırçası kullanın.Yeniden konaklandırmadan önce, 25 °C veya istenen kültür sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca dinlendirmek üzere bir mililitre sinek besini içeren bir dramlık cam kültür şişesi. Termal nosisepsiyon deneyleri için öncelikle termal probun sıcaklığını istenen ayar noktasına getirin. Bir adet larvayı nazikçe düz bir platforma aktarmak için bir resim fırçası veya pens kullanın ve larvanın ince bir su tabakasıyla kaplandığından emin olun.Basınçtaki varyasyonu minimize etmek ve ısı probunun doğru konum ve açısını sağlamak için pratik yapmak önemlidir. Prob ucunu, prob ile larva yüzeyi arasında yaklaşık 45 derecelik bir açı oluşturacak şekilde, hafif bir basınçla larva A4 segmentine nazikçe bastırın. Uygulanan basınç, larva yüzeyinde hafif bir çöküntüye neden olmalı ve genellikle lokomosyonu engellemek için yeterli olacaktır.Larvalar bir geri çekilme yanıtı sergileyene veya 22. kesinti noktasına ulaşana kadar stimülasyona devam edin. Yanıt veren larvalar tipik olarak önce baş ve kuyruğu kaldırma şeklinde öncül bir davranış gösterir, bunu en az 360 derece yuvarlanma şeklindeki geri çekilme davranışı takip eder. Geri çekilme davranışı başladığında, prob ile teması kesin ve geri çekilme süresini veya gecikme süresini kaydedin.20 saniye içerisinde herhangi bir geri çekilme davranışı gözlemlenmezse, larva yanıt vermeyen (non-responder) olarak kabul edilir. Yeterli yüksek kontrastlı aydınlatma sağlandığından emin olmak için fiber optik ışık kılavuzlarını konumlandırın. Larvaları görüntülemek için, ısıtma bloğunu düz yüzeyi yukarı gelecek şekilde ısıtma tablasına yerleştirin ve ardından ısıtma tablasını mikroskop tabanının üzerine koyun.Isıtıcı plakayı yüksek ayara getirin ve sıcaklığın 95 degrees Celsius derecede stabilize olması için yaklaşık 15 dakika bekleyin. Bir mikropipet kullanarak 80 µL distile su ölçün ve su damlasını 60 by 15 mm'lik polistiren bir Petri kabının ortasına yerleştirin. Temiz bir orta üçüncü dönem larvayı, mümkün olduğunca az ek su girişi sağlayarak, forseps yardımıyla nazikçe su damlasının ortasına yerleştirin.Petri kabını ısıtıcı plaka üzerindeki katı ısıtma bloğuna nazikçe yerleştirin. Larvaların tamamı ve su damlası görünür olacak şekilde kabın konumunu hızlıca ayarlayın. Zamanlayıcıyı başlatın.Şu anda Petri kabı, ısıtıcı plakanın katı ısıtma bloğunun üzerine yerleştirilir ve her bir davranışın başlangıç zamanı kaydedilir. Beş. Suya daldırılmış larvanın ısıtıcı plakaya aktarılması üzerine stereotipik lokomotor davranışlar gözlemlenir. Isının yokluğundaki normal davranış, arama amaçlı baş hareketlerinin eşlik ettiği şemsiye tipi lokomosyonu içerir.Sıradaki aşamada, larvanın başını hızlı bir şekilde ileriye veya yanlara doğru hareket ettirdiği kafa sallama davranışı görülebilir. Bu hareket, sudaki normal lokomosyonlarına benzer own ancak daha sarsıntılı ve sürekli bir yuvarlanma şeklinde gerçekleşir. Davranış, larvalar yanlamasına en az tam 360 derece yuvarlandığında gerçekleşmiş sayılır.Bu durum değişken sayıda gerçekleşebilir ve bazen tamamlanmamış yuvarlanmaları da içerir. Davranışın puanlanması amacıyla yalnızca tam 360 derecelik yuvarlanmaları sayın. Bu davranış, kırbaç davranışı sırasında ısı probunun lokal uygulamasıyla karşılaşılan sahneye en benzer olanıdır.Larva, başın çok kısa bir süreliğine kuyruğa yaklaştığı, anteroposterior eksen boyunca hızlı kasılma-gevşeme hareketleri sergiler. Kamçılama hareketi genellikle hızlı bir ardışıklıkla veya yuvarlanma ile eş zamanlı olarak gözlemlenir. Son olarak larva, genellikle felci takip eden nöbet benzeri davranışlar sergiler. Nöbet davranışı sırasında larva, anteroposterior eksen boyunca uzanır ve tüm vücutla yüksek frekanslı titremeler sergiler.Larvaların hareketinin durmasıyla birlikte, bükülme felci olmaksızın titreme davranışı görülür. Bazı larvalarda bu durum kalıcıyken, diğerleri daha sonra düşük frekanslı bir pulsasyon hareketi sergiler. Her bir kategoriye ait yanıt verenlerin yüzdesini gösteren bu grafikte, larval termal nosisepsiyon yanıtı için bir üst sınır bulunmaktadır. Isı probu deneyinde, 52 °C prob sıcaklığına kadar larvaların %100'ü hızlı yanıt verenlerdir.Buna karşın, 54 °C ve üzerindeki sıcaklıklarda, larvaların %90'ı veya daha fazlası 20 saniyelik temas süresinden sonra bile yanıt vermemektedir. Bu larvalar 22. kesme noktasından sonra hareket etmeye devam etseler de, yuvarlanma sayısı veya kaçınma geri çekilme davranışı için harcanan süre de ölçülebilir ve grafiğe dökülebilir. Şaşırtıcı bir şekilde, prob giriş sıcaklığı ile yanıtın gücü arasında ters bir ilişki olduğu görülmektedir; zira daha düşük sıcaklıkların daha yüksek sayıda yuvarlanmayı tetiklediği görülmektedir.Suya batırılmış larvanın ısıtma plakasına aktarılması üzerine beş stereotipik lokomotor davranış gözlemlenir. Bu davranışların gözlemlendiği ortalama gecikme süreleri ve burada sunulan optimal analiz koşulları altında her bir gecikme süresi için ölçülen ortalama su damlası sıcaklıkları burada gösterilmiştir; her bir belirgin davranışı sergileyen larvaların yüzdesi %77 ile %100 arasında değişmektedir, ancak zaman zaman yuvarlanma ve kamçılamı davranışları atlanabilir, üst üste binebilir veya ters sırada gerçekleşebilir; ısıtma plakası analizinde paralizi davranışının başlamasını takiben hayatta kalan larvaların yüzdesi burada gösterilmiştir. Larvalar paralizi gerçekleşene kadar ısıtılmış ve ardından toparlanmaları için standart kültür koşullarına geri alınmıştır.Kontrol grubu larvalar, ısıya maruz kalma hariç eşdeğer işlem görmüş olup, canlı yetişkinlerde PPE oluşumu yedinci ve on üçüncü günler arasında kantitatif olarak belirlenmiştir. Burada, MD G four, dört multidendritik periferik duyusal nöron sınıfının tamamında UAS tarafından düzenlenen transgenlerin ekspresyonunu tetikler. UAS orrc 1 delta C, sinaptik iletim için gerekli olan drosophila açık doğrultucu potasyum kanalının modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese ederken, UAS orrc 1 delta NC ise aynı kanalın sinaptik iletime müdahale etmeyen daha fazla modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese eder.Sadece hem MD GALF four sürücüsüne hem de UAS ORC one delta C transgenine sahip larvaların, gözlemlenen beş davranıştan dördünde artmış gecikme süreleri gösterdiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, GEs offal larvalarının zararlı termal uyarılara karşı hem lokal hem de global yanıtlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürler, termal nosisepsiyon için gerekli genleri belirlemek amacıyla genetik analiz gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir. Isı probu deneyini uygularken; varyasyonu, probun uyguladığı basıncı, konumunu ve temas açısını minimize etmeyi hatırlamak önemlidir.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, biz, sıçan ya da fare nocifensive davranışı göstermek olduğu en düşük sıcaklık belirlemek için hızlı, güvenilir ve basit bir prosedür...

Diyabetik Sıçanlarda Termal Nosiseptif Eşik Hızlı Belirlenmesinde

&gt;Drosophila larvaları, potansiyel olarak zararlı termal uyaranlara tepkileri hayvanda caydırıcı veya "nosifensif" olarak adlandırılan davranışları tetikleyen özel duyusal nöronlara (nosiseptörler) sahiptir. Bu video, bir ısı probunun kütikül üzerine lokal olarak uygulanmasına yanıt olarak larva davranışını kaydederek termal nosisepsiyonunu değerlendirmek için bir yöntemi açıklar. Bu nedenle bu yönteme yerel ısı probu tahlili denir.

Lokal Isı Probu Deneyi: Drosophila Larvalarında Yüksek Sıcaklıkların Nosisepsiyonunu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada, Drosophila larva sürekli termal degrade kullanarak tercih edilen ortam sıcaklığında belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.

Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Burada zaman ve mekan içinde hızlı ve hassas sıcaklık değişiklikleri üretir programlanabilir bir ısı kontrollü arena kullanarak sıcaklık değiştirme Drosophila lokomotor performansını otomatik olarak belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.

Drosophila sıcaklık değişiklikler uzay ve zaman içinde performansını belirlemek için otomatik yöntemi

Termal sınırlar organizmaların tolere ettiği ortamları tahmin edebilir, ki bu da hızlı iklim değişikliği karşısında değerli bilgilerdir. Burada açıklanan böceklerde kritik termal minima ve ısı nakavt süresini değerlendirmek için yüksek iş gücü protokolleri vardır. Her iki protokol de iş hacmini en üst düzeye çıkarır ve tahlillerin maliyetini en aza indirir.

Böceklerde Kritik Termal Limitlerin Yüksek İş Gücü Tahlilleri

Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Bebekler sözlü deneyimlerini rapor çünkü bebeklerde ağrının değerlendirilmesi ve tedavisi zordur. Bu video kantitatif elektrofizyolojik bebeğin sinir sistemi zararlı olaylara tepki ölçmek için kullanılan yöntem ve analiz teknikleri açıklar.

Elektrofizyolojik Ölçümler ve İnsan Bebeklerde nosisepsiyon Analizi

Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Öğrenin termal nosisepsiyon değerlendirme yöntemlerini Drosophila larvalarında yerel ve küresel uyarım teknikleri kullanarak. Bu davranışsal nörobilim protokolü duyusal işlemeyi incelemeye yardımcı olur.

Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri

Daha fazla video keşfet