Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri Drosophila Larva

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila larvalarında termal nosisepsiyon tahlili yapmaktır. Bu, drosophila larvalarının daha sonra onları zararlı termal uyaranlara maruz bırakmak için hasat edilmesiyle elde edilir, çünkü isteğe bağlı ikinci adım Larvalar UV ışınlanabilir, bu da doku hasarına ve termal nosiseptif duyarlılığa neden olur. Daha sonraki larvalar, kantitatif olarak ölçülebilen nosiseptif tepkileri prodüklemek için bir ısı probu ile lokal olarak veya bir ısı plakası kullanılarak küresel olarak incelenebilir.

Isı probu, larvaların ısıya karşı nosiseptif tepkiye karşı bir tavana sahip olduğunu ve giriş sıcaklığı ile provoke edilen yanıtın genliği arasında şaşırtıcı bir ilişkiye sahip olduğunu göstermektedir. Isı plakası testi, larvaların, çevredeki suyun sıcaklığına ve nosiseptif duyu nöronlarının aktivitesine bağlı olarak kalıplaşmış bir nosiseptif davranış dizisi sergilediğini göstermektedir. Burada açıklanan yöntemler, hayvanların yerel veya küresel olarak sunulan zararlı termal uyaranlara farklı tepki verip vermediği gibi termal nosisepsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, ısı probu tahlilinde yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü tahlilde ustalaşmak, uygulanan probun basıncı, konumu ve davranış açısındaki değişimi en aza indirmek için pratik gerektirir Isı plakası tahlilinin görsel gösterimi kritiktir. Artan sıcaklıkla ortaya çıkan davranışların en iyi şekilde takdir edildiğinin görülmesi gerektiğinden. Tanımlanmış bir genotipe sahip yeterli döl larvalarını elde etmek için, yumurtlama hasadından beş gün sonra 20 ila 30 bakire dişi ve 15 ila 20 erkek kullanarak istenen stoğu doğrudan büyütün veya sinek yemi içeren şişelerde çaprazlar oluşturun ve lapa gibi sinek yemini çıkararak ve 630 mikron gözenek boyutunda bir ağdan hafifçe akan su ile süzerek erken üçüncü instar larvalarını temizleyin. Açlık ve kurumayı önlemek için küçük, nemli bir yiyecek pedi.

Bir yetkilendirme odası oluşturduktan sonra, forseps veya bir boya fırçası kullanarak 10 erken üçüncü instar larvasını kapağın iç kısmına nazikçe yerleştirin ve kapatın. Bir çeker ocakta çalışarak, yetkilendirme odasını 1,5 mililitre dathyl eter ile ıslatılmış bir pamuk topu taşıyan 10 mililitrelik bir beher içeren bir bağlantı kavanozunun içine yerleştirin. Larvaları iki ila 2,5 dakika boyunca eter dumanına maruz bırakmak için coplan kavanozunun kapağını vidalayın.

E yetkilendirmesinin ardından, e yetkilendirme odasını Coplan kavanozundan çıkarın ve kalan eter dumanlarının dağılması için davlumbazda birkaç saniye bekleyin. Larvaları yetkilendirme odasından küçük bir Petri kabına nazikçe durulamak için bir su fışkırtma şişesi kullanın. Anestezi uygulanmış larvaları kurulayın ve ardından sırt tarafları yukarı bakacak şekilde çift taraflı bir bant şeridi üzerine hafifçe yapıştırın, üç inç'e bir inçlik cam mikroskop lamına sabitleyin.

Slaytı bir UV ışınlama odasının alt yüzeyine yerleştirin ve larvaları santimetre kare yoğunlukta 20 milijoule ile altı saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Işınlamadan sonra, larvaları çift taraflı banttan nazikçe yüzdürmek için slaytı suya batırın. Işınlanmış larvaları 15 x 45 milimetreye nazikçe yerleştirmek için forseps veya boya fırçası kullanın.

Yeniden barındırmadan önce 25 santigrat derecede veya istenen kültür sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca geri kazanmak için bir mililitre sinek yemi içeren bir dram cam kültür şişesi. Termal nosisepsiyon tahlilleri için, önce termal probun sıcaklığını istenen ayar noktasına önceden ayarlayın. Tek bir larvayı düz bir platforma nazikçe aktarmak için bir boya fırçası veya forseps kullanın ve larvaların ince bir su tabakası ile kaplandığından emin olun.

Basınçtaki değişimi en aza indirmenin yanı sıra ısı probunun doğru konumunu ve açısını sağlamak için uygulama mükemmelleştirir. Prob ucunu A dörtlü segmentteki larvalara doğru hafifçe bastırın, uç ile prob ile larvaların yüzeyi arasında yaklaşık 45 derecelik bir açıyla hafif bir basınç uygulayın. Basınç, larvaların yüzeyinde hafif bir girintiye neden olmalı ve genellikle hareketi önlemek için yeterli olacaktır.

Bir geri çekilme tepkisi gösterilene veya 22. kesime ulaşılana kadar larvaları uyarmaya devam edin. Yanıt veren larvalar tipik olarak önce baş ve kuyruğu kaldırma ön davranışı, ardından en az 360 derece yuvarlanma geri çekilme davranışı gösterir. Para çekme davranışı başlatıldığında, prob ile teması bırakın ve para çekme için geçen gecikmeyi veya süreyi kaydedin.

20 saniye içinde herhangi bir geri çekilme davranışı gözlenmezse, larvalar yanıt vermez. Yeterli yüksek kontrastlı aydınlatma olduğundan emin olmak için fiber optik ışık kılavuzlarını konumlandırın. Larvaları görüntülemek için, ısıtma bloğunu düz yüzeyi yukarı bakacak şekilde ısı plakasına yerleştirin ve ardından ısı plakasını mikroskop tabanına yerleştirin.

Isı plakasını yüksek ayara getirin ve sıcaklığın 15 santigrat derecede sabitlenmesi için yaklaşık 95 dakika bekleyin. 80 mikrolitre damıtılmış su ölçün ve su damlasını bir mikro pipetleyici ile 60 x 15 milimetrelik polistiren Petri kabının ortasına yerleştirin. Su damlasının ortasına temiz bir orta üçüncü instar larvalarını nazikçe yerleştirmek için forseps kullanın ve mümkün olduğunca az ek su verin.

Petri kabını yavaşça ısı plakası üzerindeki katı ısıtma bloğuna yerleştirin. Yemeğin yerini, tüm larvalar ve su damlası görünecek şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın. Zamanlayıcıyı başlatın.

Şu anda, Petri kabı ısı plakasının katı ısıtma bloğuna yerleştirilir ve her davranışın başlama zamanını kaydeder. Beş. Suya batırılmış larvaların ısı plakasına aktarılması üzerine kalıplaşmış lokomotif davranışları gözlenir. Isı yokluğunda normal davranış, arama kafası hareketlerinin eşlik ettiği şemsiye hareketini içerir.

Larvanın başını ileri veya yanal hareketlerle hızlı bir şekilde hareket ettirdiği yerde kafa çarpma davranışı ortaya çıkabilir. Bu hareket, sudaki normal hareketlerine benzer, ancak daha sarsıntılı ve ısrarlı bir şekilde yuvarlanarak gerçekleşir. Davranış, larvalar yanal olarak en az 360 derece yuvarlandığında ortaya çıkar.

Bu, değişken sayıda meydana gelebilir ve bazen eksik ruloları içerir. Davranışı puanlamak amacıyla yalnızca tam 360 derecelik ruloları sayın. Bu davranış, kırbaç davranışı sırasında ısı probunun yerel olarak uygulandığı sahneye en çok benzeyen davranıştır.

Larva, başı kuyruğa çok kısa bir süre yaklaştıran antio posterior eksen boyunca hızlı kasılma serbest bırakma hareketleri sergiler: Kırbaçlama genellikle hızlı bir şekilde art arda iki veya yuvarlanma ile aynı anda gözlenir. Son olarak, larva genellikle nöbet davranışı ve ardından felç gösterecektir. Nöbet davranışı sırasında, larva interop posterior eksen boyunca uzanır ve yüksek frekanslı bir tüm vücut sergiler.

Eğilme felci olmadan sallanma davranışı, larvaların hareketi durduğunda meydana gelir Bazı larvalarda bu kalıcıdır, diğerleri ise daha sonra düşük frekanslı bir titreşim hareketi sergiler. Her kategoriye ait yüzde yanıt verenlerin bu grafiğinde, larva termal nosisepsiyon yanıtının bir tavanı vardır. Isı probu tahlilinde, larvaların %100'ü 52 santigrat derece prob sıcaklığına kadar hızlı yanıt verir.

Bununla birlikte, 54 santigrat derece ve daha yüksek sıcaklıkta, larvaların %90'ı veya daha fazlası 20 saniyelik temastan sonra bile yanıt vermez. Bu larvalar 22. kesimden sonra hareket etmeye devam etseler de, kaçınma geri çekilme davranışında harcanan rulo sayısı veya zaman da ölçülebilir ve çizilebilir. Şaşırtıcı bir şekilde, prob giriş sıcaklığı ile yanıtın sağlamlığı arasında ters bir ilişki var gibi görünmektedir, çünkü daha düşük sıcaklıklar daha fazla sayıda ruloya neden oluyor gibi görünmektedir.

Suya batırılmış larvaların ısı plakasına aktarılması üzerine beş kalıplaşmış lokomotif davranışı gözlenir. Bu davranışların gözlemlendiği ortalama gecikmeler, burada sunulan optimal tahlil koşulları altında her bir gecikme için ölçülen ortalama su damlası sıcaklıkları gibi burada gösterilmiştir, her bir farklı davranışı gösteren larvaların yüzdesi %77 ila %100 arasında değişmiştir, ancak bazen yuvarlanma ve çırpma davranışları ihmal edilir, örtüşür veya ters sırada meydana gelir, Isı plakası testinde felç davranışının başlatılmasının ardından hayatta kalan larvaların yüzdesi burada gösterilmektedir. Larvalar felç olana kadar ısıtıldı ve daha sonra iyileşmek için standart kültür koşullarına çıkarıldı.

Sahte muamele edilen larvalar, ısıya maruz kalma dışında eşdeğer muamele gördü ve canlı yetişkinlerde KKD oluşumu yedi ila 13. günde kantitatifti. Burada, MD G dörtlü, çok dendritik periferik duyusal nöronların dört sınıfının hepsinde UAS tarafından düzenlenen transgenlerin ekspresyonunu yönlendirir. UAS veya bir delta C, sinaptik iletim için gerekli olan drosophila açık doğrultucu potasyum kanalının değiştirilmiş bir versiyonunu ifade eder ve UAS orrc bir delta NC, aynı kanalın sinaptik iletimi engellemeyen başka bir değiştirilmiş versiyonunu ifade eder.

Hem MD GALF dört sürücüyü hem de UAS ORC bir delta C transgenini taşıyan sadece larvaların, gözlemlenen beş davranıştan dördü için artmış latanslar gösterdiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, GE'lerin sakatat larvalarının zararlı termal uyaranlara karşı hem yerel hem de küresel tepkilerini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürler, termal nosisepsiyon için gerekli genleri belirlemek için genetik analiz gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir Isı probu tahlilini denerken, probun varyasyonunu ve basıncını, konumunu ve temas açısını en aza indirmeyi unutmamak önemlidir.