Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri Drosophila Larva

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila larvalarında termal nosisepsiyonu değerlendirmektir. Bu işlem, drosophila larvalarının toplanması ve ardından isteğe bağlı bir ikinci adım olarak zararlı termalı uyarılara maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Larvalar, doku hasarına ve termal nosiseptif sensitizasyona neden olan UV ışınlamasına maruz bırakılabilir. Daha sonra, kantitatif olarak ölçülebilen nosiseptif yanıtlar uyandırmak amacıyla larvalar, bir ısı probu ile lokal olarak veya bir ısı plakası kullanılarak global olarak test edilebilir.

Isı probu, larvaların ısıya karşı nosiseptif yanıtta bir üst sınıra sahip olduğunu ve giriş sıcaklığı ile tetiklenen yanıtın genliği arasında şaşırtıcı bir ilişki olduğunu göstermektedir. Isı plakası deneyi, larvaların çevredeki suyun sıcaklığına ve nosiseptif duyusal nöronların aktivitesine bağlı olarak stereotipleşmiş bir dizi nosiseptif davranış sergilediğini ortaya koymaktadır. Burada açıklanan yöntemler, hayvanların yerel veya küresel olarak sunulan zararlı termal uyarılara farklı şekilde yanıt verip vermediği gibi termal nosisepsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Is probu testiyle yeni tanışan kişiler; uygulanan probun basıncındaki, konumundaki ve iletim açısındaki varyasyonları minimize etmek için pratik yapılması gerektiğinden genellikle zorluk yaşarlar. Isıtıcı plaka testinin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü artan sıcaklıkla ortaya çıkan davranışların en iyi şekilde anlaşılması için görülmeleri gerekir. İlgilenilen belirli bir genotipte yeterli sayıda yavru larva elde etmek için, istenen stokları doğrudan büyütün veya yumurtlamadan beş gün sonra, sinek yemi içeren şişelerde 20 ila 30 bakire dişi ve 15 ila 20 erkek kullanarak çaprazlamalar kurun; yumuşak sinek yemini kepçeyle çıkarıp 630 mikron gözenek boyutuna sahip bir süzgeçten hafifçe akan suyla geçirerek erken üçüncü instarda bulunan larvaları toplayın ve temizleyin; açlığı ve kurumayı önlemek için erken üçüncü instar larvaları küçük, nemli bir yem pedine aktarın.

Bir anestezi odası oluşturduktan sonra, 10 adet erken üçüncü instar larvayı bir pens veya boya fırçası kullanarak nazikçe kapağın iç kısmına yerleştirin ve kapatın. Çeker ocak altında çalışarak, anestezi odasını, içinde 1,5 mililitre dietil eterle ıslatılmış bir pamuk yumağı bulunan 10 mililitrelik bir beherin yerleştirildiği bir bağlantı kavanozuna yerleştirin. Larvaları iki ila 2,5 dakika boyunca eter buharına maruz bırakmak için bağlantı kavanozunun kapağını vidalayın.

Eterizasyon işleminden sonra, eterizasyon haznesini Coplan kavanozundan çıkarın ve kalıntı eter dumanlarının dağılması için çeker ocak altında birkaç saniye bekleyin. Larvaları eterizasyon haznesinden küçük bir Petri kabına nazikçe aktarmak için bir su püskürtme şişesi kullanın. Anestezi altındaki larvaları kurutmak için tamponlayın ve ardından onları, üç inç çarpı bir inç boyutundaki bir cam mikroskop lamına sabitlenmiş çift taraflı şeffaf bandın üzerine sırtları yukarı bakacak şekilde nazikçe yapıştırın.

Slaytı bir UV ışınlama odasının alt yüzeyine yerleştirin ve larvaları santimetrekare başına 20 milijoule yoğunlukta altı saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Işınlamadan sonra, larvaların çift taraflı scotch banttan nazikçe ayrılıp yüzmeye başlamaları için slaytı suya daldırın. Işınlanan larvaları 15 x 45 milimetrelik bir kaba nazikçe yerleştirmek için pens veya boya fırçası kullanın.

Yeniden konaklandırmadan önce 25 °C veya istenen kültür sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca dinlendirmek üzere, bir mililitre sinek besini içeren bir dramlık cam kültür şişesi. Termal nosisepsiyon analizleri için öncelikle termal probun sıcaklığını istenen ayar noktasına getirin. Bir resim fırçası veya pens kullanarak, larvaların ince bir su tabakasıyla kaplandığından emin olarak, tek bir larvayı nazikçe düz bir platforma aktarın.

Basınçtaki varyasyonu minimize etmek ve ısı probunun doğru konum ve açıda olduğundan emin olmak için pratik yapmak önemlidir. Prob ucunu, prob ile larva yüzeyi arasında yaklaşık 45 derecelik bir açı oluşturacak şekilde, hafif bir basınç uygulayarak larva A dört segmentine nazikçe bastırın. Uygulanan basınç, larva yüzeyinde hafif bir çöküntü oluşturmalı ve genellikle lokomosyonu önlemek için yeterli olacaktır.

Larvalarda bir geri çekilme tepkisi görülene veya 22. kesme noktasına ulaşılana kadar stimülasyona devam edin. Tepki veren larvalar tipik olarak önce baş ve kuyruğu kaldırma şeklinde öncül bir davranış sergiler, ardından en az 360 derece dönme şeklinde bir geri çekilme davranışı gösterir. Geri çekilme davranışı başladığında, prob ile teması kesin ve geri çekilme için geçen süreyi veya latans süresini kaydedin.

20 saniye içinde hiçbir geri çekilme davranışı gözlemlenmezse, larva yanıt vermeyen olarak kabul edilir. Yüksek kontrastlı aydınlatmanın yeterli olduğundan emin olmak için fiber optik ışık kılavuzlarını konumlandırın. Larvaları görüntülemek için, ısıtma bloğunu düz yüzeyi yukarı bakacak şekilde ısıtma plakasının içine yerleştirin ve ardından ısıtma plakasını mikroskop tabanına yerleştirin.

Isıtıcı plakayı yüksek ayara getirin ve sıcaklığın 95 °C'de stabilize olması için yaklaşık 15 dakika bekleyin. Bir mikro pipetle 80 µL distile su ölçün ve su damlasını 60 x 15 mm'lik polistiren bir Petri kabının ortasına yerleştirin. Temiz, üçüncü instar dönemindeki bir larvayı, mümkün olduğunca az ek su dahil ederek, pens yardımıyla nazikçe su damlasının ortasına yerleştirin.

Petri kabını ısıtıcı plaka üzerindeki katı ısıtma bloğuna nazikçe yerleştirin. Larvaların tamamının ve su damlasının görünür olduğundan emin olmak için kabın konumunu hızlıca ayarlayın. Zamanlayıcıyı başlatın.

Şu anda Petri kabı, ısıtıcı plakanın katı ısıtma bloğunun üzerine yerleştirilir ve her davranışın başlangıç zamanı kaydedilir.Beş. Suya daldırılmış larvanın ısıtıcı plakaya aktarılması üzerine stereotipik lokomotor davranışlar gözlemlenir. Isı yokluğundaki normal davranış, arama amaçlı baş hareketlerinin eşlik ettiği parasol lokomosyonunu içerir.

Sırada, larvanın başını hızlıca ileriye veya yana doğru hareket ettirdiği kafa sallama davranışı görülebilir. Bu hareket, sudaki normal lokomosyonlarına benzer ancak daha sarsıntılı ve sürekli bir yuvarlanma şeklinde gerçekleşir. Davranış, larvalar yanlamasına en az tam bir 360 derece yuvarlandığında ortaya çıkar.

Bu durum değişken sayıda gerçekleşebilir ve bazen tamamlanmamış yuvarlanmaları içerebilir. Davranışın skorlanması amacıyla yalnızca tam 360 derecelik yuvarlanmaları sayın. Bu davranış, kırbaçlama davranışı sırasında ısı probunun lokal uygulamasının yapıldığı sahneye en benzer olanıdır.

Larva, başı çok kısa süreliğine kuyruğa yaklaştıran, antero-posterior eksen boyunca hızlı kontraksiyon-gevşeme hareketleri sergiler. Kamçılaşma hareketi sıklıkla hızlı ardışık olarak veya yuvarlanma ile aynı anda gözlemlenir. Son olarak, larva genellikle paraliz ile takip edilen nöbet davranışı sergiler. Nöbet davranışı sırasında larva, antero-posterior eksen boyunca uzanır ve yüksek frekanslı tüm vücut titremeleri sergiler.

Larvalar hareketi kestiğinde, bükülme felci olmaksızın titreme davranışı görülür. Bazı larvalarda bu durum kalıcıyken, diğerleri daha sonra düşük frekanslı bir pulsasyon hareketi sergiler. Her bir kategoriye ait yanıt verenlerin yüzdesini gösteren bu grafikte, larval termal nosisepsiyon yanıtının bir sınırı vardır. Isı probu deneyinde, larvaların %100'ü 52 °C prob sıcaklığına kadar hızlı yanıt verenlerdir.

Buna karşın, 54 °C ve üzerindeki sıcaklıklarda, larvaların %90'ı veya daha fazlası 20 saniyelik temastan sonra bile yanıt vermemektedir. Bu larvalar 22. kesme noktasından sonra hareket etmeye devam etseler de, yuvarlanma sayısı veya kaçınma geri çekilme davranışında geçirilen süre de ölçülebilir ve grafiğe dökülebilir. Şaşırtıcı bir şekilde, prob giriş sıcaklığı ile yanıtın sağlamlığı arasında ters bir ilişki olduğu görülmektedir; zira daha düşük sıcaklıklar daha yüksek sayıda yuvarlanmayı tetikliyor gibi görünmektedir.

Suya batırılmış larvanın ısıtma plakasına transferi üzerine beş stereotipik lokomotor davranış gözlemlenir. Bu davranışların gözlemlendiği ortalama gecikme süreleri ve burada sunulan optimal analiz koşulları altında her bir gecikme süresi için ölçülen ortalama su damlası sıcaklıkları burada gösterilmiştir; her bir belirgin davranışı sergileyen larvaların yüzdesi %77 ile %100 arasında değişmektedir, ancak bazen yuvarlanma ve kırbaçlama davranışları atlanabilir, örtüşebilir veya ters sırada gerçekleşebilir; ısıtma plakası analizinde paralizi davranışının başlamasının ardından hayatta kalan larvaların yüzdesi burada gösterilmiştir. Larvalar paralizi gerçekleşene kadar ısıtılmış ve ardından iyileşmeleri için standart kültür koşullarına geri alınmıştır.

Yanıltıcı (mock) işlem gören larvalar, ısı maruziyeti hariç eşdeğer işlem görmüştür ve canlı yetişkinlerde PPE oluşumu yedinci ile 13. günler arasında kantitatif olarak belirlenmiştir. Burada, MD G four, dört multi dendritik periferik duyusal nöron sınıfının tamamında UAS düzenlemeli transgenlerin ekspresyonunu yönlendirir. UAS or one delta C, sinaptik iletim için gerekli olan drosophila açık doğrultucu potasyum kanalının modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese ederken, UAS orrc one delta NC ise aynı kanalın sinaptik iletimi engellemeyen daha da modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese eder.

Yalnızca hem MD GALF dört sürücüsünü hem de UAS ORC bir delta C transgenini taşıyan larvaların, gözlemlenen beş davranışın dördünde artmış gecikmeler gösterdiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, GEs offal larvalarının zararlı termal uyarılara karşı hem yerel hem de küresel yanıtlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürler, termal nosisepsiyon için gerekli genleri belirlemek amacıyla genetik analiz gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir. Isı probu denemesini gerçekleştirirken, probun uyguladığı basınçtaki, konumundaki ve temas açısındaki varyasyonları minimize etmeyi hatırlamak önemlidir.