Name: Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin izole sıçan adacıklarında adenoviral vektörlerle gen ifadesi manipülasyonu kullanarak beta hücre kütlesi ve fonksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol diyabet tedavisi için sinyal yolaklarını belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH (PTF kadar) hibe DK078732 tarafından desteklenmiştir.

1. Sıçan Adacıklar ve adenoviral İletimi ve Kültürleme <ol><li> Gerekli sayıda ortam, 2 ml (8 mM glikoz,% 10 fetal bovin serumu, 50 ünite / ml penisilin ve 50 ug / ml streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı) ilave edilerek bir 6-sıra non-doku kültürü plakası kaplamalı hazırlamak kuyu. No-virüsü kontrolü için tek her biri, bir virüs kontrolü (örn., GFP-eksprese adenovirüs) ve deney grubu - Örneğin, tipik bir deneyde, üç kuyu gerektirebilir. </li><li> En azından 30 dakika için bir doku kültürü inkübatöründe yerleştirilerek 37 ° C ye ısınmasına plakası. </li><li> Hemen 6-sıra dışı doku kültürü kaplı plaka bireysel kuyulara sıçan adacık izolasyonu 18,19, yerde 100-200 adacıklar takip. Altmış adacıklar insülin salgılanması ve timidin dahil testleri için gereklidir. Kalan adacıklar gen ekspresyonu ya immunoblotting çalışmaları için protein izolasyon için RNA izolasyon için kullanılabilir. </li></ol> [Not: Bu noktadan itibaren, biyolojik tehlikeli malzeme taşıma, kullanma, ve bertaraf için kurumsal protokolleri takip edin.] <ol start="4"><li> Yavaşça girdap de merkezine adacıklar getirmek için plaka. </li><li> Doğrudan çanağı merkezinde adacıklar üzerine adenovirüs Pipeti. Enfeksiyon 100-500 çokluklar (İçişleri Bakanlığı, viral plak oluşturan birim için hedef hücrelerin oranı) kullanın. </li><li> 5 dk için adacıklar dinlenmeye bırakılır. </li><li> Doku kültürü inkübatöründe (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) in plaka yerleştirin. </li><li> 24 saat sonra yavaşça girdap kuyuların merkezlerine adacıklar getirmek ve iyi taze medya içeren yeni bir P200 mikropipet kullanarak adacıklar aktarmak için plaka. Adacıklar plakasına bağlı olursanız, onlar yavaşça pipet ucu ile yerinden edilebilir. </li></ol> [Not: Yeterli transdüksiyon Verim doğrulamak içinadacıklar sonra adacık çekirdek içine adenovirüs penetrasyon doğrulamak için konfokal mikroskopi yansıması gibi cy, bir kontrol virüs ifade GFP kullanılması yararlı olur.] <ol start="9"><li> Optimizasyon pilot çalışma gelen deney istenen zamanlama bağlı olarak ek 24-72 saat boyunca kültürün adacıklar,. Örneğin, bir çoğalma tepkisi indüksiyonu 24-72 arası bir şekilde H veya ilgi genindeki demonte 48 ya da 72 saat arasında değişen gerektirebilir kez gerektirebilir. Taze medya her gün adacıklar aktarın. </li><li> Deney, 1 içeren ortam içinde kültüre adacıklar nihai 24 saat süreyle μCi [metil-3 H] -thymidine/ml ortam (genellikle 1 ul timidin / ml ortamı). </li></ol> [Not: Bu noktadan itibaren, radyoaktif maddelerin taşınması, kullanımı ve bertaraf edilmesi için kurumsal protokolleri takip edin.] 2. İnsülin salgılanması Assay <ol><li> Hazırlayınsalgılanması deney tamponu (SAB) 10X stok çözeltisi (1.14 M NaCl, 47 mM KCI, 12 mM KH 2 PO 4, 11.6 mM MgSO 4) ve CaCI2 100X stok çözeltisi (0.25 M CaCI2). Bu stok çözümler önceden hazırlanan ve oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Taze olarak çalışan SAB (10X SAB, 1 M HEPES, 100X CaCI2 ve 0.5 ml,% 35 BSA, 0.11 g NaHCO 3 0.28 ml 1 ml, ve steril su ile 50 ml 5 mL) içinde 50 ml hazırlanması 50 ml tüp konik ve ılık 37 ° C 37 ° C su banyosunda koyarak. </li><li> Pipet 10 15 ml konik tüp içine çalışma SAB ml ve yüksek glukoz (16.7 mM) SAB hazırlamak için 2.5 M D-glikoz 66.8 ul ekleyin. </li><li> Düşük glukoz (2.8 mM) SAB hazırlamak için çalışma SAB kalan 40 ml 2.5 M D-glikoz 44.8 ul ekleyin. </li><li> Etiket üç 1.7 ml mikrosantrifüj 6-kuyulu plakanın her bir kuyucuk için tüpler ve fosfat-tamponlu salin (PBS) 1 ml ilave edilir. </li></ol&gt; [Not: adacıklar radyoaktif olduğundan, radyoaktif maddelerin taşınması, kullanımı ve bertaraf edilmesi için kurumsal protokolleri takip edin.] <ol start="6"><li> Her mikrosantrifüj tüpüne 20 adacıktan yerleştirin. Her mikrosantrifüj tüpüne karşılaştırılabilir büyüklükte adacıklar eklemek için her türlü girişimi olun. Örneğin, her bir tüp 5 küçük, 10 orta ve 5 büyük ölçekli adacıklar (bakınız Şekil 1) ihtiva edebilir. </li></ol> [Not: Islets bir diseksiyon stereoskop veya standart bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.] <ol start="7"><li> Adacıklar ağırlık (~ 2 dk) göre tüp alt yapıldıktan sonra, mikropipet ile PBS aspire ve atılır. </li></ol> [Not: yerçekimi ile çökeltme alternatif olarak, boru 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje tabi olabilir.] <ol start="8"><li> Ön kuluçka için, düşük Glu 400 ul ilavecose SAB, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C&#39;de,% 5 CO2), ve 60 dakika boyunca ön-kuluçkaya yatmaktadır içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirin. Ön inkübasyon düşük glikoz SAB ve atın aspire. </li><li> Temel insülin salgılanmasını için, düşük glikoz SAB 400 ul ilave, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirmek, ve 60 dakika süreyle inkübe edilir. Düşük glukoz SAB toplayın ve insülin radioimmunoassay için kaydetmek. </li><li> Uyarılmış insülin salgılanmasını için, yüksek glikoz SAB 400 ul ilave, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirmek, ve 60 dakika süreyle inkübe edilir. Yüksek glukoz SAB toplayın ve insülin radioimmunoassay için kaydetmek. </li></ol> 3. Timidin Ortaklığın Assay <ol><li> 1 ml PBS Add; adacıklar yerçekimi tarafından borusunun alt yapıldıktan sonra, mikropipet ile PBS aspire atmak ve bu, tekrarbir kez adım. </li><li> 500 ul buz gibi soğuk trikloroasetik asit (TCA,% 10 w / v) eklenir ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 3 dakika ° C için 16 000 xg&#39;de tüpler santrifüje </li><li> TCA aspire, 0.3 N NaOH ile 80 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Bu süre esnasında, 5-10 s boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks numuneleri, her 10 dak. </li><li> 7 ml sıvı sintilasyon sayım tüplerine Econo-güvenli sayma kokteyli 4 ml ekleyin. </li><li> Sintilasyon sayacı tüpüne numunenin 50 ul ekleme, tüp kap kısa bir süre için çalkalanır, ve bir sıvı sintilasyon sayacı içinde sayılır. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bicinchoninic asit (BCA) test, örnek 10 ul kullanılarak protein konsantrasyonu ölçülür. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Üreticinin protokolü takip insülin radioimmunoassay gerçekleştirin. </li><li> Protein kons ile insülin salgılanması ve timidin dahil veri Normaleentration. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Sıçan adacıklarında adacık replikasyonu ve beta hücresi fonksiyonunu değerlendirmek için deney için bir örnek, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Bu örnek, sağlam beta hücre fonksiyonu değiştirmeden adacık çoğaltma uyarır varsayımsal &quot;# 6 Gen&quot; bu adenoviral aşırı gösterir. Üst panosunda, timidin dahil testte sonuçlar &quot;Gen # 6&quot; ifadesini arttırarak timidin eklenmesi ile ölçülen DNA sentezi, artırdığını göstermektedir. Sıçan adacık hücrelerin en beta hücrelerinin olduğundan, timidin dahil bu artış beta hücre replikasyon bir artış gösterir olasıdır. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler sıkıca Bu kurmak için gerçekleştirilmesi gerekir. Alt panelinde, insülin salgılanması testte sonuçlar &quot;Gen # 6&quot; i, yani birincil beta hücre fonksiyonlarının bir değişiklik olmadı bu aşırı göstermekdüşük ve yüksek glukoz de nsulin salgısı. Adenovirüsler ile tedaviyi takiben adacık adacık izolasyonu ve sağlık kalitesi düşük ve yüksek glukoz konsantrasyonlarında insülin salınımını kat artış ile gösterilir. &quot;Gen # 6&quot; bozulmuş beta hücre fonksiyon ifadesini arttırarak, bu olasılığı yüksek, uyarıcı glukoz konsantrasyonları (16.7 mM) olarak salgılanan insülin bir azalma olarak yansıtılacaktır. Glukoz biyokatalist için bir doz-yanıt eğrisi de yapılabilir. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Gen ekspresyonu adenoviral aracılı değişiklikler sonrasında izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için protokol bakış. Taze izole sıçan adacıklar 24 saat adenovirüsler maruz kalan ve daha sonra 96 ​​saat kadar kültürlenmiştir. Timidin dahil olarak insülin salgılanmasını ölçülmesi ile takip, nihai 24 saat içinde değerlendirilirdüşük ve yüksek glukoz. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Bir kontrol adenovirüs ve adenovirüs aşırı &quot;Gen # 6&quot; olarak adlandırılan varsayımsal bir gen üzerinde yapılan bir deneyde elde edilen sonuçlar. Üst panel timidin dahil olması ve alt panelini insülin salgılanmasını gösterir.

<ol><li>Ferrannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+function+in+subjects+spanning+the+range+from+normal+glucose+tolerance+to+overt+diabetes%3A+a+new+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).</li>
<li>Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+insulin+secretory+dysfunction+and+insulin+resistance+in+the+pathogenesis+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.</a> J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).</li>
<li>Keenan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+insulin+production+and+pancreatic+ss-cell+turnover+after+50+years+of+diabetes%3A+Joslin+Medalist+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study.</a> Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).</li>
<li>Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adenovirus+vector+for+efficient+RNA+interference-mediated+suppression+of+target+genes+in+insulinoma+cells+and+pancreatic+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans.</a> Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trefoil+factor+3+stimulates+human+and+rodent+pancreatic+islet+beta-cell+replication+with+retention+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function.</a> Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).</li>
<li>Schisler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).</li>
<li>Chan, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+uncoupling+protein+2+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+rat+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets.</a> Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53, 149-159 (2004).</li>
<li>Icyuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+infection+activates+akt1+and+induces+cell+proliferation+in+pancreatic+islets1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1.</a> Transplantation. 87, 821-824 (2009).</li>
<li>Kaneto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hexosamine+pathway+leads+to+deterioration+of+pancreatic+beta-cell+function+through+the+induction+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress.</a> J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).</li>
<li>Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering with recombinant adenoviruses.</a> Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).</li>
<li>Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+overexpressed+hexokinases+in+liver+and+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells.</a> Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).</li>
<li>Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hexokinase+I+in+isolated+islets+of+Langerhans+via+recombinant+adenovirus.+Enhancement+of+glucose+metabolism+and+insulin+secretion+at+basal+but+not+stimulatory+glucose+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels.</a> J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+to+pancreatic+islets+does+not+alter+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function.</a> Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için modüle olabilir kurulması yollarının her iki diyabet büyük formlar alakalı. Işlevsel beta hücre kitlesi bu belirleyicileri değerlendirmek, insülin salgılayan hücrelerin varlığı ve fonksiyonu bağlı olduğundan aynı anda avantajları vardır. Bu protokolün bir proteini aşırı ekspresyonu ya da bastırma sonra in vivo etki için test edilebilir in vitro olarak fonksiyonel beta hücre kütlesi değişikliklere yol açar olmadığını belirlemek için düzenlen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 ortamı </td><td> Gibco </td><td> 11879 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 6-iyi plaka </td><td> BD-Falcon </td><td> 35-1146 </td><td> Sigara TC tedavi </td></tr><tr><td> [Metil-3 H] timidin- </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z001MC </td><td> 1 mCi / ml </td></tr><tr><td> Mikro-santrifüj tüpü </td><td> Denville </td><td> C2170 </td><td> 1.7 ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> 59888 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Acros </td><td> 42409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ Sub&gt; PO 4 </td><td> Acros </td><td> 20592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Acros </td><td> 41348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCI2 </td><td> Acros </td><td> 34961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> 1 M solüsyon </td></tr><tr><td> % 35 BSA </td><td> Sigma </td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Acros </td><td> 42427 </td><td></td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA9410-1 </td><td> % 10 w / v </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Acros </td><td> 12426 </td><td></td></tr><tr><td> Sintilasyon tüp sayma </td><td> Sarstedt </td><td> 58.536 </td><td> 7 ml, PP </td&gt; </tr><tr><td> Sintilasyon sayma tüp kap </td><td> Sarstedt </td><td> 65.816 </td><td></td></tr><tr><td> Econo-Güvenli sayma kokteyl </td><td> RPI </td><td> 111175 </td><td></td></tr><tr><td> İnsülin RIA </td><td> Siemens </td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Test Kiti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td> Sintilasyon tüp raf sayma </td><td> Sarstedt </td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td> Sıvı sintilasyon sayacı </td><td> Perkin Elmer </td><td> Tri-Carb 2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

Çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirilmesi adenovirally-transdük İzole kemirgen islets

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glikoz homeostazı, öncelikle, sırasıyla, pankreas beta ve alfa hücrelerden salgılanan, endokrin hormonlar insülin ve glukagon tarafından kontrol edilir. Fonksiyonel beta hücre kütlesi anatomik beta hücre kütlesi gibi bir besin yük yanıt beta hücrelerinin yeteneği ile belirlenir. Işlevsel beta hücre kitlesi kaybı diyabet 1-3 iki büyük formlar merkezidir. Tip 1 diyabetin otoimmün bir saldırı azalan işlevsel beta hücre kitlesi sonuçları ise, tip 2 diyabet, bu eksiltme uygun insülin salgılamaya beta hücrelerinin bir yetersizlik ve mekanizmalar bir kadro beta hücrelerinin yok hem de gelişir. Böylece, işlevsel beta hücre kitlesi geri çabaları daha iyi tedavi ve diyabet için potansiyel tedavileri için her şeyden vardır. Çabaları çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için kullanılabilir moleküler yolları belirlemek için çalışmalar devam etmektedir.İdeal olarak, tedavi hedefleri beta hücre büyümesi ve fonksiyonu hem de artıracak. Ancak belki de daha önemli beta hücre büyümesini uyarır bir strateji zedeleyen beta hücre fonksiyonu (bazı onkogenler olduğu gibi) ve tam tersi pahasına geliyor olmadığını belirlemektir. Izole sıçan adacıklar hedef genlerin sistematik baskılayarak veya aşırı ifadesi olarak, bir artan işlevsel beta hücre kitlesi 4-6 için potansiyel tedavi hedefleri belirleyebilir. Adenoviral vektörler izole sıçan adacıklar 4,7-15 verimli olarak artmış veya demonte proteinlerine istihdam edilebilir. Burada, adenoviral transdüksiyon kullanarak gen ekspresyon işlemek ve izole sıçan adacıklar (Şekil 1) adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, beta hücre çoğaltma veya fonksiyon 5,6,8,9,16,17 modüle yeni hedefler belirlemek için daha önce kullanılmıştır.

Bu protokol bir diyabet tedavisi için terapötik hedefleri bulmak için işlevsel beta hücre kitlesi modüle faktörleri belirlemek sağlar. Protokolü adenovirüsler ile gen ekspresyon manipülasyonu takiben izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için modern bir yöntem oluşur.

Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Glikoz homeostazı, temel olarak pankreasın beta ve alfa hücrelerinden salgılanan insülin ve glukagon endokrin hormonları tarafından kontrol edilir...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel beta hücre kütlesindeki değişimleri düzenleyen sinyal yollarını belirlemektir. Bu işlem, adenoviral vektörler kullanılarak bir genin aşırı eksprese edilmesi veya ekspresyonunun baskılanması yoluyla izole sıçan adacıklarında gerçekleştirilir. Bu manipülasyondan sonra, beta hücresi fonksiyonu insülin sekresyonu ile, adacık replikasyonu ise tritiyumlu timidin inkorporasyonu ile ölçülerek değerlendirilir.Nihayetinde, bu analizler, ilgilenilen bir genin in vitro ortamda beta hücresi proliferasyonunu ve/veya fonksiyonunu düzenleyip düzenlemediğini gösterebilir. Bu yöntem, bir sinyal yolunun belirli bir bileşeninin beta hücresi büyümesini ve fonksiyonunu etkileyip etkilemediği gibi, göz kapağı biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Gerekli sayıdaki kuyucuğa iki mililitre modifiye medyum ekleyerek, doku kültürü kaplamasız altı kuyucuklu bir plaka hazırlayın.Örneğin, tipik bir deney; bir virüssüz kontrol, bir virüs kontrolü ve bir deneysel grup için birer tane olmak üzere üç kuyucuk gerektirebilir; plakayı bir doku kültürü inkübatöründe en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın. Sıçan gözlet izolasyonunun hemen ardından,

assessing-replication-beta-cell-function-adenovirally-transduced

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Burada, β hücre proliferasyonunun müteakip immünofloresan analizi ile kültürdeki bozulmamış fare adacıklarına ilgi yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrokürelerinin bileşiğini oluşturmak ve uygulamak için metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, aday β hücreli mitojenlerin etkinliğini belirlemek için uygundur.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin izole sıçan adacıklarında adenoviral vektörlerle gen ifadesi manipülasyonu kullanarak beta hücre kütlesi ve fonksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol diyabet tedavisi için sinyal yolaklarını belirlemeye yardımcı olur.

Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Daha fazla video keşfet