Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel beta hücre kütlesindeki değişiklikleri düzenleyen sinyal yollarını tanımlamaktır. Bu, izole edilmiş sıçan halkalarında, adenoviral vektörler kullanılarak bir genin ekspresyonunun aşırı eksprese edilmesi veya bastırılmasıyla gerçekleştirilir. Bu manipülasyondan sonra, beta hücre fonksiyonu, tritiatlı timidin dahil edilmesi ile ölçülen insülin sekresyonu ve kuşgözü replikasyonu ile değerlendirilir.

Sonuç olarak, bu tahliller, ilgilenilen bir genin beta hücre proliferasyonunu düzenleyip düzenlemediğini ve/veya in vitro olarak işlev görüp görmediğini gösterebilir. Bu yöntem, göz kapağı biyolojisi alanında, bir sinyal yolunun belirli bir bileşeninin beta hücresi büyümesini ve işlevini etkileyip etkilemediği gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Gerekli sayıda oyuğa iki mililitre modifiye ortam ekleyerek altı kuyucuklu doku kültürü kaplı bir plaka hazırlayın.

Örneğin, tipik bir deney, her biri virüs kontrolü olmayan, bir virüs kontrolü için üç kuyucuk gerektirebilir ve deney grubu, plakayı bir doku kültürü inkübatöründe en az 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye kadar ısıtır. Sıçan deliği izolasyonunun hemen ardından, hazırlanan plakanın her bir oyuğuna bir ila 200 delik yerleştirin. Biyokimyasal tahliller için 60 delik kullanılacaktır ve kalan delikler gen ekspresyonu Çalışmaları veya immüno-lekeleme için kullanılabilir, halkaları her birinin merkezine getirmek için plakayı hafifçe şişirin.

Peki, hemen adenovirüsü doğrudan deliklere pipetleyin. Yemeğin ortasında. Adenovirüsün ilgilendiğiniz proteini aşırı eksprese etme veya düşürme etkinliğine bağlı olarak bir ila 500 enfeksiyon çokluğu kullanın.

Göz kapağının çekirdeğine etkili adenoviral penetrasyon, sonuçların tutarlılığını artırır. Göz kapağından hemen sonra göz kapaklarının transdüksiyonu. İzolasyon esastır.

Plakayı beş dakika boyunca rahatsız etmeyin, ardından 24 saat boyunca inkübatöre taşıyın. Ertesi gün, plakayı inkübatörden çıkarın ve halkaları kuyucukların merkezlerine doğru hafifçe şişirin. Halkaları 200 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanarak taze ortam içeren yeni bir kuyuya aktarın.

Halkalar plakaya takılırsa, pipet ucuyla nazikçe yerinden çıkarılabilir. Adenovirüsün adacık çekirdek kültürüne penetrasyonunu görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanarak yeterli transdüksiyon verimliliğini doğrulamak için GFP eksprese eden bir kontrol virüsü kullanmak yararlıdır. Adacıklar bir ila üç gün daha, medyayı günlük olarak değiştiriyor.

Kültürün zamanı pilot çalışmalarla optimize edilmelidir ve deneysel hedeflere göre değişir. Son 24 saat boyunca, tritiye timidini, milimetre ortam başına bir mikro curie konsantrasyonunda ortama dahil edin. İlk olarak, 50 mililitrelik konik bir tüpte 50 mililitre çalışan SAB'yi taze olarak hazırlayın ve 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ısıtın.

10 mililitre çalışma SAB'ını 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin ve 66.8 mikrolitre 2.5 molar D glikozu ekleyin. Yüksek glikozlu SAB'yi hazırlamak için, çalışan SAB'ın kalan 40 mililitresine 44.8 mikrolitre 2.5 monolo D glikoz ekleyin. Düşük glikozlu SAB'ı hazırlamak için bir sonraki etiket: üç adet 1.7 mililitrelik mikro santrifüj tüpü

Altı kuyulu plakanın her bir kuyucuğu için ve her tüpe bir mililitre PBS ekleyin. Radyoaktif halkaların taşınması ve atılması için kurumsal protokolleri takip etmeyi unutmayın. Bir stereoskop veya standart mikroskop kullanarak, benzer boyutta 20 delik seçin ve her bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Örneğin, her tüp beş küçük, 10 orta ve beş büyük boyutlu delik içerebilir. Deney sonunda sonuçlar toplam protein içeriğine normalize edilse de, gruplar arasındaki kuşgözü eşleştirmek için çok önemlidir. Deliklerin yerçekimi veya santrifüjleme ile tüpün dibine yerleşmesine izin verdikten sonra, aspire edin, PBS'yi bir mikro pipetle tartın ve ardından halkaları biyokimyasal tahliller için hazırlamaya devam edin.

Delikleri insülin sekresyon testine hazırlamak için önce düşük glikozlu SAB ile önceden inkübe edilmeleri gerekir. Bunu yapmak için, tüplere 400 mikrolitre düşük glikoz SAB ekleyin ve bunları kapaklı olarak doku kültürü inkübatörüne yerleştirin Bir saat sonra 60 dakika boyunca, bazal insülin sekresyonunu ölçmek için ön inkübasyon düşük glikoz SAB'yi aspire edin. Ön inkübasyon prosedürünü tekrarlayın.

Bununla birlikte, uyarılmış insülin sekresyonunu ölçmek için, düşük glikoz SAB yerine 400 mikrolitre yüksek glikoz SAB kullanın ve daha önce olduğu gibi, yüksek veya düşük glikozlu SAB aspiratında inkübasyondan sonra halkaları 60 dakika inkübe edin ve insülin radyo immünolojik testi için SAB, üreticinin protokolüne göre yürütülecektir. Daha sonra aynı kuşgözü koleksiyonunu kullanarak timidin dahil etme testine devam edin. İnsülin sekresyon tahlili için sadece kullanılan deliklerle başlayın.

Bir mililitre PBS ekleyin ve deliklerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Ardından PBS'yi bir mikro pipetle aspire edin. Atın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, deliklere 500 mikrolitre buz gibi soğuk trikloroasetik asit ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüpleri dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sonra aspirasyon, TCA'yı atın.

Daha sonra, 80 mikrolitre 0.3 normal sodyum hidroksit ekleyin ve halkaları 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, numuneleri her 10 dakikada bir beş ila 10 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Paralel olarak, yedi mililitrelik sıvı sintilasyon sayma tüplerine dört mililitre conno güvenli sayma kokteyli ekleyin.

Deliklerin inkübasyonu bittiğinde, bir sintilasyon tüpüne 50 mikrolitre delik ekleyin. Kapaklı tüpü kısa bir süre çalkalayın ve numunelerin radyoaktivitesini bir sıvı parıldama sayacında ölçün. Ayrıca protein konsantrasyonunu ölçmek için 10 mikrolitre vilayı ticari bir biyonik asit testine aktarın ve üreticinin protokolünü izleyin.

Daha sonra veri analizi sırasında, açıklanan protokolleri kullanarak sonuçları protein konsantrasyonuna normalleştirin. Kuşgözü replikasyonu ve beta hücre fonksiyonu. Sıçan kuşbaşlarında, varsayımsal genin adenoviral aşırı ekspresyonu, beta hücre fonksiyonunu değiştirmeden altı sağlam bir şekilde uyarılmış kuşgözü replikasyonu değerlendirildi.

Altıncı genin ekspresyonu artmış, sıçan deliğindeki hücrelerin çoğu beta hücreleri olduğu için timidin dahil edilmesiyle ölçülen DNA sentezini arttırmıştır. Daha ileri deneyler, timidin katılımındaki bu artışın beta hücre replikasyonundaki bir artıştan kaynaklandığını gösterebilir. İnsülin sekresyon testi, gen altı'nın aşırı ekspresyonunun birincil beta hücre fonksiyonlarından birini değiştirmediğini gösterdi: düşük ve yüksek glikozda insülin sekresyonunu.

Düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonlarında insülin sekresyonundaki artış, adenovirüs ile tedaviden sonra kuşgözlerinin sağlığını yansıtır. Altıncı genin ekspresyonunun arttırılması beta hücre fonksiyonunu bozarsa, bu muhtemelen yüksek uyarılmış re glikoz konsantrasyonlarında salgılanan insülinde bir azalma olarak yansıtılacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir genin beta hücresi büyümesini veya işlevini etkileyip etkilemediğini belirlemek için beta hücre replikasyonunu ve insülin sekresyonunu nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.