Name: Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Öğrenin canlı hücre floresan mikroskopisi kullanarak bakteriyel toksin streptolizin O'ya karşı immün hücre yanıtlarını görselleştirmeyi. Bu yöntem inflamazom aktivasyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik yardım SLO plazmid ve Jonathan Franks cömert hediye için anthrolysin O, Michael Caparon ve cömert bir hediye için Richard istirahat teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe T32CA82084 (PAK) ve R01AI072083 (RDS) tarafından finanse edildi.

1. Streptolizin O Saflaştırılması (SLO) <ol><li> 0.5 L LB et suyu içine plazmid pBADgIII-SLOhis 9 içeren BL21 GOLD hücre, 20 ml gecelik kültürü aşılamak ve 500 ul 50 mg / ml ampisilin ilave edin. 37 ° C&#39;de 225 rpm&#39;de kültür çalkalanır OD 600 kadar = 0.6, genelde 1.5 saat ~. 10,000 5 dk xg az 1 ml bakteri (T 0 kabul) santrifüjleyin, 140 ul 1x SDS numune tamponu / 1 OD pelet çözülür ve protein saflık analizi için kesme DNA sonikasyon. </li><li> Kültür için 5 ml% 20 arabinoz ilavesi ile bakterilerin neden, 3 saat boyunca oda sıcaklığında 225 rpm de çalkalanır. , Bakteri 1 ml santrifüj toplayın ve yukarıda belirtildiği gibi saflık analizi için T 3 bir zaman noktası için 1 x SDS numune tamponu içinde çözülür. </li><li> 500 ml santrifüj Şişede kalan bakteriler toplayın, 4 ° C (8,500 rpm Sorvall GS-3 rotor) az 12 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de döndürün. -80 Süpernatant, mağaza pelet Durusu gerekirse uzun ° C gecede ya. </li><li> Fr süspanse10 ml buz üzerinde ozen topak parçalayıcı / yıkama tampon (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) 400 ul% 25 oranında Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml lizozim, 50 ile desteklenmiş ul 200 mM phenylmethylsulfonyl florid (PMSF). 50 ml Oak Ridge tüp yeniden süspanse pelet aktarın. </li><li> 30 sn aralıklarla buz üzerinde 30 saniye boyunca 5 kez lizat sonikasyon. Spin 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor) az 20 dakika boyunca 39.000 xg&#39;de oak ridge tüp lizat sonicated. </li><li> Lizat iplik iken, Lyse / 4 az 5 dakika boyunca 1.200 rpm&#39;de tampon ve santrifüj yıkayın ° 10 ml 1 ml Ni-NTA agaroz yıkayın C. (Tüm diğer yıkar / elutions bu koşullarda santrifüj kullanın). Yıkayın aspire. </li><li> Adım 1.5 Ni-NTA agaroz bakteriyel süpernatant ekleyin, 4 az 2,5 saat süreyle hafifçe sallayın ° C. Süpernatant toplamak için Spin. 10 μ 4x SDS numune tamponu ile süpernatant 30 ul birleştirin ve saflık analizi için kaydedin. Tampon Lyse / yıkayın ve üzerine boncuk 4 kez yıkayınTris / tuz tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0) içinde CE. </li><li> , Boncuklar ile Elüsyon, 1 ml tampon maddesi (Tris / tuz tamponu içinde 250 mM imidazol) ve 5 ul 1 M ditiotreitol (DTT) ilave 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya, eğirme ve üstte kalan sıvı toplama ile 3 kez Zehir. SLO bir çok redoks-duyarlı bir protein olup, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Bile kısa bir süre için, 37 ° C sıcaklığa getirilmiş ise bir kez azalır, protein hızla aktivitesi kaybedecektir. </li><li> 4 az 1 dakika boyunca 10.000 xg&#39;de elüsyon tampon, spin 500 ul polimiksin-konjuge agaroz yıkayın 500 ul ° C ve tekrar süspansiyon. Endotoksin tüketmek için, her bir yıkama için 200 ul boncuk ekleyin ve 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de çalkalanır. 1 4 dk ° C arasında ve süpernatan kaydetmek için 10,000 x g&#39;de Spin. SDS-PAGE analizi için 10 ul 4x SDS numune tamponu ile elüsyon her biri 30 ul birleştirin. </li><li> SDS-PAGE ile elutions saflığını test edin. Kaynama örnekleri,% 10 jel üzerinde 5 dakika ve yük 10 ul 95 ° C &#39;de jel analizi için kaydedilir. Ge LekeProtein görselleştirmek Coomassie ile l (Şekil 2A). SLO 69 kDa olduğunu. (Tipik verim 4 mg / ilk iki elutions için ml, ancak bakterinin ve plazmid kullanılan göre değişebilir) protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford Testi gerçekleştirin. </li><li> Her elüsyonunun hemolitik aktivite (bkz. aşağıda) sınayın. Saflığı, konsantrasyon ve hemolitik aktivite tatmin edici Havuzu elutions. Tek kullanımlık alikotları (tipik olarak 5-10 ul) tablet SLO, -80 kuru buz ve mağaza ° C üzerinde dondurmak </li></ol> 2. Hemolitik Assay <ol><li> RBC deney tamponu (% 0.3 bovin serum albümini (BSA), 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7.4), 5 dakika boyunca 1,200 rpm&#39;de döndürme içinde koyun kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler) yıkayın ve% 2.5 eritrositlerde de içinde tekrar süspansiyon 10 ml RBC Testi tampon. </li><li> / Kuyu buz üzerinde 96 oyuklu V-alt plaka 10 ul tahlil tamponu RBC ekleyin. Seri çoğaltmak her elüsyon seyreltin. Tipik seyreltme aralığı 1:1,000 ile 1:512,000 vardır. 10 ile hiçbir toksin ile 3 kuyu ve 3 kuyu dahilul% 2 Triton sırasıyla minimum ve maksimum kuyu olarak X-100,. </li><li> 37 plaka ve inkübe Kapak ° C 30 dk. 5 dakika boyunca 1.200 rpm&#39;de santrifüj. Düz dipli 96 plaka süpernatant 70 ul aktarın. A 405 okuyun. Bir birim, eritrositlerde% 50 lizis için gereken toksin seyreltilmesidir. Toksin aktivitesi 1 birim * dilüsyon factor/0.01 ml&#39;dir. </li></ol> 3. Hücre Parçalayıcı Assay <ol><li> Hasat hücreleri, sayım, spin. 2x10 &#39;de yeniden süspanse edin tampon içinde 6 / ml R / B (2 mM CaCl2 içeren RPMI,% 0.5 BSA) ve 20 ug / ml propidium iodide. Bir 96-V-alt plaka 100 ul hücre ekleyin. </li><li> Seri hücrelerine 100 ul toksin veya 100 ul tampon R / B ekleyebilir, tampon R / B nihai konsantrasyonu 2x SLO sulandırmak. Inkübe 5 dakika 37 ° C U / ml olarak 2,000 ila 31.25 U / ml &#39;ye Tipik nihai konsantrasyonlar aralığı. </li><li> Akış sitometresinde çalıştırın ve fikoeritrin (PE) için filtreler ile veri toplamak. Bir tek günlük vardiya geçici permeabilize cel temsills 3 günlük vardiya ölü hücreleri 4. gösterir iken. Aşağıdaki gibi, deneysel (% PI yüksek exp) den kontrol ölü hücrelerin yüzdesi (% PI yüksek ctl) çıkarılarak hücrelerin belirli lizis hesaplayın: Belirli lizis = (% PI yüksek exp -% PI yüksek ctl) / (100 -% PI yüksek ctl) * 100 </li></ol> 4. Kültür Yemekleri Hücreler Toksin Teslim mikropipet <ol><li> Bir kollajen kaplı cam alt 35 mm çanak deneyde, plaka 2x10 5 makrofajlar öncesinde bir gün. </li><li> Mikroskop ve mikroenjektör açın. Isıtılmış sahnede zaman 37 ° C&#39;ye kadar ısınmasını bekleyin Mikroskop seçim genellikle mevcut yerel ne bağlıdır. Mikroskop için 37 yemekler arasında bir ısıtma aşaması yeteneğine sahip bir ters evre ihtiyacı ° C, seçilmiş boya, ve fiziksel olarak mikroenjektör bağlamak için alan için uygun bir uyarılma / emisyon filtre küp. Bir Bertrand objektifmikroenjeksiyon için yararlı, ancak gerekli değildir. Mikroskop sürüş bilgisayar veri toplamak ve depolamak için yeterli bellek gerekiyor. </li><li> 37 boya ile 30 dakika için etiket hücreleri ° C. Tahlil bağlı olarak, etiketleme 5 ul Fura2 1 ml tam ortam içinde PM 1 ml PBS veya 2 ul içinde kalsein AM ile yapılabilir. Fura2 için, uyarılma / emisyon 340/510 nm ve 380/510 nm&#39;de için toplanmış, ve 340/380 sinyal oranının kalsiyum akısı belirler. Etidyum homodimer 525/620 nm ve APC 650/660 nm iken kalsein için, uyarma / emisyonu 495/515 nm. Diğer etiketler de seçilebilir. </li><li> 1 ml RPMI PBS ve yer ile hücreleri yıkayın 2 mM CaCl2 ile desteklenmiş. Mikroskop üzerine monte edin. </li><li> 4 ° C için 20,000 xg 10 dak toksin ve dekstran su ve santrifüj sulandırınız Tipik olarak, 1 ul SLO ve 4 ul 10 mg / ml dekstran-555 6 ul su içinde seyreltilir. Dekstran veya başka bir floresan sıvı faz molekülü Femto-ucu tıkalı olmadığını doğrulamak için kullanılan ve inje edilircts istediğiniz gibi. </li><li> Bir Microloader kullanarak seyreltilmiş toksin 0.07 ul arkadan Femto-ucu yerleştirin. </li><li> Mikroenjektör üzerine Femto-ucu yerleştirin. Uç tüm yönlerde hareket için oda hücreleri üzerinde merkezi olarak oturacak şekilde enjektör açısı ayarlayın. Z limiti temizleyin. Enjeksiyon ayarları 20 psi arka basıncı 120 psi az 0,5 sn enjekte edilmelidir. Bu orta girene kadar bahşiş indirin. </li><li> Bertrand lens merkezi ucu kullanma ve yakın hücreleri indirilir gibi ucu izleyin. Sonra odak kaybetmek normal optik geri dönün. Iğne gölge alanına anlaşılması gerekir. Yukarıda hücreler Odak ve odak kadar iğne indirin. Hücrelerin tekrar odaklanın ve dikkatli bir hücre bitişik iğne getir. Enjeksiyon için z limiti ayarlayın. İstediğiniz pozisyona ucu hareket görüntüleme başlasın, istenilen zaman noktasında toksin serbest bırakmak enjekte. Iğne kaldırın, hücreler yeni bir bölgeye taşımak ve enjekte. Istenmeyen önlemek için ev konumuna iğne Taşıiğne toksin kaçağı. </li></ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li>
<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
<li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li>
<li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li>
<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
<li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Teknikleri bakteriyel toksinler bağışıklık hücrelerinin yanıtların incelenmesine olanak burada açıklanan. En kritik adım toksin kullanım ve dozaj olduğunu. Toksin aktivitesi hatta kırılganlık dolayı aynı hazırlanması farklı alikotları arasında, son derece değişken olabilir. Bu ya bir referans hücre hattı veya RBCs karşı toksin her kısım test veya toksin gradyanlar kullanarak gerektirir. Toksin gradyanlar gibi mikropipet tarafından teslim, gerçek zamanlı olarak uyulması gereken toksin kaynaklı faaliyetlerin tam spektrum ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agaroz </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polimiksin-agaroz </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba desalt Spin col </td><td> Balıkçı </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> koyun RBCs </td><td> Balıkçı </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> ref 9&#39;a bakınız </td></tr><tr><td> Cy5 monoreactive boya </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM / Ethidium homodimer </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> kollajen kaplı cam alt tabak </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Femto-ucu II </td><td> Balıkçı </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Balıkçı </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dekstran Alexa 555 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Belirli reaktifler ve equipm Tablo 1. Liste ve kaynakent gerekli. Şirket ve katalog numarası ile birlikte bu protokolde kullanılan özel ekipman ve reaktifler, listelenir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Tampon </td><td> Kompozisyon </td><td> İkinci Adım </td></tr><tr><td> Yıkama / Lyse </td><td> 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM imidazol, pH 8.0 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> Tris / tuz </td><td> 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> Seyreltme Tampon </td><td> 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazol </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> RBC deney tamponu </td><td> % 0.3 BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> tampon R / B </td><td> RPMI hücre kültür ortamı 2 mM CaCl2 % 0.5 BSA </td><td&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bu protokolde kullanılan tamponların Tablo 2. Listesi. Ikinci tamponlar, bileşimlerine ve bu protokol kullanılmıştır girdiği ilk adım listelenmiştir. </td></tr></tbody></table>

canlı hücre floresan mikroskopi kullanma bakteriyel toksin İsteyerek yanıtların görselleştirme

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bakteriyel toksinler hücresel içeriği ve dış ortamdan malzemelerin akını sızıntı izin gözenekleri oluşturan, zarlarında kolesterol bağlamak. Hücre ya aktif zarı tamir işlemleri gerektiren bu hakaret, kurtarmak, ya da başka bir toksine maruz kalma ve hücre tip 1 miktarına bağlı olarak ölebilir. Buna ek olarak, bu toksinlerin pro-inflamatuvar sitokinlerin 2 bir dizi üretmek makrofajlar dahil immün hücrelerin aktivasyonu yoluyla enfekte barındıran güçlü inflamatuar yanıtı indükler. Pek çok Gram pozitif bakteriler, büyük ölçüde karakterize olmamış mekanizmalar yoluyla virülans katkı gösterilmiştir kolesterol bağlayıcı toksinler üretirler. Bu toksinlere maruz hücrelerin plazma membranında Morfolojik değişiklikler intrinsik hücresel savunma düşündüren, ekstrasellüler boşluğa döken olabilir kolesterol bakımından zengin yüzey çıkıntıları, onların haciz dahilmekanizması 3,4. Bu işlem, metabolik etkinlik yokluğunda tüm hücrelerde meydana gelir, ve kimyasal tespit sonra 4 EM kullanılarak görüntülenebilir. Böyle toksine maruz kalma yanıt olarak inflamasyon aracılık makrofaj gibi immün hücrelerde indüklenen membran veziküller IL-1 ailesi sitokinler içermesi önerilmektedir ve toksin atma ve bu pro-inflamatuar sitokinler 5,6,7 yaymak için hem de sorumlu olabilir. Hem 8 kaspaz-1 bağımlı süreçlerin gibi IL-1β salınımı ve hücre ölümü belirli bir türü arasında bir bağlantı, adlandırdığı pyroptosis ileri sürülmüştür. Membran vezikül toksin bağlayıcı, dökülme, sitokin salınımı, ve potansiyel olarak hücre ölümü içeren bu makrofaj yanıtı, karmaşıklığı çözmek için, biz de dahil olmak üzere, toksin-hücre etkileşimleri gerçek zamanlı görselleştirme için izin etiketleme teknikleri ve floresans mikroskobu yöntemleri geliştirmişlerdir fonksiyon bozukluğu ve ölüm ölçümleri (Şekil 1). Kullanmakcanlı hücre görüntüleme diğer teknikleri sınırlamaları nedeniyle gereklidir. Flow sitometri bireysel hücrelerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirme sunmaz ise Biyokimyasal yaklaşımlar, bireysel hücrelerin meydana etkilerini çözemez. Burada açıklanan yöntemlerle hücrelerde kompleks fenotip değişiklikleri içeren başka bir uyarıya bağlı yanıt kinetik analizi için uygulanabilir.

Tipik olarak 10 7 -10 8 U / ml SLO 4 mg / ml &#39;lik bir protein konsantrasyonuna ile elde edilebilir. Hücre parçalama için gerekli toksin miktarı hücre türüne göre değişir, ancak genellikle 125-500 U / ml SLO (Şekil 2B) olduğunu. Diğerleri (özellikle T hücre hatları) daha duyarlı olsa makrofajlar gibi Hücre tipleri (4000 U / ml) daha dirençli olabilir. Bu duyarlılık, ticari olarak temin SLO karşılık gelir. Toksin aktivitesi toksin her parti veya çözülme ile çok hemolitik deneyler...

Rekombinant gelen kolesterol bağlayıcı toksin Streptolizin O arındırıcı Yöntemleri<em&gt; E. coli</emÖkaryotik hücrelerin canlı bağlanabilen toksininin&gt; ve görüntüleme tarif edilmektedir. Toksin Lokalize teslimat toksin biyoloji romanı yönlerini açığa hedeflenen hücrelerde hızlı ve karmaşık değişikliklere sebep olur.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bakteriyel toksinler membranlardaki kolesterole bağlanarak, hücresel içeriğin sızmasına ve dış ortamdan materyal girişine izin veren gözenekler oluşturur...

Bu prosedürün amacı, bağışıklık hücrelerinin bakteriyel toksinlere verdiği yanıtları görselleştirmektir. İlk olarak, toksin BL 21 gold hücrelerinde eksprese edilir ve buralardan saflaştırılır. Toksin aktivitesi ve konsantrasyonu onaylandıktan sonra, toksin bağışıklık hücrelerine iletilir.Bir mikro enjektör ve yüksek hızlı canlı hücre mikroskopisi uygulanır. Elde edilen görüntülerin analizi, bağışıklık hücresi yanıtlarının toksine karşı gerçek zamanlı kinetiğini ortaya koyar. Bu yöntem, inflamozom aktivasyon mekanizması gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem, toksin aracılı bağışıklık hücresi yanıtları hakkında bilgi sağlayabilse de, kemotaktik çekiciler dahil olmak üzere diğer stimülasyonlar için de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bakterilerin kültürlenmiş bağışıklık hücreleriyle olan etkileşimlerini incelerken ve bakteriler ile bağışıklık hücreleri arasında oldukça değişken etkileşimler gözlemlediğimizde edindik. Strep lysin O veya SLO saflaştırmasına, PAG three SLO içeren BL 21 gold hücre kültürü ile başlayın.Plazmid, yaklaşık 0.6 OD değerine ulaşana kadar büyütülür. Protein ekspresyonunu indüklemek için kültüre beş mililitre %20'lik OSes ekleyin ve oda sıcaklığında 225 RPM'de üç saat boyunca çalkalayın. Ardından, bakterileri 500 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın.Ardından, kültürü 4 °C'de 12 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüjleyin; santrifüjleme işleminin ardından süpernatantı dökün. Peleti -80 °C'de gece boyunca veya gerekiyorsa daha uzun süre saklayın. Eksprese edilen SLO'yu saflaştırmak için, dondurulmuş pelete Triton X 100, lizozim ve fenilmetilsülfonil florür ile desteklenmiş 10 mL ly yıkama tamponu ekleyin ve yaklaşık 15 dakika boyunca pipetle aşağı yukarı çekerek karıştırın.Resüspansiyon için, örneği buz üzerinde tutarak peleti süspande edin. Resüspande edilen peleti 50 mililitrelik bir oak ridge yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe aktarın. Lizatı, bir prob sonikatör kullanarak %40 çıkış gücünde, her biri 30 saniye süren beş kez, 30 saniyelik aralıklarla ve her işlem arasında 30 saniye buz üzerinde bekletilecek şekilde sonikasyona tabi tutun.Ardından, sonike edilen lizatı 4 °C'de 20 dakika boyunca 39.000 ×g hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, bakteriyel süpernatantı bir mililitre yıkanmış nikel NTA agarozlarına ekleyin. Nikel NTA agarozlarını ve lizatı, inkübasyon sonrası 4 °C'de hafif çalkalama ile 2,5 saat boyunca birlikte inkübe edin.Boncukları 4 °C'de beş dakika boyunca 400 ×g hızda santrifüj ederek çöktürün. Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm yıkama ve elüsyon işlemlerinin bu santrifügasyon ayarlarıyla gerçekleştirildiğini unutmayın. Santrifügasyonun ardından.30 µL süpernatantı, bir mikrosantrifüj tüpünde 10 µL 4x SDS örnek tamponu ile birleştirin ve saflık analizi için buz üzerinde saklayın. Daha sonra süpernatantın geri kalanını atın ve boncukları dört kez buz yıkama tamponuyla, ardından bir kez tuz tamponuyla yıkayın; her yıkama arasında santrifüj yapın. Bu noktadan itibaren, örneği her zaman buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.SLO oldukça redoks duyarlı bir proteindir ve kısa bir süreliğine bile 37 °C'ye ısıtılırsa aktivitesini hızla kaybeder. SLO proteinini elüe etmek için, boncuklara bir mililitre elüsyon tamponu ve beş mikrolitre bir molar DTT ekleyin, buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Ardından santrifüjleyin ve süpernatantı elüsyon numarasıyla etiketlenmiş bir santrifüj tüpünde toplayın.Bu işlemi üç kez tekrarlayın, ardından SLO proteininden endotoksini uzaklaştırmak için numuneye res salt tamponu içinde süspanse edilmiş 200 µL yıkanmış poly mixing konjuge agro boncuk ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayın. Daha sonra 4 °C'de 10,000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı yeni etiketlenmiş mikro santrifüj tüplerine toplayın.Her bir elüsyondan 30 µL'yi, 10 µL dört katı SDS örnek tamponu ile birleştirin. SDS-PAGE analizi için SLO çözeltilerini buz üzerinde saklayın. Protein konsantrasyonlarını ve hemolitik aktiviteyi belirleyin; sonuçlar tatmin ediciyse, SLOE'yi 5 ila 10 µL'lik alikotlar halinde çekin, ardından kuru buz üzerinde dondurarak -80 °C'de saklayın.Ardından spesifik lizis miktarını belirleyin. Reese. Test edilecek hücreleri iki kez süspande edin. Mililitrede altı hücreyi, 20 mikrogram/ml içeren RB tamponu içinde merkezleyin.Propidium iyodür. Burada T 27 A hücreleri test edilmektedir. Ayrı mikro santrifüj tüpleri kullanarak, 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakanın her bir kuyuğuna 100 µL hücre ekleyin.SLO'yu tampon rb içerisinde final konsantrasyonun iki katı olacak şekilde seri dilüsyonla seyreltin. Ardından, hücrelere ya 100 microliters toksin ya da 100 microliters tampon RB ekleyin ve 37 degrees Celsius'de beş dakika inkübe edin. Tipik final konsantrasyonlar 2000 units per milliliter ile 31.25 units per milliliter arasında değişmektedir.Hücreleri bir akış sitometresinde analiz edin ve fi, cethrin veya pe filtreleri ile veri toplayın. Bir logluk kayma geçici olarak geçirgen hücreleri, üç logluk kayma ise ölü hücreleri temsil eder. Kontrol grubundaki ölü hücre yüzdesini deney grubundakinden, burada gösterilen denklemle çıkararak hücrelerin spesifik lizisini hesaplayın; deneyden bir gün önce, beş makrofajı iki kez kolajen kaplı cam üzerine merkezleyin.35 milimetrelik alt tabanlı kaplar. Toksin iletimi için kullanılan mikroskop; ters çevrilmiş bir sahneye, ısıtmalı bir sahneye, uygun eksitasyon emisyon filtre küplerine ve eğer mevcutsa bir Bertrand lensine sahip olmalıdır. Bu prosedürün en zor kısmı, iğneyi hücrelere kadar kırılmadan indirmektir.Başarıyı sağlamak için, odak düzlemleri boyunca ilerletirken iğneyi görselleştirmek amacıyla normalde hizalama için kullanılan bir Bertrand lensi kullanıyoruz. Mikroskop bir mikro enjektöre bağlanmış olmalı ve verileri toplamak ve depolamak için yeterli belleğe sahip bir bilgisayar tarafından kontrol edilmelidir; mikroskobu ve mikro enjektörü açın ve sahnenin ısınmasını beklerken ısıtmalı sahnenin 37 °C'ye ulaşması için zaman tanıyın. Hücreleri 37 °C'de 30 dakika boyunca boya ile etiketleyin.Analize bağlı olarak etiketleme; bir mililitre HBSS içerisinde beş mikrolitre, dört veya 2:00 AM ile veya bir mililitre tam besiyeri içerisinde iki mikrolitre kalsiyum am ile yapılabilir; burada dört veya iki kullanılır. Hücre besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve yerine iki milimolar kalsiyum klorür takviyeli bir mililitre RPMI ekleyin.Kabı mikroskoba yerleştirin, parlak alanla hücreleri netleyin ve ardından odak noktasını hücrelerin biraz üzerine ayarlayın. Sonra, bir mikrolitre SLO toksini, dört mikrolitre 10 mg/mL DEXTRA 5 55 ve altı mikrolitre suyu karıştırın. Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca 20,000 ×g ile santrifüjleyin.Dekstran, femto ucun tıkalı olmadığını doğrulamak için kullanılır. Bir mikro yükleyici kullanarak, seyreltilmiş toksinden iki mikrolitreyi femto ucun arka kısmından yükleyin. Femto ucu mikro enjektöre yerleştirin.Ardından, enjektör ucunun hücrelerin merkezinin üzerinde duracağı ve her yöne hareket edebileceği şekilde enjektör açısını ayarlayın; mikro enjektör ucunun ne kadar aşağı inebileceğini sınırlayan önceki Z limiti ayarlarını temizleyin. Mikro enjektörü, 20 PSI geri basınçla 120 PSI'da 0,5 saniye boyunca enjeksiyon yapacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, uç besiyerine girene kadar aşağı indirin.Bertrand lensi kullanarak ucu ortalayın ve uç hücrelere doğru indirilirken onu takip edin. İğne odak dışına çıktığında, normal optiklere geri dönün.İğnenin gölgesi görüş alanında belirgin olmalıdır. Hücrelerin üzerini odaklayın ve iğne netleşene kadar iğneyi indirin. Ardından hücreleri odaklayın ve iğneyi dikkatlice bir hücrenin yanına getirin.Enjeksiyon için Z limiti ayarlandıktan sonra görüntülemeye başlayın ve toksini enjekte edin. Ardından iğneyi yukarı kaldırın ve hücrelerin yeni bir bölgesine geçin. Ek toksin enjekte edin ve enjeksiyon sonrası görüntülemeye devam edin.İğneden istenmeyen herhangi bir toksin sızıntısını önlemek için iğneyi, bu videoda açıklanan yöntemi kullanarak ev konumuna getirin, mililitre başına 10⁷ ila 10⁸ birim. SLO tipik olarak 4 mg/mL protein konsantrasyonu ile elde edilir. Bu SDS-PAGE jeli, toksin indüksiyonu öncesi ve sonrası bakteriyel örnekleri ile saflaştırmayı takip eden üç elüasyonun her birini göstermektedir; Coomassie blue boyama, indüklenen SLO'nun başarıyla saflaştırıldığını ortaya koymaktadır.T 27 A veya D iki hücrelerinin lizi için gerekli toksin miktarını belirlemek amacıyla, 69 kilodaltondaki bant SLO olarak tanımlanmıştır. Hücreler, propidyum iyodür varlığında 37 °C'de beş dakika boyunca çeşitli SLO konsantrasyonlarına maruz bırakılmış ve akış sitometrisi ile incelenmiştir. Spesifik liz, burada gösterildiği şekilde belirlenmiştir.Mililitre başına 250 ünite. SLO, hem T 27 A hem de D iki hücrelerinin %50 lizisini sağlar. Toksinin sublitik %10 lizis dozu mililitre başına 62.5 ünite olacaktır.Bu değerler, toksin maruziyeti sonrası hücre ölümünü değerlendirmek için referans toksin aktivitesi açısından önemlidir. İnsan dermal fibroblastları, Life Technologies marka bir canlı-ölü kiti kullanılarak kalsiyum ve atherium homodimeri ile inkübe edildi. Bakteriyel toksin anthro lysin O'ya lokalize maruziyetin ardından, bu görüntüde kalsiyum yeşil ve atherium bromür kırmızı renkte gösterilmiştir; mikrobiyomun yakınındaki bölgeler kalsiyum kaybı ve athe homodimer alımı ile karakterize edilen hücre ölümünü gösterirken, uçtan daha uzak bölgeler herhangi bir hasar göstermeyecektir.Toksinin mikro düzeyde iletilmesi, kalsiyum akışı gibi gerçek zamanlı olayların incelenmesine de olanak tanır. 4:02 AM ile yüklenen bu insan dcs'leri, yeşilden maviye geçişin eş zamanlı canlı görüntülemesiyle birlikte, sabit bir akış hızında SLO'ya maruz bırakılmıştır. Sözde renk, sitozolik kalsiyum seviyelerindeki artışı belirtmektedir.SLO, lokalize uygulama nedeniyle kabın bölgesinde yayılan hızlı bir sitozolik kalsiyum artışını tetikler. Ancak, yalnızca mikro enjektör ucuna yakın hücreler toksine maruz kalır ve tepki verir. Bu durum, hem toksine verilen tek hücreli tepkiyi hem de z eksenindeki olayları çözümlemek için toksin uygulamasının mekansal olarak kısıtlanmış alanını kanıtlamaktadır.Mikro iletim, yüksek hızlı 3D konfokal mikroskopi ile birleştirilmiştir. Bu görüntü seti, toksin enjeksiyonu sonrası dendritik hücreleri göstermektedir. Plazma membranını işaretlemek için, yeşil renkte gösterilen bir PC'ye konjuge edilmiş anti CD 11 C ile önkuluvasyon yapılmıştır.Burada görülebileceği üzere, toksin iletimini takiben mikrovesiküller salınır. Hücresel onarım sürecinin bir parçası olarak, toksin molekülleri, toksini uzaklaştırmak için kopan blebler üzerinde yoğunlaşır. Yöntem kavrandıktan sonra, mikroskopi işlemi 45 dakikada tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, hücrelerle karıştırmadan önce toksini soğuk tutmayı ve hemolitik aktiviteyi test etmeyi hatırlamak önemlidir. Güzel. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre mikroskobisi kullanarak bakteriyel toksinlere karşı bağışıklık hücresi yanıtlarının gerçek zamanlı kinetiğinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Kaynak: Brzozowski, R. S. ve diğerleri. Bakterilerde subhücre protein lokalizasyonunu ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, bakterilerde gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için canlı hücre floresans mikroskopisini göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerçek zamanlı elde etmek için görüntüleme, zaman geçişi ve dekonvolüsyonda kullanılan adımları özetler.

Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Kaynak: Chetrit, D. ve diğerleri.  Legionella pnömofila nokta/icm salgı sisteminin mekansal ve zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografi uygulanıyor. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, floresan olarak işaretlenmiş patojenik bakterilerin hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. Agarose pedleri önce hazırlanır ve yapıştırıcı bir çerçeve içine yerleştirilir. Hücreleri hareketsiz hale getirmek için pedde floresan protein ifade eden genetik olarak...

Flüoresans Etiketlenmiş Bakterilerin Örnek Hazırlanması ve Görüntülemesi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Öğrenin canlı hücre floresan mikroskopisi kullanarak bakteriyel toksin streptolizin O'ya karşı immün hücre yanıtlarını görselleştirmeyi. Bu yöntem inflamazom aktivasyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Daha fazla video keşfet