Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bu prosedürün amacı, bağışıklık hücrelerinin bakteriyel toksinlere verdiği tepkileri görselleştirmektir. İlk olarak, toksin BL 21 altın hücrelerinde eksprese edilir ve saflaştırılır. Toksin aktivitesi ve konsantrasyonu onaylandıktan sonra, toksin bağışıklık hücrelerine iletilir.

Mikro enjektör kullanılarak yüksek hızlı canlı hücre mikroskobu yapılır. Elde edilen görüntülerin analizi, toksine karşı bağışıklık hücresi tepkilerinin gerçek zamanlı kinetiğini ortaya koymaktadır. Bu yöntem, inflamatuar aktivasyon mekanizması gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, toksin aracılı bağışıklık hücresi tepkileri hakkında bilgi sağlayabilse de, kemotaktik traktörler de dahil olmak üzere diğer uyaranlara da uygulanabilir. İlk olarak, bakterilerin kültürlenmiş bağışıklık hücreleri ile etkileşimini incelerken ve bakteriler ile bağışıklık hücreleri arasında oldukça değişken etkileşimler gözlemlerken bu yöntem için fikir sahibi olduk. Strep lizin O veya SLO'nun saflaştırılmasına, PAG üç SLO içeren bir BL 21 altın hücre kültürü ile başlayın.

Plazmidi yaklaşık 0.6'lık bir OD'ye büyüdü. Protein ekspresyonunu indüklemek için, kültüre beş mililitre% 20 OS ekleyin ve üç saat boyunca oda sıcaklığında 2 25 RPM'de çalkalayın. Daha sonra, bakterileri 500 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın.

Daha sonra kültürü, sıkma dekantını takiben 12 dakika dört santigrat derece boyunca 12.000 kez G'de döndürün. Sırt, peleti gece boyunca veya gerekirse daha uzun süre eksi 80 santigrat derecede saklar. Eksprese edilen SLO'yu saflaştırmak için, Triton X 100 lizozim ve fenil metil sülfüril florür ile desteklenmiş 10 mililitre yıkama tamponunu donmuş pelet pipetine yaklaşık 15 dakika yukarı ve aşağı ekleyin.

Resus'a göre, numuneyi buz üzerinde tutarak peleti askıya alın. Yeniden süspanse edilmiş peleti 50 mililitrelik meşe sırtı yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe aktarın. Her biri 30 saniye aralıklarla, aralarında 30 saniye olmak üzere% 40 çıkışta bir prob sonikat kullanarak lizatı sonikleştirin.

Daha sonra sonikat lizatı 20 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 39.000 kez G'de döndürün. Döndürme işleminden sonra, bakteriyel supinatı bir mililitre yıkanmış nikel NTA aros'a ekleyin. Nikel NTA aros'u inkübe edin ve inkübasyondan sonra hafifçe çalkalayarak dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca birlikte lizat edin.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez G'de döndürerek boncukları peletleyin. Diğer tüm yıkama ve elüsyonun bu santrifüj ayarlarıyla gerçekleştirildiğini ve daha az başka türlü not alındığını unutmayın. Santrifüjlemeyi takiben.

30 mikrolitre supinat ile 10 mikrolitre SDS numune tamponunu bir mikro santrifüj tüpünde dört kez birleştirin ve saflık analizi için buz üzerinde saklayın. Daha sonra sırtüstü ajanın geri kalanını atın ve boncukları bit yıkama tamponunda dört kez yıkayın. Ve her yıkama arasında bir kez tuz tamponu santrifüjleme ile ilgilenin Bu noktadan itibaren, numuneyi her zaman buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.

SLO, redoksa çok duyarlı bir proteindir ve kısa bir süre için bile olsa, 37 santigrat dereceye kadar ısıtılırsa aktivitesini hızla kaybeder. SLO proteinini elüte etmek için, boncuklara bir mililitre elüsyon tamponu ve beş mikrolitre bir molar DTT ekleyin, 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra santrifüjleyin ve supinatı elucian numarası ile etiketlenmiş bir füge tüpünde toplayın.

Bu işlemi üç kez tekrarlayın, ardından SLO proteininden endotoksini tüketmek için, numuneye 200 mikrolitre yıkanmış poli karıştırma konjuge agro boncuk, askıda res tuz tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede çalkalayın. Daha sonra dört santigrat derecede bir dakika boyunca 10.000 kez G'de döndürün. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı yeni etiketli mikro santrifüj tüplerinde toplayın.

Her elüsyonun 30 mikrolitresini 10 mikrolitre, SDS numune tamponunun dört katı ile birleştirin. SDS sayfa analizi için SLO çözümlerini buz üzerinde saklayın. Protein konsantrasyonlarını ve hemolitik aktiviteyi belirleyin, tatmin ediciyse, SLOE'yi beş ila 10 mikrolitrelik kuatlar halinde çekin, ardından kuru buz üzerinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Sonra spesifik lizisi belirleyin. Reese. Test edilecek hücreleri iki kez askıya alın. Mililitre başına altı hücreyi, mililitre başına 20 mikrogram ile RB tamponunda ortalayın.

Propidyum iyodür. Burada T 27 A hücreleri test edilir. Ayrı mikro santrifüj tüplerinde 96 kuyulu V alt plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre hücre ekleyin.

SLO'yu tampon rb'deki nihai konsantrasyonun iki katına kadar seri olarak seyreltin. Daha sonra hücrelere 100 mikrolitre toksin veya 100 mikrolitre tampon RB ekleyin ve beş dakika 37 santigrat derece inkübe edin. Tipik nihai konsantrasyonlar mililitre başına 2000 birim ile mililitre başına 31.25 birim arasında değişir.

Hücreleri bir akış sitometresinde çalıştırın ve fi, cethrin veya pe için filtrelerle veri toplayın. Bir günlük kayma geçici olarak geçirgen hücreleri temsil ederken, üç günlük kayma ölü hücreleri gösterir. Deney plakasından bir gün önce burada gösterilen denklemi kullanarak kontroldeki ölü hücrelerin yüzdesini deneyden çıkararak hücrelerin spesifik parçalanmasını hesaplayın, iki kez beş makrofajı kollajen kaplı cam üzerinde ortalayın.

Alt 35 milimetre tabaklar. Toksin iletimi için kullanılan mikroskop, ters çevrilmiş bir aşama, ısıtılmış bir aşama, uygun uyarma emisyon filtre küpleri ve varsa bir bertand lensi ile donatılmalıdır. Bu işlemin en zor kısmı iğnenin hücrelere sağlam bir şekilde indirilmesidir.

Başarıyı garantilemek için, iğneyi odak düzlemlerinden geçirirken görselleştirmek için normalde hizalama için kullanılan bir Bertrand lensi kullanıyoruz. Mikroskop bir mikro enjektöre bağlanmalı ve veri toplamak ve depolamak için yeterli belleğe sahip bir bilgisayar tarafından kontrol edilmeli, mikroskobu ve mikro enjektörü açmalı ve sahnenin ısınmasını beklerken ısıtılan aşama süresinin 37 santigrat dereceye kadar ısınmasına izin verilmelidir. Hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede boya ile etiketleyin.

Tahlile bağlı olarak etiketleme beş mikrolitre ile yapılabilir, bir mililitrede dört veya 2:00, burada bir mililitre tam ortamda HBSS veya iki mikrolitre kalsiyum, dört veya iki kullanılır. Hücre ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve iki milimolar kalsiyum klorür ile desteklenmiş bir mililitre RPMI ile değiştirin.

Çanağı mikroskobun üzerine monte edin, parlak alan ile hücreleri odak noktasına getirin, ardından hücrelerin biraz üzerine odaklanacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, bir mikrolitre SLO toksini dört mikrolitre, mililitre başına 10 miligram, DEXTRA 5 55 ve altı mikrolitre su birleştirin. Daha sonra 20.000 kez G'nizi 10 dakika dört santigrat derece boyunca santrifüjleyin.

Dekstran, femto ucunun G tıkalı olmadığını doğrulamak için kullanılır. Arkadan femto ucuna iki mikrolitre seyreltilmiş toksin yüklemek için bir mikro yükleyici kullanın. Femto ucunu mikro enjektöre yükleyin.

Ardından, enjektörün açısını, uç, her yöne hareket etmek için yer olacak şekilde hücrelerin ortasına oturacak şekilde ayarlayın, mikro enjektör ucunun ne kadar alçalabileceğini sınırlayan Z limiti için önceki ayarları temizleyin. Mikro enjektörü, 20 PSI geri basınçla 120 PSI'da 0,5 saniye enjekte edecek şekilde ayarlayın. Ardından ucu ortama girene kadar indirin.

Bertrand lensini kullanma. Ucu ortalayın ve hücrelere daha yakın indirilirken ucu takip edin. İğne odak dışına çıktığında normal optiklere geri dönün.

İğne gölgesi sahada belirgin olmalıdır. Hücrelerin üzerine odaklanın ve odaklanana kadar iğneyi indirin. Ardından hücreleri odak noktasına getirin ve iğneyi dikkatlice bir hücrenin yanına getirin.

Enjeksiyon için Z sınırını ayarladıktan sonra görüntülemeye başlayın ve toksin enjekte edin. Sonra iğneyi kaldırın ve yeni bir hücre bölgesine geçin. Ek toksin enjekte edin ve enjeksiyonu takiben görüntülemeye devam edin.

Bu videoda açıklanan yöntemi kullanarak, mililitre başına 10 ila yedi ila 10 ila sekiz birim olmak üzere iğneden istenmeyen toksin sızıntısını önlemek için iğneyi başlangıç konumuna getirin. SLO tipik olarak mililitre başına dört miligramlık bir protein konsantrasyonu ile elde edilir. Bu SDS sayfası jeli, saflaştırmayı takiben toksin indüksiyon satından önce ve sonra bakteri örneklerini gösterir ve üç ellucian kamasi mavisi boyamanın her biri, indüklenen SLO'nun başarılı bir şekilde saflaştırıldığını ortaya koymaktadır.

SLO, T 27 A veya D iki hücresinin parçalanması için gereken toksin miktarını belirlemek için 69 kilodaltondaki banttır. Hücreler, propidyum iyodür varlığında 37 santigrat derecede beş dakika boyunca çeşitli SLO konsantrasyonları ile zorlandı ve akış sitometrisi ile incelendi. Spesifik lizis, burada gösterildiği gibi gösterildiği gibi belirlendi.

Mililitre başına 250 birim. SLO, hem T 27 A hem de D iki hücrenin% 50'sini verir. Bir sublitik% 10'luk lizis toksin dozu mililitre başına 62.5 birim olacaktır.

Bu değerler, toksin maruziyetini takiben hücre ölümünü değerlendirmek için kıyaslama toksin aktivitesi için önemlidir. İnsan dermal fibroblastları, yaşam teknolojilerinden canlı ölü kiti kullanılarak kalsiyum ve atherium homodimer ile inkübe edildi. Bu görüntüde bakteriyel toksin, antrolizin O.In lokalize maruziyeti takiben, mikrobiyoma yakın kırmızı bölgelerde kalsiyum yeşil ve atherium bromür ile gösterilir, kalsiyum kaybı ve homodimer alımı ile karakterize hücre ölümünü gösterirken, uçtan daha uzak bölgeler hasar göstermez.

Toksinin mikro iletimi, kalsiyum akışı gibi gerçek zamanlı olayların incelenmesine de izin verir. 04:02 ile yüklenen bu insan dc'leri, eşzamanlı canlı görüntüleme kayması ile sabit bir akış hızında SLO'ya maruz bırakıldı. Yalancı renk, sitozolik kalsiyum seviyelerinde bir artışı gösterir.

SLO, lokalize teslimat nedeniyle yemeğin bölgesi boyunca yayılan sitozolik kalsiyumda hızlı bir artışa neden olur. Ancak sadece mikro enjektör ucuna yakın hücreler ile karşılaşır ve reaktör toksini bulunur. Bu, hem toksine karşı bir hücresel reaksiyonu hem de zdi boyutundaki olayları çözmek için mekansal olarak kısıtlı toksin iletim alanını gösterir.

Mikro uygulama, yüksek hızlı 3D konfokal mikroskopi ile birleştirildi. Bu görüntü seti, toksin enjeksiyonunu takiben dendritik hücreleri göstermektedir. Plazma zarını etiketlemek için yeşil renkle gösterilen bir PC'ye konjuge edilmiş anti CD 11 C ile önceden inkübe edildiler.

Burada görülebileceği gibi, toksin iletimini takiben mikro-parçacıklar salınır. Hücresel onarım sürecinin bir parçası olarak, toksin molekülleri, toksini ortadan kaldırmak için dökülen kabarcıklar üzerinde yoğunlaşır. Bir kez ustalaştıktan sonra, mikroskopi 45 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hücrelerle karışmadan önce toksini soğuk tutmayı ve hemolitik aktiviteyi test etmeyi unutmamak önemlidir. İyi. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre mikroskobu kullanarak bakteriyel toksinlere karşı bağışıklık hücresi tepkilerinin gerçek zamanlı kinetiğini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.