Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hastalıklı insan ventrikül örneklerinden canlı kardiyomiyositleri izole etmek ve bunların fonksiyonel değişikliklerini karakterize etmektir. Bu işlem, aşırı doku dejenerasyonunu ve hücre hasarını önlemek amacıyla, öncelikle taze ventrikül örneklerinin buz soğukluğundaki kardiyoplejik solüsyon içinde hızla toplanıp kıyılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, miyokard parçalarının özel yapım bir sindirim cihazı ve enzimatik solüsyonlar kullanılarak kademeli olarak sindirilmesidir.

Altı döngü boyunca, her döngüde tampon içeren hücreler bir tüpe toplanır ve hücre koruma çözeltisi ile seyreltilir. Son adım, fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek amacıyla altı tüpte bulunan hücrelerin, normal kalsiyum konsantrasyonlarına sahip daha düşük hacimli standart bir fizyolojik çözelti içinde yeniden süspande edilmesidir. Nihayetinde, hipertrofik kardiyomyopatili hastalardan alınan kardiyomiyositlerdeki aksiyon potansiyeli, potansiyel süresi ve hücre içi kalsiyum döngüsündeki değişiklikleri göstermek için aksiyon potansiyellerinin patch clamp kaydı ve floresan boyalar kullanılarak hücreler arası kalsiyumun eş zamanlı değerlendirmesi kullanılır.

DYS yönteminin standart chunk dejection yöntemi gibi yöntemlere göre temel avantajı, enzim solüsyonuyla birlikte, silikon sıyırıcıları sayesinde farklı hücrelerin eş zamanlı olarak ayrıştırılmasına olanak tanıyan özel yapım bir sindirim cihazı kullanmamızdır. Bu yöntem, kardiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, kardiyak hastalıklarla ilişkili bilinen moleküler ve yapısal yeniden şekillenmenin, yöntemimizle analiz edilebilen ve spesifik ilaçlarla hedeflenebilen tekil kardiyomiyositlerin değişimlerine nasıl yansıdığı gibi. Bu nedenle, bu tekniğin uygulama alanı hipertrofik kardiyomiyopati gibi genetik kardiyak hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır.

Aslında bu yöntem, kalp ameliyatı geçirmiş hipertrofik veya iskemik kalp hastalığı olan hastalardan alınan ventriküler kardiyomiyositler üzerinde yeni nöropatik yaklaşımları test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, insan arter örnekleri ile kalp cerrahisi sırasında elde edilen ventriküler biyopsiler arasındaki analojiyi karşılaştırırken ortaya çıkmıştır. Bu prosedüre, 50 mL'lik bir tüpe 40 mL Kardiyoplejik solüsyon dökerek ve örneğin ameliyathaneden hücre izolasyon laboratuvarına nakli için buzda saklayarak başlayın; örneği hızla laboratuvar alanına transfer edin ve örnek eksize edildikten sonra 10 dakika içinde örnek işlemeye başlayın.

Ameliyathaneden eksize edildikten hemen sonra bir sonraki kolektif ventriküler miyokard örneğini alın. Örneği buz gibi soğuk CP solüsyonu ile yıkayın ve örneği buz gibi soğuk CP tamponu içinde tutarak tüpte saklayın. Daha sonra, ince makas kullanarak endokardiyal fibrotik tabakayı dikkatlice çıkarın.

Miyokard dokusunu, her bir izolasyon için toplam ventriküler miyokard miktarı 100 mg ile 1 g arasında olacak şekilde iki ila üç milimetre uzunluğunda küçük parçalara bölün. Parçalar sindirim cihazının kazıma haznesine aktarıldıktan sonra, haznedeki CP tamponunu soğuk kalsiyumsuz disosiasyon tamponu ile değiştirin. Ardından sindirim cihazını termostatik banyoya yerleştirin.

Benmari banyosunu 37.5 °C'ye ayarlayın ve çalıştırın. Ardından, sindirim cihazının motorunu açın ve dönüş hızını saniyede bir devir olarak ayarlayın. DB ile üç yıkama döngüsü gerçekleştirin ve haznedeki solüsyonu her sekiz dakikada bir 37 °C'lik oksijenle doyurulmuş temiz DB ile değiştirin.

Ardından, DB çözeltisine mililitre başına 250 ünite kolajenaz tip beş ve mililitre başına 4 ünite proteaz Tip 24 ekleyerek enzim tamponu bir'i hazırlayın. Daha sonra, mililitre başına 250 ünite kolajenaz ekleyerek enzim tamponu iki'yi hazırlayın.

DB solüsyonu oksijenat EB bir'den beş tip ekleyin ve 37 °C'ye kadar ısıtın. Ardından, döner sindirim cihazında 37 °C'de 3 mL %100 oksijenlenmiş EB bir ile iki adet 12 dakikalık sindirim döngüsü gerçekleştirin. Her döngüden sonra solüsyonu pipet aspirasyonu ile uzaklaştırın ve atın.

Ardından, hücre toplama için altı adet 15 mililitrelik tüp ve tamponları elüe etmek için dört derece Celsius sıcaklıkta 80 mililitrelik craft brew çözeltisi hazırlayın; EB two çözeltisini oksijenlendirin ve 37 derece Celsius sıcaklığa kadar ısıtın. Sonrasında, 37 derece Celsius sıcaklıkta, %100 oksijenlendirilmiş 3 mililitre EB two ile 15 dakikalık ilk sindirim döngüsünü gerçekleştirin. Sindirim döngüsünün ardından, ilk ayrılan miyositleri içeren çözeltiyi 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu 12 mililitre soğuk KB çözeltisi ile seyreltin.

Tüpü oda sıcaklığında yatay olarak saklayın, üç mililitre EB ile 37 °C'de iki tanesi olmak üzere 12 dakikalık beş sindirim döngüsü daha gerçekleştirin ve her döngüde miyosit içeren tamponu 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Ayrıca her döngüde toplanan üç mililitre tamponu 12 mililitre KB çözeltisi ile seyreltmeyi unutmayın. Sonunda, hücre içeren altı tüpü oda sıcaklığında saklayın.

Bu adımda, 20 mL kalsiyumsuz tyro tamponuna mililitre başına bir miligram sığır serum albümini ekleyin. Ardından solüsyonu filtreleyin ve sonrasında miyosit içeren altı konik tüpü 100 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Miyositlerin çökmesini sağlamak için süpernatanı uzaklaştırın ve her tüpteki hücreleri oda sıcaklığında, değişken miktarlarda BSA içeren TB ile yeniden süspande edin.

Birinci ve ikinci adımlarda, hücre içeren tampona küçük hacimlerde 100 millimolar per liter kalsiyum klorür çözeltisi ekleyerek kalsiyum konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Kalsiyum konsantrasyonu sırasıyla 50 micro molars per liter ve 100 micro molars per liter seviyelerine çıkarılır. Müteakip kalsiyum ekleme adımları her beş dakikada bir gerçekleştirilir ve konsantrasyon, her adımda 100 micromolar per liter artırılarak 0.9 millimolar per liter nihai konsantrasyona ulaştırılır.

İzolasyon prosedürünün verimini değerlendirmek için, miyosit içeren çözeltiden 0.5 milliliters miktarını bir mikroskobun cam tabanlı haznesine aktarın. 10 x objektif büyütmesinde 15 mikroskop alanını değerlendirin ve belirgin çizgilenmeleri olan, anlamlı inklüzyonlar içermeyen çubuk şekilli hücreler gibi sağlıklı miyositlerin yüzdesini hesaplayın. Aksiyon potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum akımlarının eş zamanlı kayıtları dahil olmak üzere, insan kardiyomiyosit fonksiyonel değerlendirmesini göstermek için beklenen verim yaklaşık %20 olmalıdır.

Öncelikle, perforize yama konfigürasyonundaki yama kenetleme deneyleri için pipet solüsyonunu hazırlayın. Ardından, kalsiyum içermeyen tb'ye 1.8 millimolar kalsiyum klorür ekleyin. Bu solüsyonu, yama kenetleme floresan deneyleri sırasında kardiyomiyositlerin süperfüzyonu için kullanın.

Ardından, bir mililitre hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 mikromolar/litre flu fort ile 10 mikrolitre power load ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında, yatay konumda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra tüpü dikey konuma getirin ve hücrelerin çökelmesi için beş dakika bekleyin.

Ardından süpernatantı pipetle çekin ve hücre peletini kalsiyum içeren tb içinde yeniden süspande edin. 25 mililitre hücre süspansiyonunu, sıcaklık kontrollü, mikroskoba monte edilmiş küçük bir kayıt haznesine aktarın. 37 °C'de, 0,3 mililitre/dakika akış hızında, ısıtmalı bir mikro perfüzyon sistemi ile yerçekimi yardımıyla perfüze edin.

Bir mikro pipet çekici kullanarak, ps ile doldurulduğunda üç ila beş mikrometre uç çapına ve üç ila 4.5 mega ohm dirence sahip patch clamp pipetleri hazırlayın. Ardından, PS'ye mililitre başına 250 mikrogram amphotericin B ekleyin ve elektrotları doldurmak için bunu kullanın, daha sonra elektrodu pipet tutucuya monte edin. Sonrasında, belirgin çizgileri olan ve inklüzyon içermeyen Ron şekilli hücreyi seçin.

Giga seal oluşturun ve erişim direnci 20 ohm altına düşene kadar beş ila 10 dakika bekleyin. Ardından, akım kenetleme (current clamp) modunda, farklı stimülasyon frekanslarında kısa darbeler kullanarak aksiyon potansiyellerini uyarın. Kayıt aşaması sırasında, 492 nanometre dalga boyunda parlak alan aydınlatmasını açın ve 505 ila 520 nanometre dalga boyunda Fluor fort floresansını tespit edin.

Ardından floresan ve membran potansiyeli sinyallerini elde edin. Bu şekil, HCM örneklerinden alınan ventriküler kardiyomiyositlerdeki aksiyon potansiyeli değişikliklerini göstermektedir. Burada, bir kontrol miyositinden ve bir HCM miyositinden 0,2 hertz, 0,5 hertz ve bir hertz değerlerinde tetiklenen temsili üst üste bindirilmiş aksiyon potansiyelleri yer almaktadır.

Kontrol miyositten alınan 0,5 hertz'lik üst üste bindirilmiş aksiyon potansiyelleri. 10⁻⁷ molar isoproterenol yokluğundaki ve varlığındaki durumlar gösterilmiştir ve burada, erken sonrası depolarizasyonlar şeklinde birkaç spontan depolarizasyon sergileyen bir HCM hastasından alınan kardiyomiyosit membran potansiyelinin temsili izi yer almaktadır. Şekil, HCM örneklerinden alınan ventriküler kardiyomiyositlerdeki kalsiyum transiyentindeki değişiklikleri göstermektedir.

Burada, kontrol miyositi ve bir HCM hücresinde, patch pipeti aracılığıyla 0,2 hertz stimülasyon sırasında ortaya çıkan temsili üst üste bindirilmiş kalsiyum geçişleri yer almaktadır. HCM ve kontrol kardiyomiyositlerindeki kalsiyum geçişlerinin farklı zamanlardaki kinetikleri gösterilmekte olup, burada üç farklı frekansta stimülasyon sırasındaki hücre içi kalsiyumu gösteren ve HCM miyositinde yüksek pacing hızlarında artan diyastolik kalsiyumu vurgulayan temsili uzun izler bulunmaktadır. Bu şekil, insan ventriküler miyositleri kullanılarak yapılan ek deneysel uygulamaları göstermektedir.

Farklı membran voltajlarında kaydedilen L tipi kalsiyum akımını gösteren temsili üst üste bindirilmiş izler solda, HCM örneklerinden izole edilen 18 hücreden elde edilen farklı membran voltajlarındaki ortalama L tipi kalsiyum akımı pik yoğunluğu ise sağda gösterilmiştir; ayrıca burada, bir hertz frekansındaki elektriksel alan stimülasyonu sırasında bir ventriküler miyositten kaydedilen hücre içi kalsiyum izi sunulmuştur. Bu prosedürü uygularken, örneklerin ameliyathaneden alınmasının hemen ardından işleme başlanması önemlidir. Bu prosedür, insan ventriküler kardiyomiyositlerini izole etmek için takip edilmelidir. Yaşam süreli konfokal mikroskopi veya immünokimya gibi diğer yöntemler de uygulanabilir ve bu, örneğin membran yapılarının ve kalsiyum salınım birimlerinin subselüler lokalizasyonunun kardiyak hastalıklarda gelişimden sonra nasıl değiştiği gibi temel soruları yanıtlamak için kritik olacaktır.

Bu teknik, hücre kardiyolojisinde ventriküler kardiyomiyositlerdeki fonksiyonel anomalilerin incelenmesinin ve yeni terapötik seçeneklerin potansiyel faydalarının test edilmesinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan örneklerinden canlı tekil kardiyomiyositlerin nasıl izole edileceği ve farklı koşullarda hücre fonksiyonunun nasıl karakterize edileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.