Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, canlı kardiyomiyositleri hastalık insan ventriküler örneklerinden izole etmek ve fonksiyonel değişikliklerini karakterize etmektir. Bu, aşırı doku bozulmasını ve hücre hasarını önlemek için önce taze ventrikül örneklerinin buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyonda hızlı bir şekilde toplanması ve kıyılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, özel yapım bir sindirim cihazı ve enzimatik solüsyonlar kullanarak miyokardiyal parçaların aşamalı olarak sindirilmesini sağlamaktır.

Altı döngüde, tampon içeren hücre, her döngüde bir tüpte toplanır ve bir hücre koruyucu çözelti ile seyreltilir. Son adım, fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için altı tüpte bulunan hücrelerin normal kalsiyum konsantrasyonları ile daha düşük hacimde standart fizyolojik çözelti içinde yeniden süspanse edilmesidir. Sonuç olarak, hipertrofik kardiyomiyopatili hastalardan alınan kardiyomiyositlerde etki, potansiyel süre ve hücre içi kalsiyum döngüsündeki değişiklikleri göstermek için aksiyon potansiyellerinin yama kelepçesi kaydı ve floresan boyalar kullanılarak hücreler arası kalsiyumun eşzamanlı değerlendirmesi kullanılır.

DYS'nin standart yığın çıkarma yöntemi gibi 16 yöntemine göre benzersiz olmasının ana avantajı, enzim çözeltisi ile birlikte, silikon sıyrıkları sayesinde değişken sitlerin ortak bir şekilde birleştirilmesine izin veren özel yapım bir sindirim cihazı kullanmamızdır. Bu yöntem, kardiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin kalp hastalıklarıyla ilişkili iyi bilinen moleküler ve yapısal yeniden şekillenmenin, yöntemimiz tarafından analiz edilebilen ve spesifik ilaçlar tarafından hedeflenebilen tek kardiyomiyositlerin değişimine nasıl yansıdığı gibi. Dolayısıyla bu tekniğin anlamı, hipertrofik kardiyomiyopati gibi genetik kardiyak hastalıkların tedavisine kadar uzanır.

Aslında, bu yöntem, kalp cerrahisi geçiren hipertrofik veya iskemik kalp hastalıkları olan hastalardan ventriküler kardiyomiyositler üzerinde yeni nöropatik yaklaşımları test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem için ilk olarak, insan arter örnekleri ile kalp cerrahisi sırasında elde edilen ventriküler biyopsiler arasındaki analojiyi karşılaştırırken aklımıza geldi. Bu işleme 50 mililitrelik bir tüpe 40 mililitre Kardiyoplejik solüsyon dökerek başlayın ve numunenin ameliyathaneden hücre izolasyon laboratuvarına taşınması için buzda saklayın, numuneyi hızla laboratuvar alanına aktarın ve numune eksizyonundan itibaren 10 dakika içinde numune işlemeye başlayın.

Eksizyondan hemen sonra ameliyathaneden bir sonraki toplu ventriküler miyokard örneği. Buz gibi soğuk CP solüsyonu ile yıkayın ve numuneyi buz gibi soğuk CP tamponunda tutarken tüpte saklayın. Daha sonra ince makas kullanarak endokardiyal fibrotik tabakayı dikkatlice çıkarın.

Miyokard dokusunu, her izolasyon için toplam ventriküler miyokard miktarı 100 miligram ile bir gram arasında olacak şekilde iki ila üç milimetre uzunluğunda küçük parçalar halinde kesin. Parçalar sindirim cihazının sıyırma odasına aktarıldıktan sonra, odadaki CP tamponunu soğuk kalsiyum içermeyen ayrışma tamponu ile değiştirin. Ardından sindirim cihazını termostatik bir banyoya yerleştirin.

Banyoyu 37,5 santigrat dereceye ayarlayın ve açın. Daha sonra sindirim cihazının motorunu açın ve dönüş hızını saniyede bir devire ayarlayın. DB ile üç yıkama döngüsü gerçekleştirin ve haznedeki çözeltiyi her sekiz dakikada bir 37 santigrat derece oksijene doymuş temiz DB ile değiştirin.

Bundan sonra, mililitre başına 250 birim kollajenaz tip beş ve mililitre proteaz başına dört birim ekleyerek bir enzim tamponu hazırlayın. DB çözümüne 24 yazın. Daha sonra mililitre kollajenaz başına 250 birim ekleyerek ikinci enzim tamponunu hazırlayın.

DB çözeltisine beş yazın, EB birini oksijenlendirin ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, biri 37 santigrat derecede olmak üzere üç mililitre% 100 oksijenli EB ile dönen çürütme cihazında 12 dakikalık iki sindirim döngüsü gerçekleştirin. Solüsyonu pipet aspirasyonu ile çıkarın ve her döngüden sonra atın.

Daha sonra, hücre toplama için altı adet 15 mililitrelik tüp hazırlayın ve tamponlardan kaçmak için 80 mililitre dört santigrat derece zanaat demleme çözeltisi hazırlayın, EB ikisini oksijenlendirin ve 37 santigrat dereceye kadar çalıştırın. Daha sonra, 37 santigrat derecede üç mililitre% 100 oksijenli EB iki ile ilk 15 dakikalık bir sindirim döngüsü gerçekleştirin. Sindirim döngüsünden sonra, ilk ilişkili miyositleri içeren çözeltiyi 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve hücre süspansiyonunu 12 mililitre soğuk KB çözeltisi ile seyreltin.

Tüpü oda sıcaklığında düz bir şekilde saklayın, 37 santigrat derecede üç mililitre EB iki ile 12 dakikalık beş sindirim döngüsü daha gerçekleştirin ve her döngüde miyosit içeren tamponu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Toplanan üç mililitre tamponu her döngüde 12 mililitre KB çözeltisi ile seyreltmeyi de unutmayın. Sonunda, altı hücreli tüpleri oda sıcaklığında saklayın.

Bu adımda, 20 mililitre kalsiyum içermeyen tyro tamponuna mililitre sığır serum albümini başına bir miligram ekleyin. Daha sonra çözeltiyi süzün, ardından altı miyosit içeren konik tüpleri 100 peynirde beş dakika santrifüjleyin. Miyositleri çökelmeye zorlamak için, süpernatanı çıkarın ve oda sıcaklığında TB içeren değişken miktarda BSA ile her tüpteki hücreleri yeniden süspanse edin.

Birinci ve ikinci adımlarda litre kalsiyum klorür çözeltisi başına 100 milimolar küçük OTT'ler ekleyerek tampon içeren hücredeki kalsiyum konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Kalsiyum konsantrasyonu sırasıyla litrede 50 mikro azı dişine ve litrede 100 mikro azı dişine yükseltilir. Aşağıdaki kalsiyum ekleme adımları her beş dakikada bir gerçekleştirilir ve konsantrasyon, her adımda litre başına 100 mikromolar artırılarak litre başına 0.9 milimolar'lık bir nihai konsantrasyona yükseltilir.

İzolasyon prosedürünün verimini değerlendirmek için, 0.5 mililitre miyosit içeren çözeltiyi bir mikroskobun cam alt haznesine aktarın. 10 x objektif büyütmede 15 mikroskop alanını değerlendirin ve net çizgilere sahip ve önemli inklüzyonlar içermeyen çubuk şeklindeki hücreler gibi sağlıklı miyositlerin yüzdesini hesaplayın. Aksiyon potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum akışlarının eşzamanlı kayıtları da dahil olmak üzere insan kardiyomiyosit fonksiyonel değerlendirmesini göstermek için beklenen verimler yaklaşık %20 olmalıdır.

İlk olarak, delikli yama konfigürasyonunda yama kelepçesi deneyleri için pipet çözeltisini hazırlayın. Daha sonra kalsiyum içermeyen tb'ye 1.8 milimolar kalsiyum klorür ekleyin. Yama kelepçesi floresan deneyleri sırasında kardiyomiyositlerin süperfüzyonu için çözeltiyi kullanın.

Daha sonra, bir mililitre hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve litre başına 10 mikromolar grip kalesi ve 10 mikrolitre güç yükü ekleyin. Yatay konumda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmiş konsantre edin. Daha sonra, tüpü dikey konuma getirin ve hücreleri beş dakika dinlenmeye bırakın.

Daha sonra süpernatanı pipetleyin ve hücre peletini kalsiyum içeren tb içinde yeniden süspanse edin. 25 mililitre hücre süspansiyonunu sıcaklık kontrollü mikroskoba monte edilmiş küçük bir kayıt odasına aktarın. 37 santigrat derecede dakikada 0,3 mililitre akış hızında ısıtılmış bir mikro fuer sistemi ile yerçekimi ile süper kaynaştırılır.

Bir mikro pipet çektirmesi kullanarak, ps ile doldurulduğunda üç ila beş mikrometre uç çapına ve üç ila 4,5 mega ohm dirence sahip yama kelepçeli pipetler hazırlayın. Bundan sonra, amfoterisin B'yi mililitre başına 250 mikrogramda PS'ye ekleyin ve elektrotları doldurmak için kullanın, ardından elektrodu pipet tutucusuna monte edin. Ardından, net çizgilere sahip ve inklüzyonlardan yoksun Ron şeklindeki hücreyi seçin.

Giga contayı oluşturun ve erişim direnci 20 ohm'un altına düşene kadar beş ila 10 dakika bekleyin. Daha sonra, farklı stimülasyon frekanslarında kısa darbeler kullanarak akım kelepçesi modunda aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarın. Kayıt aşamasında, 492 nanometrede parlak alan aydınlatmasını açın ve 505 ila 520 nanometrede Fluor fort floresansını tespit edin.

Ardından floresan ve membran potansiyel sinyallerini alın. Bu şekil, HCM örneklerinden ventriküler kardiyomiyositlerdeki aksiyon potansiyellerinin değişikliklerini göstermektedir. İşte bir kontrol miyositi ve bir HCM miyositinden 0.2 hertz, 0.5 hertz ve bir hertz'de ortaya çıkan temsili üst üste binen aksiyon potansiyelleri.

Bir kontrol miyositinden 0.5 hertz'de üst üste binen aksiyon potansiyelleri. 10 ila yedi molar izoproterenolün yokluğunda ve varlığında gösterilmiştir ve burada, depolarizasyonlardan erken sonra birkaç spontan depolarizasyon gösteren bir HCM hastasından alınan bir kardiyomiyositin membran potansiyelinin temsili izi görülmektedir. Şekil, HCM örneklerinden ventriküler kardiyomiyositlerdeki kalsiyum geçici değişikliklerini göstermektedir.

Burada, bir kontrol miyositi ve bir HCM hücresindeki yama pipeti aracılığıyla 0.2 hertz'de stimülasyon sırasında ortaya çıkan temsili üst üste binen kalsiyum geçicidir. HCM ve kontrol kardiyomiyositlerindeki kalsiyum geçişlerinin farklı zamanlardaki kinetiği gösterilmiştir ve burada, HCM miyositinde yüksek pacing oranlarında artan diyastolik kalsiyumu vurgulayan, üç farklı frekansta stimülasyon sırasında hücre içi kalsiyumu gösteren temsili uzun izler verilmiştir. Bu şekil, insan ventriküler miyositleri kullanılarak yapılan ek deneysel uygulamaları göstermektedir.

Farklı membran voltajlarında kaydedilen L tipi kalsiyum akımını gösteren temsili üst üste binen izler solda gösterilmiştir ve farklı membran voltajlarında HCM örneklerinden izole edilen 18 hücreden ortalama L tipi kalsiyum akımı tepe yoğunluğu sağda gösterilmiştir ve burada gösterilen, bir hertz'de elektriksel alan stimülasyonu sırasında bir ventriküler miyositten kaydedilen hücre içi kalsiyum izidir. Bu prosedürü denerken, insan ventriküler kardiyomiyositlerini izole etmek için bu prosedürü takiben ses sağlamak için ameliyathaneden örnek alındıktan kısa bir süre sonra prosedüre başlamayı unutmamak önemlidir. Yaşam tarzı konfokal mikroskobu veya immünokimya gibi başka yöntemler de uygulanabilir ve bu, örneğin, membran yapılarının ve kalsiyum salım birimlerinin hücre altı lokalizasyonunun, geliştirildikten sonra kalp hastalıklarında nasıl halter olduğu gibi temel soruları yanıtlamak için çok önemli olacaktır.

Bu teknik, hücresel kardiyolojide ventriküler kardiyomiyositlerdeki fonksiyonel anormallikleri incelemek ve yeni terapötik seçeneklerin potansiyel faydasını test etmek için yolu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan örneklerinden canlı tek kardiyomiyositlerin nasıl izole edileceğini ve farklı koşullarda hücre fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.