Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama
September 29th, 2013
Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir.
Bu prosedürün genel amacı, birincil gen tuzağı raportörü olarak GAL dört, VP 16 ile vektörler üzerinde gen kırma transpoze kullanarak mutant balık üretmektir. Bu, önce gen tuzağı vektörünün uzun iki transpoze ile birlikte zebra balığı embriyolarına enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Enjekte edilen embriyolar, döllenmeden üç gün sonra GFP floresansı için taranır ve en parlak embriyoların yaklaşık% 30'u F sıfır havuzunu oluşturmak için seçilir.
Daha sonra, F sıfır balığı, gen tuzağı olaylarının germ hattı iletimini taramak için U-A-S-M-R-F-P test hattına çaprazlanır. Son adım, F iki neslini oluşturmak için F1'i geçmek ve ters PCR ve beş asal ırk ile gen tuzağı olaylarının moleküler karakterizasyonu için embriyolar üretmektir. Sonuç olarak, taranan her 10 F sıfır balığından biri gen tuzağı dölleri üretmelidir.
Gen kırma transposları, protein kodlayan genlerin girişlerine entegre edildiğinde hiçbir mutasyon üretmeyecek şekilde tasarlanmıştır. GBT vektörlerimiz, birincil gen tuzağı raporlayıcısı olarak G dört P 16'yı kullanır. Bu modifikasyon, düşük seviyelerde eksprese edilen genler için duyarlılığı arttırır ve diğer transgenlerin doku spesifik ekspresyonu için G dört itici güç olarak fenotiplerden aşırı kaçınmadan gen tuzağı mutantlarını kullanmamızı mümkün kılar.
Yöntemimizin ana darboğazının, F zero balığının germ hattında yeterince yüksek gen trapp entegrasyon oranlarına ulaşmak olduğuna inanıyoruz. Bu gösteride, DNA hazırlama, MİKROENKSİYON ve F zero taraması gibi birkaç kritik adımı ele alacağız. GBTB bir gen tuzağı vektörü, birincil gen tuzağı raportörü olarak GAL dört VP 16'yı kullanır.
Gen tuzağı entegrasyonu için uçlarda minimal uzun iki devrik kullanılır. Gen tuzağı olayları, 14 X GAL dört UAS'ın kontrolü altında bir EGFP raportörü tarafından doğrudan tespit edilir. Tüm gen tuzağı kaseti, doğrudan kilitler P bölgeleri ile çevrilidir.
Bu, belirli bir gen tuzağı entegrasyonu ile gözlemlenen bir fenotip arasında bir nedensellik ilişkisinin kanıtını oluşturmak için Cree taraklarının ekspresyonu ile gen tuzağı olaylarını tersine çevrilebilir hale getirir. Ek olarak, U-A-S-E-G-F-P kaseti doğrudan FRT siteleri ile çevrilidir. Çevirmeli tarak mRNA'sının enjeksiyonu, U-A-S-E-G-F-P kasetinin eksizyonuna yol açacak, gen tuzağı mutasyonunu EGFP floresansı ile işaretlenmemiş halde bırakacak ve mikro enjeksiyondan önce GFP floresansı ile belirli dokuları veya gelişimsel olayları işaretleyen transgenik hatlarda kullanılmasını sağlayacaktır.
DNA üzerinde transpoze hazırlayın ve mRNA'yı transpoze edin. GBTB bir gen tuzağı vektör DNA'sını hazırlayın. Standart bir mini hazırlık kiti kullanarak ve üreticinin protokolünü izleyerek, DNA'yı hazırlarken PB yıkama adımını dahil etmek önemlidir.
Aksi takdirde, mini hazırlık DNA'sı RNA'lar tarafından kontamine olur, A transpoze Mr.NA bozulmasına yol açar, RNA'ların serbest suyundaki DNA'yı mikrolitre başına 10 nanograma seyreltir. Uzun iki transpozeyi hazırlamak için, önce mRNA, doğrusallaştırılmış PT, üç, TS, T, iki, xbo bir. Daha sonra, bir modifikasyon ile bir M mesaj makinesi T üç in vitro transkripsiyon kiti kullanarak Doğrusallaştırılmış DNA'yı kopyalayın.
DNA'nın tedavi adımından sonra 0,5 mikrolitre kaburga kilitli RNA inhibitörü ekleyin, standart bir kit kullanarak mRNA'yı saflaştırın ve in vitro transkribe edilen mRNA'nın kalitesini agros jel elektroforezi ile değerlendirin. RNA'ların serbest suyundaki mRNA'yı mikrolitre başına 40 nanograma seyreltin ve mikro enjeksiyondan hemen önce eksi 80 santigrat derecede iki mikrolitre alikot olarak saklayın. İki mikrolitrelik bir transpoze mRNA alikotuna DNA üzerine sekiz mikrolitre seyreltilmiş transpoz ekleyerek enjeksiyon karışımını hazırlayın.
Standart mikroenjeksiyon tekniklerini kullanarak bir hücreli zebra balığı embriyosunun sarısına üç nanolitre D-N-A-R-N-A karışımı enjekte edin, yumurta sarısı küfür arayüzünü hedefleyin: Enjeksiyondan sonra, transpoze mRNA'nın enjeksiyondan yaklaşık altı ila sekiz saat sonra bozulmadığından emin olmak için kalite kontrol için% 1 aros jel üzerinde beş mikrolitre artık enjeksiyon solüsyonu çalıştırın. Döllenmemiş ve ölü embriyoları çıkarın ve embriyoları 100 milimetrelik Petri kabı başına 60 ila 80'e dağıtın. Anormal ve ölü embriyolar, döllenmeden bir gün sonra, döllenmeden iki gün sonra ve döllenmeden üç gün sonra, döllenmeden üç gün sonra, floresan veya dik mikroskop ile donatılmış bir stereo mikroskop altında çıkarılır.
Embriyoları tarayın ve anormal embriyoları çıkarın. Kalan embriyoları açık kusurlar olmadan tarayın. GFP floresansı için en parlak F zero embriyolarını seçin ve bu laboratuvarda standart zebra balığı yetiştirme prosedürlerini kullanarak büyütün.
GBT'ler genellikle vahşi tip veya leopar pigmentasyon desenlerine sahip çizgilere enjekte edilir. Yetiştirme için seçilen enjekte edilen embriyoların %20 ila 30'unun yetişkinliğe kadar hayatta kalmasını beklemek mantıklıdır. GBTB bir gen tuzağı vektörünün entegrasyonu, iki farklı mekanizma ile EGFP ekspresyonuna yol açabilir.
Birincisi gerçek bir gen tuzağı olayıdır. Vektör bir gene entegre olur, bu endojen gen transkriptinin beş asal sayısı ile GAL dördü arasında bir füzyon transkripti olan VP 16 yapılır ve proteinin uç ucunu içeren bir füzyon proteinine çevrilir ve insert mutasyona uğramış gen ve GAL dört, VP 16 ile kaplanır. Bu füzyon proteini 14 XUAS'a bağlanır ve EGFP'nin transkripsiyonunu aktive eder.
Daha az arzu edilen ikinci olay, bir arttırıcı tuzağıdır. EGFP'nin önündeki minimal promotör, entegrasyon sahasının yakınındaki bir geliştiricinin kontrolü altına girer ve GAL dört, VP 16'nın yokluğunda EGFP üretimine yol açar. Bu iki olay sınıfını ayırt etmek için, lense özgü gama kristalin GFP ile işaretlenmiş 14 X-U-A-S-M-R-F-P transgenik çizgi yapıldı.
Gen tuzağı olayları, GBT enjekte edilmiş balıkları homozigot U-A-S-M-R-F-P balıklarıyla çaprazlayarak ve GFP ve RFP'nin birlikte ekspresyonunun taranmasıyla doğrulanır, bu ancak GAL dört, VP 16 yapılır ve transta U-A-S-M-R-F-P'yi aktive ederse mümkündür. GBT enjekte edilen balıklar yabani tip veya leopar pigmentasyon desenlerine sahip olduğundan ve homozigot U-A-S-M-R-F-P çizgisi pirinç bir arka planda olduğundan, F zero balığı U-A-S-M-R-F-P balığından kolayca ayırt edilebilir, bu da taranan F sıfırın erkek mi yoksa dişi mi olduğunu kaydetme ihtiyacını ve ayrıca her bir balığın cinsiyetini kaydetme ve/veya belirleme hatalarından kaynaklanan olası hataları ortadan kaldırır. Ertesi gün.
Pirinç U-A-S-M-R-F-P balığını tanklarına geri koyun. Embriyolar tarama için toplanırken embriyoları veren F zero balığını ayrı ayrı statik tanklara yerleştirin, temizleyin ve toplanan embriyoları sıfırıncı günün öğleden sonra yeni Petri kaplarına aktarın. Döllenmeden bir gün sonra ve döllenmeden üç gün sonra GFP ve RFP floresansı için embriyoları tarayın.
Hem GFP hem de RFP için pozitif olan embriyoları çıkarın, bunları G-F-P-R-F-P ekspresyon modeline göre sıralayın. Bir debriyajda birden fazla desen gözlemlenirse ve F1 neslini oluşturmak için bunları yükseltin. GFP için pozitif olan ancak RFP için pozitif olmayan 3D PF embriyolarının, arttırıcı tuzak olaylarını temsil ettikleri için dışarı çekilmediğini unutmayın.
İkinci bir parti pozitif elde etmek için G-F-P-R-F-P pozitif döl üreten F sıfır balığını tekrar çaprazlayın. F1 balıkları, gen trapp ekspresyon modelini belgelemek ve gen tuzağı lokuslarının moleküler tanımlanması için embriyo gruplarını dondurmak için F iki ailesi oluşturmak üzere taranır: İlk olarak, bireysel F1 balıklarını homozigot U-A-S-M-R-F-P balığı ile ertesi gün çaprazlar. Embriyolar döllenmeden bir gün sonra tarama için toplanırken, embriyoları veren F1 balıklarını ayrı ayrı statik tanklara yerleştirin.
RFP etiketlemesi henüz ortaya çıkmamış olabilir, bu nedenle embriyoları GFP floresansı için tarayın ve döllenmeden üç gün sonra GFP pozitif embriyoları hem GFP hem de RFP floresansı için tarayın ve çift pozitifleri çıkarın. Daha sonra, döllenmeden beş gün sonra hem GFP hem de RFP için pozitif olan embriyoları fotoğraflayın, 20 G-F-P-R-F-P pozitif ve 20 G-F-P-R-F-P negatif embriyo partilerini deneyin, ters PCR ve beş asal ırk ile mutasyona uğramış genlerin tanımlanması için. Başarılı bir enjeksiyonda F iki neslini oluşturmak için kalan G-F-P-R-F-P pozitif embriyoları yükseltin.
Gen tuzağı DNA uzun iki transpoze mRNA karışımı ile enjekte edilen embriyoların en az% 80'i bir dereceye kadar GFP floresan gösterecektir. Düşük GFP ekspresyonu, RNA'ların kontaminasyonu nedeniyle transpoze RNA'nın başarısız enjeksiyonunu veya bozunmasını gösterir. F zero havuzunu oluşturmak için en parlak GFP pozitif embriyolar seçildiğinde, taranan F zero balıklarının yaklaşık 10'da biri, gen tuzağı olaylarının geri kazanıldığı F zero balıkları arasında gen tuzağı dölleri verecektir.
Çoğu, entegrasyonlarda birkaç eksprese olmayan transpoze ek olarak tek bir gen tuzağı olayı iletir. Tüm gen tuzağı kaseti, doğrudan kilit P bölgeleri ile çevrili olduğundan, bu diyagramda mutasyona uğramış genin eksonlarını temsil eden mavi kutularla gösterilen herhangi bir gen tuzağı mutasyonu, CRE taraklarının ekspresyonu ile geri dönüşümlüdür. Bu görüntüler, NSF TP'nin sinir sisteminde GFP ve RFP'nin birlikte ekspresyonunu göstermektedir, Cree RNA'nın altı gen tuzağı hattı enjeksiyonu, N, SF, TP, altı embriyo, GFP ve RFP ekspresyonunun kaybına yol açar.
Lenste GFP ifadesinde beklendiği gibi bir azalma olmadığını unutmayın. Burada özetlenen prosedürlerin çoğu, diğer gen tuzağı ekranlarının yanı sıra TOL iki ve diğer transpozonlarla düzenli transgenez deneylerine uygulanabilir Burada özetlenen gen tuzağı prosedürü ile. Haftada 20 ila 30 F sıfır çıkış çaprazı kurmak, haftada bir gen tuzağının geri kazanılmasına neden olmalıdır.
Bununla birlikte, prosedür kolayca ölçeklendirilebilir.
Genel Bakış
Bu protokol, Gal4-VP16'yı birincil raportör ve GFP/RFP'yi ikincil raportörler olarak kullanarak zebra balıklarında gen tuzağı yer değiştirme mutagenezisini tanımlayan bir yöntemi açıklar. Prosedür, laboratuvar büyüklüğüne göre ölçeklenebilen bir tarama süreci ile GFP ve RFP'yi birlikte eksprese eden gen tuzağı yavrularının tanımlanmasına izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik
- Gelişimsel Biyoloji
- Transgenik Modeller
Arka Plan
- Gen tuzağı yer değiştirme mutagenezisi, spesifik genlerde mutasyon oluşturmak için kullanılan bir tekniktir.
- Gal4-VP16, gen ekspresyonu için hassas bir raportör olarak kullanılır.
- GFP ve RFP, gen tuzağı olaylarını görselleştirmek için kullanılır.
- Yöntem, entegrasyon sırasında istenmeyen mutasyonları en aza indirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Fonksiyonel gen analizi için mutant zebra balıkları üretmek.
- Gen ekspresyonu tespitinin hassasiyetini artırmak.
- Gen tuzağı olayları için güvenilir bir tarama yöntemi kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Gen tuzağı vektörlerinin ve transpozmaz mRNA'nın zebra balık embriyolarına eş zamanlı olarak enjekte edilmesi.
- Döllenmeden sonraki üç günde GFP floresanının taranması.
- Germline geçişini doğrulamak için F0 balıklarının U-A-S-M-R-F-P test hatları ile çaprazlanması.
- Moleküler karakterizasyon için F2 nesli kurmak üzere F1'in dışa çaprazlanması.
Ana Sonuçlar
- En parlak embriyoların yaklaşık %30'u daha ileri analiz için seçildi.
- On F0 balıktan biri gen tuzağı yavrusu üretti.
- Gen tuzağı olayları, GFP ve RFP'nin birlikte eksprese edilmesiyle doğrulandı.
- Gerçek gen tuzağı ve güçlendirici tuzağı da dahil olmak üzere entegrasyon mekanizmaları tanımlandı.
Sonuçlar
- Yöntem, gen fonksiyon çalışmaları için zebra balık mutantlarını etkili bir şekilde üretir.
- Başarılı sonuçlar için yüksek oranlarda gen tuzağı entegrasyonu kritik öneme sahiptir.
- Bu yaklaşım, daha ileri araştırmalar için gen tuzağı olaylarının geri dönüşümlü şekilde işaretlenmesine olanak tanır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
