On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis

Bu prosedürün genel amacı, kimyasal maruziyet veya genetik manipülasyon sonrası C Allergan'ın model organizmasındaki nöronal ve nöromüsküler sinyalizasyon bozukluklarını tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir silikon gofret üzerine mikrokanal deseninin tasarlanması ve aşındırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, PDMS'den bir veya daha fazla mikrokanal dökümü yapmak için silikon kalıp kullanılır.

Ardından, yardımcı bileşenler PDMS kalıba takılır. Sonrasında, solucanların mikrokanal boyunca yüzmeye teşvik edildiklerinde sergiledikleri davranışlar, mikroskoba monte edilmiş bir kamera kullanılarak kaydedilir. Nihayetinde, lokomosyon bir okuma parametresi olarak kullanılarak; kimyasal veya genetik manipülasyon nedeniyle nematodların nöronal ve kas sistemlerindeki değişimleri belirlemek için elektro mikroakışkanlar kullanılır.

Bu tekniğin mevcut tekniklere, özellikle plaka tabanlı davranışsal analizlere göre temel avantajı, solucanın hareket yönünün sıkı bir şekilde kontrol edilebilmesi ve böylece vücut bükülme frekansı, dönme süresi ve yüzme hızı gibi lokomotor davranışların kesin bir şekilde nicelleştirilmesine olanak tanımasıdır. Bu tekniğin etkileri, nöroprotektif özelliklere sahip kimyasal ve genetik faktörlerin taranmasında kullanılabileceği için Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif bozuklukların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu teknikle ilgili fikir, solucanın hareket davranışını nicel bir şekilde analiz edecek yöntemlerin eksik olduğunu fark ettiğimizde ortaya çıkmıştır.

Hareketler istemli ve rastgeledir, bu nedenle karakterize edilmeleri zordur. Bu yüzden, herkesin öğrenebileceği kolay bir yöntem geliştirmek istedik. Ana kalıbı hazırlamak için, üç inçlik bir silikon gofretin önce aseton, ardından metanol içinde 30 saniye boyunca bekletilmesiyle başlayın. Daha sonra gofreti beş dakika boyunca deiyonize su ile durulayın.

Ardından, gofer yüzeyini kurutmak için bir azot püskürtme tabancası kullanın ve ardından goferi bir sıcak plaka üzerinde 120 °C'de iki dakika boyunca ısıtın, silikon goferin yüzeyini 50 watt'ta bir dakika boyunca plazma ile oksitleyin. Şimdi, üç mililitre SU eight 100 fotoresist kullanarak gofer yüzeyini 1.750 RPM'de 40 saniye boyunca spin kaplayın ve ardından kaplanmış goferi bir sıcak plaka üzerinde 65 °C'de ön pişirmeye tabi tutun. 10 dakika sonra, sıcaklığı iki dakika içinde 95 °C'ye yükseltin ve goferi bir saat daha pişirin.

Wafer'ı ısıtıcı plaka üzerinden aldıktan sonra, istenen tasarıma sahip bir fotomaskeyi wafer üzerine yerleştirin. Fotoresist tabakasını 95 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ardından, wafer'ı ısıtıcı plaka üzerinde, ön pişirme işlemi için kullanılan sıcaklık gradyanının aynısını kullanarak son pişirme işlemine tabi tutun.

Wafer'ı SU-8 içerisine daldırın. 10 ila 15 dakika boyunca geliştirici solüsyonla işlem yapın. Tasarım geliştirme işleminin tamamlandığını doğrulamak için wafer'ı izopropanol ile durulayın.

Ardından 30 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Son olarak, gofreti bir azot tabancası ile kurutun ve 120 °C'de kısa bir süre pişirin. Şimdi, hazırlanmış kalıp ana gövdesini ve boş bir silikon gofreti, alüminyum folyo ile kaplanmış iki ayrı Petri kabına yerleştirin.

Ana kalıba ve kaba 20 mililitre PDMS ön polimer, boş gofret kabına ise 15 mililitre ekleyin. Ardından, gofretlerin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için tek kullanımlık ahşap bir aplikatörle gofretlerin üzerine hafifçe bastırın; daha sonra her iki kabın üzerini kapatın ve kürlenmesi için bir gün boyunca bekletin. Gofretler kürlendikten sonra folyoyu çıkarın ve PDMS'i soyarak ayırın.

Ardından, ana kalıptan elde edilen PDMS'teki kanalın her iki ucuna sıvı erişim portları açmak için 2,5 milimetrelik bir Harris unicorn kullanın. Her iki PDMS diskini benzer boyutlarda şeritler halinde kesin. Daha sonra, temiz oda içerisinde kanalı, boş PDMS şeridini ve bir cam lamı plazma oksidasyon cihazına yerleştirin.

Materyalleri 40 watt güçte 40 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Ardından, kanal parçasını ve cam lamı boş şeridin zıt taraflarına yapıştırın ve yapışmanın tamamlanması için materyalleri kenara alın. İki saat sonra, 120 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde, en az altı inç uzunluğundaki iki plastik tüp parçasını delikli rezervuarlara sabitlemek için PDMS ön polimer kullanın.

Devam etmeden önce PDMS'in kürleşmesini bekleyin. Ardından, şırınga bağlantılarına olanak sağlamak için tüplerden birine plastik bir akışkan konnektörü sabitleyin. Şimdi, giriş tüpü ile kanal arasındaki her bir rezervuara 22 gauge yalıtımlı bakır telden üç inçlik parçalar yerleştirin ve telleri daha fazla PDMS ön polimeri ile sabitleyin.

Bu adıma, yeni monte edilmiş mikrokanalı, monitöre bağlı kamerası olan bir mikroskobun XY hareketli tablasına yerleştirerek ve mikrokanal elektrotlarına güç kaynağını bağlayarak başlayın. Mikrokanalın direncinin yaklaşık 0,6 mega ohm olduğunu doğruladıktan sonra, mikrokanalın çıkış tüpünü tek kullanımlık bir şırıngaya takın. Ardından, giriş tüpünün ağzını, M dokuz fizyolojik tamponu içinde süspansiyon halindeki nematod çözeltisine daldırın.

Sıvıyı kanala çekmek için şırınganın içinde negatif basınç uygulayın. Giriş ve çıkış tüplerinin her ikisi de dolduğunda, şırıngayı ve hidrostatik düzeneği ayırın. Bir solucanı kanalın merkezine yerleştirmek için tüplerin birbirine göre yüksekliğini ayarlayarak akışı yönlendirin.

Ardından, mikrokanal içerisinde sıfır akış sağlamak için her iki tüpü aynı yükseklikte düz bir şekilde yerleştirin. Bir elektrotaksi deneyi sırasında solucan örnekleri değiştirilirken, her iki giriş tüpü aynı yüksekliğe getirildikten sonra hâlâ akış varsa, tüplerin birbirine göre yüksekliğinde küçük ayarlamalar yapın. Akışın gerçekten sıfır olduğundan emin olunamadığı durumlarda, elektrik alanının polaritesini değiştirerek solucanın hareketinde bir tersine dönme sağlayabilir ve ardından solucan dönüş yaparken lineer hızını değerlendirebiliriz.

Şimdi güç kaynağını uygun voltaja ayarlayın. Elektrik sinyalini aktive edin ve solucanın alana alışması için bir dakikalık ön maruziyet süresi tanıyın; bir dakika geçtiğinde solucan katoda doğru hareket etmeye başlamalıdır. Kayda başlayın.

Deney tamamlandığında, kanaldaki tüm sıvıyı ve solucanları uzaklaştırın. Hazneyi deiyonize su ile durulayın ve cihazı kuruması için 125 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde bırakın. Bu temsili videoda, yabani tip genç yetişkin nematodların elektro aksı ile solucan takip yazılımından elde edilen konum ve hız çıktıları gösterilmektedir.

Video, katot sağdayken başlar. Cam pipetin görünmesi yaklaşan yön değişimini, ardından pipetin çıkarılması ise sinyali belirtir. Buradaki yön değişimi anında, videodaki solucan için özel solucan takip programının konum-zaman ve anlık hız-zaman çıktılarına ait veriler gösterilmektedir; program, hız eğrisini konum-zaman eğrisinden hesaplamıştır.

Bu kutu grafiği, bir grup vahşi tip ve transgenik hayvandan elde edilen elektro hız verilerini göstermektedir. T transgenik hayvanlar, UNC 54 miyozin ağır zincir geni promotörünün kontrolü altında vücut duvarı kaslarında insan alfa-sinüklein genini eksprese ederler; bu durum protein agregasyonuna neden olur ve vahşi tip hayvanlara göre daha yavaş bir elektro taktik yanıt olarak ortaya çıkar. Yönteme hakim olunduğunda, elektro taksis deneyi uygun şekilde gerçekleştirilirse saatte 20'den fazla solucan analiz edilebilir.

Bu prosedürü uygularken, yalnızca lokomosyonu veya elektriksel duyumu etkileyen mutasyonların ve kimyasalların, elektro taksi analizi ile tespit edilebilecek fenotipler üreteceğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, silikon kalıplamanın nasıl yapıldığı, mikroakışkan kanal düzeneğinin nasıl kurulduğu ve bir elektro taksi analizi kullanılarak N. methuselae'nin lokomosyonunun nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.