On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis Caenorhabditis elegans 'Locomotion
2 Mayıs 2013
Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan yöntemi Caenorhabditis elegans Tarif edilmektedir. Bu yöntem mikroakışkan kanalları içinde hafif elektrik alanlar ("electrotaxis") yanıt solucanlar nörofizyolojik fenomen dayanmaktadır. Mikroakışkan electrotaxis nöronal sağlığı etkileyen faktörler için ekrana bir hızlı, duyarlı, düşük maliyetli ve ölçeklenebilir tekniği olarak hizmet vermektedir.
Bu prosedürün genel amacı, kimyasal maruziyet veya genetik manipülasyonu takiben C Allergan'ın model organizmasındaki nöronal ve nöromüsküler sinyallemedeki anormallikleri tanımlamaktır. Bu, önce bir silikon gofret içine bir mikro kanal deseni tasarlayarak ve aşındırarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, silikon kalıp, PDMS'den bir veya daha fazla mikro kanal dökmek için kullanılır.
Daha sonra aksesuar bileşenleri PDMS kalıbına takılır. Daha sonra, solucanların mikrokanaldan yüzmeleri için uyarılırken davranışları mikroskop monte edilmiş bir kamera kullanılarak kaydedilir. Sonuç olarak, elektro mikroakışkanlar, okuma olarak hareket ile kimyasal veya genetik manipülasyon nedeniyle nematodlar, nöronal ve kas sistemlerindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır.
Bu nedenle, bu tekniğin mevcut tekniklere, özellikle plaka bazlı davranışsal analizlere göre ana avantajı, bu teknikle, solucanın hareket yönünün sıkı bir şekilde kontrol edilebilmesi ve vücut bükülme frekansı, dönme süresi ve yüzme hızı gibi lokomotif davranışlarının kesin bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif bozuklukların tedavisine kadar uzanır, çünkü nöroprotektif özelliklere sahip kimyasal ve genetik faktörleri taramak için kullanılabilir. Bu teknik için ilk olarak, yöntem hareket davranışını nicel bir şekilde analiz etmek için yöntem eksikliği olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi.
Hareket gönüllü ve rastgeledir ve karakterize edilmesi zordur. Bu yüzden herkesin öğrenebileceği kolay bir yöntem oluşturmak istedik: Ana kalıbın başlaması için üç inçlik bir silikon gofreti asetonda ve ardından her biri 30 saniye boyunca metanolde yıkayarak başlayın. Ardından gofreti deiyonize su ile beş dakika durulayın.
Daha sonra, gofret yüzeyini kurutmak için bir nitrojen üfleme tabancası kullanın ve ardından gofretleri iki dakika sonra 120 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde ısıtın, plazma silikon gofretin yüzeyini bir dakika boyunca 50 watt'ta oksitler. Şimdi üç mililitre SU sekiz 100 foto direnç kullanarak gofret yüzeyini 1.750 RPM'de 40 saniye boyunca kaplayın ve ardından kaplanmış gofreti 65 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde önceden pişirin. 10 dakika sonra, sıcaklığı iki dakika içinde 95 santigrat dereceye yükseltin ve gofreti bir saat daha pişirin.
Gofret'i sıcak plakadan çıkardıktan sonra, gofretin üzerine istediğiniz tasarıma sahip bir fotoğraf maskesi yerleştirin. Fotoğraf direncini 95 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ardından, gofretleri, pişirme sonrası önceden pişirilmiş olanla aynı sıcaklık gradyanını kullanarak sıcak bir plaka üzerinde pişirin.
Gofret'i SU sekiz'e daldırın. 10 ila 15 dakika boyunca bir çözelti geliştirin. Tasarım geliştirmenin tamamlandığını onaylamak için gofreti izopropanol ile durulayın.
Daha sonra 30 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Son olarak, gofreti bir nitrojen tabancasıyla kurulayın ve 120 santigrat derecede kısa bir süre pişirin. Şimdi, fabrikasyon ana kalıbı ve boş bir silikon gofreti alüminyum folyo ile kaplı iki ayrı Petri kabına yerleştirin.
Ana kalıba ve tabağa 20 mililitre PDMS pre polimeri ve boş gofret kabına 15 mililitre dökün. Ardından, gofretlerin altındaki hava ceplerini ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir ahşap aplikatörle gofretlerin üzerine hafifçe bastırın ve ardından her iki tabağı da örtün ve kürlenmesi için bir gün bekletin. Gofretler sertleştikten sonra folyoyu çıkarın ve PDMS'yi soyun.
Ardından, ana kalıptan PDMS'deki kanalın her iki ucundaki sıvı erişim portlarını delmek için 2,5 milimetrelik bir Harris tek boynuzlu at kullanın. Her iki PDMS diskini de benzer boyutta şeritler halinde kesin. Ardından temiz bir odada kanalı, boş PDMS şeridini ve bir cam sürgüyü bir plazma oksitleyiciye yükleyin.
Malzemeleri 40 saniye boyunca 40 watt gücünde oksijen plazmasına maruz bırakın. Ardından kanal parçasını ve cam sürgüyü boş şeridin karşı taraflarına yapıştırın ve yapıştırmayı tamamlamak için malzemeleri bir kenara koyun. İki saat sonra, 120 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerindeki delinmiş rezervuarlara en az altı inç uzunluğunda iki parça plastik boru takmak için PDMS pre polimerini kullanın.
Devam etmeden önce PDMS'nin kürlenmesine izin verin. Ardından, şırınga eklerine izin vermek için tüplerden birine akışkan plastik bir konektör takın. Şimdi, giriş borusu ile telleri daha fazla PDMS ön polimeri ile sabitleyen kanal arasındaki her bir rezervuara üç inç uzunluğunda 22 gauge yalıtımlı bakır tel yerleştirin.
Bu adıma, yeni monte edilmiş mikro kanalı, bir monitöre bağlı monte edilmiş bir kamera ile bir mikroskobun XY hareketli aşamasına yerleştirerek başlayın, güç kaynağını mikro kanal elektrotlarına bağlayın. Mikrokanalın direncinin 0,6 mega ohm civarında olduğunu onayladıktan sonra, mikrokanalın çıkış tüpünü tek kullanımlık bir şırıngaya takın. Daha sonra, giriş borusunun ağzını, M dokuz fizyolojik tampon içinde süspanse edilmiş bir nematod çözeltisine batırın.
Sıvıyı kanala aspire etmek için şırınganın içine negatif basınç uygulayın. Giriş ve çıkış borularının her ikisi de dolduğunda, şırıngayı ve hidrostatik bağlantıyı kesin. Kanalın ortasına bir solucan yerleştirmek için tüplerin göreceli yüksekliğini ayarlayarak akışı manipüle edin.
Ardından, mikrokanal içinde sıfır akışı korumak için her iki tüpü de aynı yükseklikte düz bir şekilde yerleştirin. Bir elektro taksi deneyi sırasında solucan örneklerini değiştirirken, her iki giriş tüpünü de aynı yüksekliğe düzleştirdikten sonra, hala akış varsa, tüpün birbirine göre yüksekliğinde küçük ayarlamalar yapın. Akışın gerçekten sıfır olup olmadığından emin olmazsak, elektrik alanının polaritesini değiştirerek ve ardından solucanın kendi etrafında dönerken doğrusal hızını değerlendirerek solucanın hareketinde bir tersine dönüşe neden olabiliriz.
Şimdi güç kaynağını uygun voltaja ayarlayın. Elektrik sinyalini etkinleştirin ve solucanın tarlaya alışması için bir dakikalık ön maruziyete izin verin, bu süre zarfında solucan dakika geçtiğinde katoda doğru hareket etmeye başlamalıdır. Kayda başla.
Deney bittiğinde, kanaldaki tüm sıvıyı ve solucanları çıkarın. Hazneyi deiyonize suyla durulayın ve cihazı kuruması için 125 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde bırakın. Bu temsili videoda, vahşi tip bir genç yetişkin nematod elektro ekseni ve solucan izleme yazılımından alınan konum ve hız çıktıları gösterilmektedir.
Video sağdaki katot ile başlıyor. Cam pipetin görünümü, pipet sinyallerinin daha sonra çıkarılması ve ardından geri dönüşü gösterir. Buradaki tersine dönme anı, solucan için özel solucan izleme programının konuma karşı zaman ve anlık hıza karşı zaman çıktıları videoda programın konum zaman eğrisinden hesaplanan hız eğrisi gösterilmektedir.
Bu kutu çizimi, bir dizi vahşi tür ve hendek genci hayvandan gelen elektro hız verilerini görüntüler. T transgenik hayvanlar, protein agregasyonuna neden olan ve vahşi tip hayvanlara göre daha yavaş bir elektro taktik yanıt olarak kendini gösteren UNC 54 miyozin ağır zincir gen promotörü kontrolü altında vücut duvarı kaslarında insan alfa-sinüklein genini eksprese eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, elektro taksi deneyi düzgün bir şekilde yapılırsa her saat 20'den fazla solucan test edilebilir.
Bu prosedürü denerken, yalnızca hareketi veya elektros hissini etkileyen mutasyonların ve kimyasalların, elektro vergi tahlili tarafından tespit edilebilen fenotipler üreteceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir silikonun nasıl desenleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mikroakışkan kanalı ve bir axxis testi kullanarak N yönteminin hareketini nasıl analiz edeceğimizi bir araya getirdik.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Caenorhabditis elegans'ta isteğe bağlı lokomosiyonu indüklemeye yönelik yarı otomatik bir mikro-elektro-sıvı yöntemi açıklar. Teknik, nöronal sağlığı etkileyen faktörlerin hızlı bir şekilde taranmasına izin veren elektrotaksis fenomeninden yararlanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikrofluidik
- Davranış Analizi
Arka Plan
- Caenorhabditis elegans, nöronal ve nöromüsküler sinyallemeyi incelemek için bir model organizmadır.
- Elektrotaksis, elektrik alanlarına karşı bir nörofizyolojikal tepkidir.
- Mikrofluidik kanallar, küçük organizmalar üzerinde kontrollü deneyler sağlar.
- Lokomosiyonun anlaşılması, nöronal sağlık hakkında bilgiler verebilir.
Çalışmanın Amacı
- Nöronal ve nöromüsküler sinyallemedeki anormallikleri tanımlamak.
- Kimyasal maruziyetin veya genetik manipülasyonun etkilerini değerlendirmek.
- Lokomosiyonu nöronal ve kas değişiklikleri için bir okuma olarak kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Silikon yongalara mikrokanal desenleri tasarlamak ve kazımak.
- Silikon kalıplar kullanılarak PDMS'den mikrokanalların dökülmesi.
- PDMS kalıbına aksesuar bileşenlerin takılması.
- Mikroskop montajlı bir kamera kullanarak solucan davranışı kaydetmek.
Ana Sonuçlar
- Elektrotaksis kullanılarak C. elegans'ta lokomosiyonun başarılı bir şekilde indüksiyonu.
- Nöronal ve kas sistemlerindeki değişikliklerin tanımlanması.
- Mikrofluidik elektrotaksinin ölçeklenebilir bir tarama yöntemi olarak gösterilmesi.
- Genetik ve kimyasal manipülasyonların etkileri hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Mikrofluidik elektrotaksis, nörobilim araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, nöronal sağlığı incelemek için düşük maliyetli ve hassas bir yaklaşım sağlar.
- Dahası uygulamalar, nöromüsküler bozuklukların anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
