On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis Caenorhabditis elegans 'Locomotion

Bu prosedürün genel amacı, kimyasal maruziyet veya genetik manipülasyonu takiben C Allergan'ın model organizmasındaki nöronal ve nöromüsküler sinyallemedeki anormallikleri tanımlamaktır. Bu, önce bir silikon gofret içine bir mikro kanal deseni tasarlayarak ve aşındırarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, silikon kalıp, PDMS'den bir veya daha fazla mikro kanal dökmek için kullanılır.

Daha sonra aksesuar bileşenleri PDMS kalıbına takılır. Daha sonra, solucanların mikrokanaldan yüzmeleri için uyarılırken davranışları mikroskop monte edilmiş bir kamera kullanılarak kaydedilir. Sonuç olarak, elektro mikroakışkanlar, okuma olarak hareket ile kimyasal veya genetik manipülasyon nedeniyle nematodlar, nöronal ve kas sistemlerindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

Bu nedenle, bu tekniğin mevcut tekniklere, özellikle plaka bazlı davranışsal analizlere göre ana avantajı, bu teknikle, solucanın hareket yönünün sıkı bir şekilde kontrol edilebilmesi ve vücut bükülme frekansı, dönme süresi ve yüzme hızı gibi lokomotif davranışlarının kesin bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif bozuklukların tedavisine kadar uzanır, çünkü nöroprotektif özelliklere sahip kimyasal ve genetik faktörleri taramak için kullanılabilir. Bu teknik için ilk olarak, yöntem hareket davranışını nicel bir şekilde analiz etmek için yöntem eksikliği olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi.

Hareket gönüllü ve rastgeledir ve karakterize edilmesi zordur. Bu yüzden herkesin öğrenebileceği kolay bir yöntem oluşturmak istedik: Ana kalıbın başlaması için üç inçlik bir silikon gofreti asetonda ve ardından her biri 30 saniye boyunca metanolde yıkayarak başlayın. Ardından gofreti deiyonize su ile beş dakika durulayın.

Daha sonra, gofret yüzeyini kurutmak için bir nitrojen üfleme tabancası kullanın ve ardından gofretleri iki dakika sonra 120 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde ısıtın, plazma silikon gofretin yüzeyini bir dakika boyunca 50 watt'ta oksitler. Şimdi üç mililitre SU sekiz 100 foto direnç kullanarak gofret yüzeyini 1.750 RPM'de 40 saniye boyunca kaplayın ve ardından kaplanmış gofreti 65 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde önceden pişirin. 10 dakika sonra, sıcaklığı iki dakika içinde 95 santigrat dereceye yükseltin ve gofreti bir saat daha pişirin.

Gofret'i sıcak plakadan çıkardıktan sonra, gofretin üzerine istediğiniz tasarıma sahip bir fotoğraf maskesi yerleştirin. Fotoğraf direncini 95 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ardından, gofretleri, pişirme sonrası önceden pişirilmiş olanla aynı sıcaklık gradyanını kullanarak sıcak bir plaka üzerinde pişirin.

Gofret'i SU sekiz'e daldırın. 10 ila 15 dakika boyunca bir çözelti geliştirin. Tasarım geliştirmenin tamamlandığını onaylamak için gofreti izopropanol ile durulayın.

Daha sonra 30 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Son olarak, gofreti bir nitrojen tabancasıyla kurulayın ve 120 santigrat derecede kısa bir süre pişirin. Şimdi, fabrikasyon ana kalıbı ve boş bir silikon gofreti alüminyum folyo ile kaplı iki ayrı Petri kabına yerleştirin.

Ana kalıba ve tabağa 20 mililitre PDMS pre polimeri ve boş gofret kabına 15 mililitre dökün. Ardından, gofretlerin altındaki hava ceplerini ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir ahşap aplikatörle gofretlerin üzerine hafifçe bastırın ve ardından her iki tabağı da örtün ve kürlenmesi için bir gün bekletin. Gofretler sertleştikten sonra folyoyu çıkarın ve PDMS'yi soyun.

Ardından, ana kalıptan PDMS'deki kanalın her iki ucundaki sıvı erişim portlarını delmek için 2,5 milimetrelik bir Harris tek boynuzlu at kullanın. Her iki PDMS diskini de benzer boyutta şeritler halinde kesin. Ardından temiz bir odada kanalı, boş PDMS şeridini ve bir cam sürgüyü bir plazma oksitleyiciye yükleyin.

Malzemeleri 40 saniye boyunca 40 watt gücünde oksijen plazmasına maruz bırakın. Ardından kanal parçasını ve cam sürgüyü boş şeridin karşı taraflarına yapıştırın ve yapıştırmayı tamamlamak için malzemeleri bir kenara koyun. İki saat sonra, 120 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerindeki delinmiş rezervuarlara en az altı inç uzunluğunda iki parça plastik boru takmak için PDMS pre polimerini kullanın.

Devam etmeden önce PDMS'nin kürlenmesine izin verin. Ardından, şırınga eklerine izin vermek için tüplerden birine akışkan plastik bir konektör takın. Şimdi, giriş borusu ile telleri daha fazla PDMS ön polimeri ile sabitleyen kanal arasındaki her bir rezervuara üç inç uzunluğunda 22 gauge yalıtımlı bakır tel yerleştirin.

Bu adıma, yeni monte edilmiş mikro kanalı, bir monitöre bağlı monte edilmiş bir kamera ile bir mikroskobun XY hareketli aşamasına yerleştirerek başlayın, güç kaynağını mikro kanal elektrotlarına bağlayın. Mikrokanalın direncinin 0,6 mega ohm civarında olduğunu onayladıktan sonra, mikrokanalın çıkış tüpünü tek kullanımlık bir şırıngaya takın. Daha sonra, giriş borusunun ağzını, M dokuz fizyolojik tampon içinde süspanse edilmiş bir nematod çözeltisine batırın.

Sıvıyı kanala aspire etmek için şırınganın içine negatif basınç uygulayın. Giriş ve çıkış borularının her ikisi de dolduğunda, şırıngayı ve hidrostatik bağlantıyı kesin. Kanalın ortasına bir solucan yerleştirmek için tüplerin göreceli yüksekliğini ayarlayarak akışı manipüle edin.

Ardından, mikrokanal içinde sıfır akışı korumak için her iki tüpü de aynı yükseklikte düz bir şekilde yerleştirin. Bir elektro taksi deneyi sırasında solucan örneklerini değiştirirken, her iki giriş tüpünü de aynı yüksekliğe düzleştirdikten sonra, hala akış varsa, tüpün birbirine göre yüksekliğinde küçük ayarlamalar yapın. Akışın gerçekten sıfır olup olmadığından emin olmazsak, elektrik alanının polaritesini değiştirerek ve ardından solucanın kendi etrafında dönerken doğrusal hızını değerlendirerek solucanın hareketinde bir tersine dönüşe neden olabiliriz.

Şimdi güç kaynağını uygun voltaja ayarlayın. Elektrik sinyalini etkinleştirin ve solucanın tarlaya alışması için bir dakikalık ön maruziyete izin verin, bu süre zarfında solucan dakika geçtiğinde katoda doğru hareket etmeye başlamalıdır. Kayda başla.

Deney bittiğinde, kanaldaki tüm sıvıyı ve solucanları çıkarın. Hazneyi deiyonize suyla durulayın ve cihazı kuruması için 125 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde bırakın. Bu temsili videoda, vahşi tip bir genç yetişkin nematod elektro ekseni ve solucan izleme yazılımından alınan konum ve hız çıktıları gösterilmektedir.

Video sağdaki katot ile başlıyor. Cam pipetin görünümü, pipet sinyallerinin daha sonra çıkarılması ve ardından geri dönüşü gösterir. Buradaki tersine dönme anı, solucan için özel solucan izleme programının konuma karşı zaman ve anlık hıza karşı zaman çıktıları videoda programın konum zaman eğrisinden hesaplanan hız eğrisi gösterilmektedir.

Bu kutu çizimi, bir dizi vahşi tür ve hendek genci hayvandan gelen elektro hız verilerini görüntüler. T transgenik hayvanlar, protein agregasyonuna neden olan ve vahşi tip hayvanlara göre daha yavaş bir elektro taktik yanıt olarak kendini gösteren UNC 54 miyozin ağır zincir gen promotörü kontrolü altında vücut duvarı kaslarında insan alfa-sinüklein genini eksprese eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, elektro taksi deneyi düzgün bir şekilde yapılırsa her saat 20'den fazla solucan test edilebilir.

Bu prosedürü denerken, yalnızca hareketi veya elektros hissini etkileyen mutasyonların ve kimyasalların, elektro vergi tahlili tarafından tespit edilebilen fenotipler üreteceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir silikonun nasıl desenleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mikroakışkan kanalı ve bir axxis testi kullanarak N yönteminin hareketini nasıl analiz edeceğimizi bir araya getirdik.