Hücre içi Ca Ölçme ^{2 + Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu}

Bu prosedürün genel amacı, insan spermindeki hücre içi kalsiyum dalgalanmalarını floresan boyalarla ölçmektir. Bu, önce sperm örneğinin swim-up yöntemiyle hazırlanması ve gerekirse kapasitasyonun teşvik edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, spermi bir kalsiyum floresan boya ile yüklemektir.

Daha sonra, geleneksel florometri durdurulmuş akış florometrisi, akış sitometrisi veya tek hücreli görüntüleme kullanarak, deneyi gerçekleştirin ve kalsiyum ölçümlerini kaydedin. Sonuç olarak, sonuçlar, progesteron tarafından tetiklenen veya kapasitasyon işlemi sırasında hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarındaki değişiklikleri belirlemek için analiz edilir. Bu tekniğin radyoaktivite içeren yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bunun çok hassas bir prosedür olmasıdır.

Güvenli ve gerçekleştirmesi kolaydır. Bu yöntem, hücre içi kalsiyumu indükleyen bileşiklerin tanımlanması, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle artışlar ve bir siemen örneğindeki farklı hücresel alt popülasyonların tanımlanması gibi SPR kalsiyum sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, akış sitometrisi tekniğinin kullanılmasının sonuçları, erkek gamlarının fizyolojik durumunun analizi yoluyla doğurganlık sorunlarının teşhisine kadar uzanır.

Bu yöntem, insan sperminin kalsiyum mobilizasyonu çalışmasına ilişkin içgörüler sağlayabilse de, diğer türlerden erkek gamları gibi diğer hücre türlerine veya nöronlar veya kas hücreleri gibi farklı hücre türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi kullanan bireyler mücadele edeceklerdir çünkü sperm kullanımı kolay değildir ve deney yoluyla canlı ve motor hücreler elde etmek için uygun koşulların sağlanması önemlidir. Bu tekniklerin kullanımını, farklı alanları kullanarak stratejileri birleştirerek hayata geçirdik.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü numunenin hazırlanması ve işlenmesinin yanı sıra bileşiklerin eklenmesinin öğrenilmesi zordur, çünkü işlem sırasında sperm hücreleri zarar görebilir ve bileşiklerin baskısı sırasında yanıtlardaki artefaktlar elde edilebilir. Sperm örneğini hazırlamak için, her 500 mikrolitre sıvılaştırılmış meninin üzerine bir mililitre jambon F 10 ortamı dikkatlice yerleştirilmelidir. Eloqua, mikro pipetin ucuyla tüpün duvarına dokunun ve ortamı numunenin üzerine nazikçe dağıtın.

Numune ve orta katmanların karıştırılmasını önlemek için yavaş yapmak çok önemlidir. Ortam, iki milimolar kalsiyum klorür ve mililitre başına beş miligram BSA ile desteklenir. İn vitro kapasitasyonu teşvik etmek için, tüpleri dikkatlice yaklaşık 30 derecelik bir açıyla eğin.

Bu, iki sıvı arasındaki yüzey alanını artıracak, böylece inkübasyon sırasında sperm hücrelerinin numuneden ortama yer değiştirmesini veya yüzmesini artıracaktır. Ardından, yağsız test tüplerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörün içine yerleştirin. Bir saat sonra bir saat boyunca% 95 hava.

Her tüpten şimdi motil spermatozoa içeren jambon F 10 ortamının üst 700 mikrolitresini dikkatlice çıkarmak için bir mikro pipet kullanın. Toplanan tüm numuneleri kabarcık oluşumunu önleyerek tek bir temiz cam tüpte toplayın. 10 mikrolitre havuzlanmış numuneyi bir makula sayma odası tabanının optik düz camına yerleştirin ve kapak camını yerleştirin.

Yanlış hücre sayımına neden olacağından, haznenin içinde kabarcık oluşumunu önlediğinizden emin olun. 20 x objektif ile donatılmış bir bileşik mikroskop altında gözlemleyin. Makula sayma odasının kapak camı, 100 küçük kareden oluşan büyük bir kareye sahiptir.

10 karelik herhangi bir şeritteki hücreleri sayın. Bu sayı, mililitre başına milyonlarca hücre cinsinden hücre konsantrasyonunu temsil eder. Sayımı iki ek 10 kare şerit halinde tekrarlayın ve hücreleri floresan boya ile yüklemek için üç sayımın ortalamasını hesaplayın.

1.5 mililitrelik bir füge tüpünde, gerekli sperm süspansiyonu hacmini, iki mikromolar grip oh 3:00'nin nihai konsantrasyonunu elde etmek için yeterli miktarda sperm süspansiyonu ile birleştirin, oh 3:00, 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve tüpten korunun, tüpü beş dakika boyunca 750 G'de santrifüjleyin. Bir pelet yerine bir bulutun oluşması, hücrelerin iyi durumda olduğunu, süpernatanı aspire edip attığını ve peleti uygun insan sperm ortamı veya HSM hacminde yeniden süspanse ettiğini gösterir. Bu deneye başlamak için, düz tabanlı bir cam tüpte, 570 mikrolitre HSM ve 30 mikrolitre sperm hücresi süspansiyonunu daha önce grip oh 3:00 ile yüklenmiş ve mililitre başına 10 ila sekizinci hücre elde etmek için HSM'de yeniden süspanse edilmiş olarak birleştirin.

Cam tüpün içine manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tüpü önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış spektometrenin okuma odasına yerleştirin. Numune, alım süresi boyunca karıştırılmalıdır. Oli yazılımını kullanarak deneyi başlatın ve 300 saniye boyunca 0,5 hertz frekansında floresan değerleri elde etmeye devam edin.

30 saniye boyunca bazal floresan elde ettikten sonra, bu durumda 100 saniyede mikromolar progesteron için uygun hacimde test bileşiğini enjekte etmek için bir Hamilton Mikro şırınga kullanın. Maksimum floresan değerini elde etmek için pozitif kontrol olarak 20 mikromolar iyon misininde. Bu deneyde, hücre içi kalsiyum değişiklikleri yüksek zamansal çözünürlükle ölçülmektedir.

Kuduz kinetik optik sisteme bağlı bir SFM 20 durdurulmuş akış karıştırıcısı kullanarak, alet şırıngalarından birini bir mililitre griple doldurun. 03:00 yüklü sperm hücreleri ve test edilecek bileşiğin bir mililitresi olan ikinci şırınga. HSM'de çözünen 20 mikromolar progesteron.

Bu örnekte, sıvıları şırıngalara çekerken kabarcık oluşumunu önlemek çok önemlidir. Her iki alet pistonunu da şırınga pistonlarının ucuna değene kadar kaldırın. Hücre hasarını en aza indirmek için bu durumda toplam örnekleme süresini 50 saniyeye ve frekansı 10 milisaniyeye ayarlayın, akış hızını ölçülebilir bir yanıt tetikleyicisi sağlayacak minimum değere ayarlayın.

Reaktiflerin karıştırılması, kekiğe karşı ham floresan izi bilgisayar ekranında görüntülenecektir. Akış sitometrisinden önce progesteronu negatif kontrol olarak HSM ve pozitif kontrol olarak 10 mikromolar iyon misin ile değiştirerek bu prosedürü tekrarlayın. Test edilecek her koşulda sitometre tüpü başına 500 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirerek deney örneklerini hazırlayın.

Ekipman yazılımını kullanarak bir deney oluşturun. İlk olarak, yeni bir klasör, deney örneği ve tüp sayısı oluşturun. Ardından sabah 3:00'te grip için uygun sitometre ayarlarını seçin. Floresein izotiyosiyanat ve propidyum iyodür filtrelerini kullanın.

Sitometrede boyanmamış kontrol tüplerini bir ve iki çalıştırın. Eşik ayarlarının uygun olduğunu doğrulamak ve hücrelerden kalıntıları ayırt etmek için ilgili geçidi oluşturmak için ileri ve yan saçılma verilerini toplayın. Deney tüplerini çalıştırın ve numune başına 10.000 olaydan floresan verileri toplayın.

Sonunda. Tüm verileri analiz için mevcut yazılıma aktarın. Her bir kapak fişinin ortasına beş mikrolitrelik bir damla poli L lizin çözeltisi uygulayarak bu prosedür için gerekli olan yuvarlak kapak fişlerini hazırlayın.

Kullanmadan önce en az bir saat bekletin, tedavi edilen alanı suyla durulayın. Bu, fazla polilizini uzaklaştıracak ve kamçıları hala hareket edebilirken sperm hücrelerinin başlarından kapak kaymasına yapışmasına izin verecektir. Kapak fişini kayıt odasının içine monte edin.

10 mikrolitre grip oh 03:00 yüklü hücreleri, mililitrede 10 ila yedinci hücrelerin bir katı konsantrasyonda yerleştirin. Kapak kaymasının ortasında. Hücreleri 200 mikrolitre ön ısıtma HSM ile örtün.

Odayı, önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış mikroskop sahnesine yerleştirin ve faz kontrastını kullanarak hücreleri görüntüleyin. Hücre yoğunluğunun görüntüleme için uygun olduğu bir alan seçin. Çok fazla hücre, çakışan sinyaller nedeniyle analizi zorlaştırır.

Hücreler, başlarıyla kapak kızağına sıkıca tutturulmalı, ancak canlılığı doğrulayan kamçı hareketi sergilemelidir. Zaman serisi görüntü alma yazılımını etkinleştirerek deneyi başlatın. Tipik olarak, görüntü başına iki milisaniyelik bir aydınlatma ile saniyede dört görüntü gerekir.

Canlı modda floresan görüntüler elde edin. Odağı ve parlaklığı ayarlamak için. Bu durumda test bileşiği progesteronu dikkatlice damla damla eklemek için bir mikro pipet kullanın ve gerektiği gibi görüntü alımına devam edin.

Aynı odaya iki ardışık kontrol ilavesi gerçekleştirin. Maksimum floresan elde etmek için 20 mikromolar iyon misin ve minimum floresan elde etmek için beş milimolar manganez klorür. IQ yazılımını kullanarak görüntü analizini çevrimdışı olarak gerçekleştirin.

Her hücrenin veya hücrenin bir bölümünün etrafına ilgi alanlarını veya ROI'leri çizin. Ek olarak, yazılım tarafından otomatik arka plan çıkarma için hücresiz bir alan seçin. Daha sonra her ROI için bir zaman floresan yoğunluğu serisi elde edilir ve bu veriler daha fazla analiz için Microsoft Excel'e aktarılabilir.

Progesteron, bilinen akrozom reaksiyon indükleyicilerinden biridir ve beklendiği gibi, geleneksel florometri ile ölçüldüğü gibi insan sperminde geçici bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışını tetikler. Zamana karşı kırmızı floresan izi, negatif bir kontrol HSM'si eklendiği için dört mikromolar progesteronun eklenmesinin neden olduğu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerini gösterir, bu da pozitif bir kontrol olarak mavi floresan izi ile gösterildiği gibi hücre içi kalsiyum konsantrasyon seviyelerinde herhangi bir değişikliğe neden olmaz. Her iz için 10 mikromolar iyon misinin neden olduğu değişiklik gösterilir.

Bu kalsiyum iyonoforun eklenmesi, bazal seviyelere geri dönmeyen maksimum RA hücresel kalsiyum konsantrasyonu artışına neden olur. Bu çubuk grafik, her koşuldan floresan delta F'deki ortalama değişimi, N'nin üçe eşit olduğu ve yıldız işaretinin kontrole kıyasla 0,001'den daha düşük bir P değerini gösterdiği artı veya eksi standart hatayı gösterdi. Progesteronun neden olduğu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışı, durdurulmuş akış florometrisi ile daha büyük zamansal çözünürlükle ölçüldü ve temsili sonuçlar burada gösterilmiştir.

Ham izler panel A'da gösterilmiştir, hem kırmızı çizgi ile temsil edilen progesteron hem de mavi çizgi ile temsil edilen iyon misin, hızlı bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışına neden olmuştur. Yeşil iz, hücrelerin HSM ile karıştırıldığı negatif kontroldür. Panel B, kontrol sinyalinin karşılık gelen ham sinyallerinden çıkarılmasıyla elde edilen progesteron veya iyon misin ile indüklenen sinyaller için düzeltilmiş izleri gösterir.

Progesteron, indüktörün eklenmesinden 2.7 saniye sonra meydana gelen maksimum floresan değeri ile çok hızlı ve geçici bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışına neden oldu. Öte yandan, CIN, 50 saniye boyunca hızlı ve sürekli bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışına neden oldu. Panel B'deki iç kısım, her yanıt için ilk 500 milisaniyenin genişletilmiş bir görünümünü gösterir.

Progesteronun neden olduğu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışında bir gecikme olmaması, progesteronun ara sinyalleme olmaksızın kalsiyum kanalı kedi mahmuzunu doğrudan aktive ettiğini düşündüren önceki raporlarla tutarlıdır. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu, akış sitometrisi kullanılarak kapasitif ve kapasitif olmayan insan sperminde de ölçüldü. Bu temsili ileri ve yan dağılım grafiklerinde.

Kapasite edilmiş hücreler mavi, kapasitif olmayan hücreler kırmızı renktedir. Seçilen kapı mavi çizgi ile gösterilir ve daha fazla analiz için yalnızca o alandaki hücreler kullanılır. Panel B, Fitzy kanalındaki boyanmamış, spermatozoadan floresan histogramını gösterir ve panel D, Panel D'de gözlemlendiği gibi grip oh 03:00 lekeli spermatozoadan FZ kanalındaki floresan histogramını gösterir.

Panel C, boyanmamış hücrelerden PI kanalındaki floresan histogramını gösterir ve panel E, ölü hücrelerden PI kanalındaki floresan histogramını gösterir. Her bir hücre için floresan değerleri, burada gösterilen iki boyutlu floresan nokta grafiklerinde gözlemlenebilir. Lekelenmemiş hücreler ve grip oh 03:00 ve pi ile çift lekeli hücreler için, her kadranda kaydedilen hücrelerin yüzdesi kırmızı sayı ile gösterilir.

Daha da önemlisi, ölü hücrelerden kaynaklanan sinyal ortadan kaldırılabilir. Son olarak, tek sperm hücrelerinde progesteronun neden olduğu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişimi, bu temsili psödocolor görüntülerin görüntülenmesiyle ölçüldü ve progesteron, CIN ve manganez klorür ilavelerinin başında ve sonrasında görselleştirilen hücreleri gösterdi. Progesteron ilavesi, hem sperm kafasında hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda bir artışa neden olur hem de lum manganez klorür gribi azaltmak için kullanılır.

Oh 03:00 Deneyden dokuz ayrı hücrenin temsili normalleştirilmiş floresan izlerini söndürerek floresan bu şekilde gösterilmiştir. Popülasyon deneylerinde gözlemlendiği gibi, tek hücre analizi, progesteron ve iyon misin için sırasıyla geçici ve sürekli bir artış ortaya çıkardı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hücrelerin canlılığını doğrulamayı ve bu prosedürü takiben uygun kontrolleri yapmayı unutmamak önemlidir. Elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler, geliştirildikten sonra bir proppe solüsyonu ve simülasyon protokolleri kullanılarak kalsiyum artışlarında rol oynayan spesifik iyon kanallarının tanımlanması gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, hücre fizyolojisi alanındaki araştırmacıların, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip canlı hücrelerdeki kalsiyum dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, cevaplamak istediğiniz belirli soruya bağlı olarak, herhangi bir hücre tipinde floresan dy kullanarak hücre içi kalsiyum artışlarını ölçmek için en uygun tekniği nasıl seçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İnsan siemen örnekleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve sağlığı kanıtlanmış bağışçıların kullanılması gibi önlemlerin tehlikeli olabileceğini unutmayın. İşlem sırasında lateks kürelerin kullanılması ve bu işlem yapılırken her zaman çözelti ve malzemelerin uygun şekilde atılması gerekir.