Hücre içi Ca Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, floresan boyalar kullanarak insan sperm hücrelerindeki hücre içi kalsiyum dalgalanmalarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle sperm örneğinin swim-up yöntemiyle hazırlanması ve gerekirse kapasitasyonun teşvik edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise spermlerin kalsiyum floresan boyası ile yüklenmesidir.

Ardından, geleneksel florometri, durdurulmuş akış florometrisi, akış sitometrisi veya tek hücre görüntüleme kullanarak deneyi gerçekleştirin ve kalsiyum ölçümlerini kaydedin. Nihayetinde, progesteron tarafından tetiklenen veya kapasitasyon süreci sırasında meydana gelen hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarındaki değişiklikleri belirlemek için sonuçlar analiz edilir. Bu tekniğin, radyoaktivite içerenler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça hassas bir prosedür olmasıdır.

Uygulanması güvenli ve kolaydır. Bu yöntem, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle hücre içi kalsiyum artışını indükleyen bileşiklerin tanımlanması ve bir semen örneğindeki farklı hücresel alt popülasyonların belirlenmesi gibi SPR kalsiyum sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, akış sitometrisi tekniğinin kullanılmasının getirdiği imkanlar, erkek gametlerin fizyolojik durumunun analizi yoluyla fertilite sorunlarının teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, insan sperm hücrelerinin kalsiyum mobilizasyonunun incelenmesine dair bilgiler sağlayabilse de, diğer türlerin erkek gametleri gibi farklı hücre tiplerine veya nöronlar ya da kas hücreleri gibi farklı hücre türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi kullanan kişiler, spermle çalışmanın kolay olmaması ve deney boyunca canlı ve hareketli hücreler elde etmek için uygun koşulların korunmasının kritik önem taşıması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Biz, farklı alanlardan stratejileri birleştirerek bu tekniklerin kullanımını hayata geçirdik.

Sperm hücrelerinin prosedür sırasında zarar görebilmesi ve bileşiklerin eklenmesi sırasında yanıtlarda artefaktlar oluşabilmesi nedeniyle; numunenin hazırlanması ve taşınmasının yanı sıra bileşiklerin eklenmesinin öğrenilmesi zordur, bu nedenle bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir. Sperm numunesini hazırlamak için, her 500 microliter sıvılaşmış semen üzerine bir mililitre hams F 10 medyumuna dikkatlice katman yapılmalıdır. Mikropipetin ucuyla tüpün duvarına dokunun ve medyumu numunenin üzerine nazikçe boşaltın.

Örnek ve besiyeri katmanlarının karışmasını önlemek için işlemin yavaşça yapılması kritik öneme sahiptir. Besiyeri, 2 mM kalsiyum klorür ve 5 mg/mL BSA ile takviye edilmiştir. In vitro kapasitasyonu teşvik etmek için tüpleri dikkatlice yaklaşık 30 derecelik bir açıya eğin.

Bu işlem iki sıvı arasındaki yüzey alanını artıracak, böylece inkübasyon sırasında sperm hücrelerinin örnekten ortama yer değiştirmesini veya yukarı doğru yüzmesini kolaylaştıracaktır. Ardından, eğik test tüplerini 37 °C, %5 karbondioksit ve %95 hava içeren bir inkübatöre bir saat süreyle yerleştirin.

Hareketli spermatozoalar içeren hams F 10 besiyerinin üstteki 700 microliters kısmını her tüpten dikkatlice almak için bir mikro pipet kullanın. Kabarcık oluşumunu önleyerek, toplanan tüm örnekleri tek bir temiz cam tüpte birleştirin. Birleştirilen örnekten 10 microliters miktarını bir maküler sayım hücresi tabanının optik düz camına yerleştirin ve üzerini lamel cam ile kapatın.

Hücre sayımının hatalı sonuçlanmaması için hazne içinde kabarcık oluşumundan kaçındığınızdan emin olun. 20 x objektifli bir bileşik mikroskop altında gözlemleyin. Maküler sayım haznesinin lamının üzerinde, 100 küçük kareden oluşan büyük bir kare bulunur.

Herhangi bir 10 karelik şeritteki hücreleri sayın. Bu sayı, mililitre başına milyon hücre cinsinden hücre konsantrasyonunu temsil eder. Sayımı iki ek 10 karelik şeritte daha tekrarlayın ve hücreleri floresan boya ile yüklemek için üç sayımın ortalamasını hesaplayın.

Gerekli hacimdeki sperm süspansiyonunu, final konsantrasyonu 2 µM Fluo-3 AM olacak şekilde yeterli miktarda 1 mM Fluo-3 AM stok çözeltisi ile 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde birleştirin; 37 °C'de, ışıktan korunmuş olarak 30 dakika inkübe edin ve tüpü 750 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Pelet yerine bulut şeklinde bir oluşum görülmesi, hücrelerin iyi durumda olduğunu gösterir; süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın ve peleti uygun hacimdeki insan sperm ortamı (HSM) içerisinde yeniden süspanse edin. Deneye başlamak için, düz tabanlı bir cam tüpde 570 µL HSM ve daha önce Fluo-3 AM yüklenmiş ve mL başına 1 × 10⁸ hücre olacak şekilde HSM içinde yeniden süspanse edilmiş 30 µL sperm hücresi süspansiyonunu birleştirin.

Cam tüpün içerisine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin ve tüpü, 37 °C'ye önceden ısıtılmış spektrometrenin okuma bölmesine yerleştirin. Örnek, veri toplama süresi boyunca karıştırılmalıdır. oli yazılımını kullanarak deneyi başlatın ve 300 saniye boyunca 0,5 Hz frekansta floresan değerlerini toplamaya geçin.

30 saniye boyunca bazal floresans değerleri elde edildikten sonra, 100. saniyede uygun hacimdeki test bileşiğini (bu durumda mikromolar progesteron) enjekte etmek için bir Hamilton mikro şırıngası kullanın. Maksimum floresans değerini elde etmek için pozitif kontrol olarak 20 mikromolar ionomycin kullanın. Bu deneyde, hücre içi kalsiyum değişimleri yüksek zamansal çözünürlükle ölçülmektedir.

Hızlı kinetik optik sisteme bağlı bir SFM 20 durdurulmuş akış karıştırıcısı kullanarak, cihaz şırıngalarından birini bir mililitre flu. 3:00 AM yüklü sperm hücreleri ile, ikinci şırıngayı ise test edilecek bileşik olan HSM içinde çözünmüş 20 micromolar progesteronun bir mililitresi ile doldurun.

Bu örnekte, sıvıları şırıngalara çekerken hava kabarcığı oluşumunu önlemek kritik öneme sahiptir. Her iki cihaz pistonunu, şırınga pistonlarının ucuna değene kadar kaldırın. Hücre hasarını minimize etmek için toplam örnekleme süresini 50 saniye, frekansı 10 milisaniye olarak ayarlayın; akış hızını ise ölçülebilir bir yanıt tetikleyicisi sağlayacak minimum değere getirin.

Reaktiflerin karıştırılmasının ardından, ham floresan izi zamana karşı bilgisayar ekranında görüntülenecektir. Akış sitometrisi öncesinde, progesteron yerine negatif kontrol olarak HSM ve pozitif kontrol olarak 10 µM ionmycin kullanarak bu prosedürü tekrarlayın. Test edilecek her koşul için her bir sitometre tüpüne 500 µL hücre süspansiyonu yerleştirerek deneysel örnekleri hazırlayın.

Ekipman yazılımını kullanarak bir deney kurulumu yapın. İlk olarak yeni bir klasör, deney örneği ve tüp sayısı oluşturun. Ardından, flu O 3:00 AM için uygun sitometre ayarlarını seçin. Fluorescein isothiocyanate ve propidium iodide filtrelerini kullanın.

Boyanmamış kontrol tüpleri bir ve ikisini sitometrede çalıştırın. Eşik ayarlarının uygun olduğunu doğrulamak ve kalıntıları hücrelerden ayırt etmek için ilgili kapıyı (gate) oluşturmak amacıyla ileri ve yan saçılım verilerini toplayın. Deneysel tüpleri çalıştırın ve örnek başına 10.000 olaydan floresan verisi toplayın.

Son aşamada, tüm verileri analiz için mevcut olan yazılıma aktarın. Her bir lamelin merkezine beş µL poly L lysine çözeltisi damlatarak, bu prosedür için gerekli olan yuvarlak lamel camlarını hazırlayın.

Kullanmadan önce en az bir saat bekletin ve ardından işlem görmüş alanı suyla durulayın. Bu işlem, fazla polilizinle temizleyerek sperm hücrelerinin baş kısımlarıyla lamelle yapışmasını, kamçıları ise hareket etmeye devam edebilmesini sağlayacaktır. Lameli kayıt odasının içerisine yerleştirin.

10⁷ hücre/mL konsantrasyondaki flu oh 3:00 AM yüklü hücrelerden 10 µL'yi lamelin merkezine yerleştirin. Hücrelerin üzerini 200 µL önceden ısıtılmış HSM ile kaplayın.

Hazneyi, 37 °C'ye önceden ısıtılmış mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreleri faz kontrastı kullanarak inceleyin. Görüntüleme için hücre yoğunluğunun uygun olduğu bir alan seçin. Çok fazla hücre olması, sinyallerin üst üste binmesi nedeniyle analizi zorlaştırır.

Hücreler, baş kısımlarıyla lamelne camına sıkıca tutunmuş olmalı ancak canlılığı onaylayan kamçı hareketini sergilemelidir. Zaman serisi görüntüleme yazılımını etkinleştirerek deneye başlayın. Tipik olarak, görüntü başına iki milisaniyelik bir aydınlatma ile saniyede dört görüntü gereklidir.

Canlı modda floresan görüntüler edinin. Odağı ve parlaklığı ayarlayın. Bir mikropipet kullanarak test bileşiğini (bu durumda progesteron) dikkatlice damla damla ekleyin ve görüntü elde etme işlemine gerektiği şekilde devam edin.

Aynı hazneye sırayla iki kontrol eklemesi yapın. Maksimal floresans elde etmek için 20 micromolar ion mycin ve minimal floresans elde etmek için five millimolar manganese chloride ekleyin. IQ yazılımını kullanarak çevrimdışı görüntü analizi gerçekleştirin.

Her bir hücrenin veya hücrenin bir bölümünün etrafına ilgi alanlarını veya ROI'leri çizin. Ayrıca, yazılım tarafından otomatik arka plan çıkarma işlemi için hücre içermeyen bir alan seçin. Ardından, her bir ROI için bir zaman floresan yoğunluk serisi elde edilir ve bu veriler daha ileri analizler için Microsoft Excel'e aktarılabilir.

Progesteron, bilinen akrozom reaksiyonu indükleyicilerinden biridir ve beklendiği üzere, konvansiyonel florometre ile ölçüldüğü üzere insan sperminde geçici bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışına neden olur. Kırmızı floresans izi, zamana karşı dört mikromolar progesteron eklemesinin neden olduğu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişimlerini göstermektedir; negatif kontrol olarak eklenen ve mavi floresans izinde belirtildiği üzere hücre içi kalsiyum konsantrasyon seviyelerinde herhangi bir değişime yol açmayan HSM kullanılmıştır. Pozitif kontrol olarak, 10 mikromolar ionomycin tarafından indüklenen değişim her bir iz için gösterilmiştir.

Bu kalsiyum ionoforunun eklenmesi, bazal seviyelere geri dönmeyen maksimum RA hücresel kalsiyum konsantrasyonu artışına neden olur. Bu sütun grafiği, N değerinin üç olduğu her durum için floresans delta F'deki ortalama değişimi artı veya eksi standart hata ile göstermiş olup, yıldız işareti kontrole kıyasla 0,001'den küçük bir P değerini belirtmektedir. Progesteronun tetiklediği hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışı, durdurmalı akış florometrisi ile daha yüksek zamansal çözünürlükte ölçülmüştür ve temsili sonuçlar burada gösterilmiştir.

Panel A'da ham izler gösterilmiştir; hem kırmızı çizgi ile temsil edilen progesteron hem de mavi çizgi ile temsil edilen ion mycin, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda hızlı bir artışa neden olmuştur. Yeşil iz, hücrelerin HSM ile karıştırıldığı negatif kontroldür. Panel B, kontrol sinyalinin ilgili ham sinyallerden çıkarılmasıyla elde edilen, progesteron veya ion mycin ile indüklenen sinyallere ait düzeltilmiş izleri göstermektedir.

Progesteron, indüktörün eklenmesinden 2,7 saniye sonra maksimum floresan değerine ulaşan, çok hızlı ve geçici bir hücre içi kalsiyum konsantrasyon artışına neden olmuştur. Öte yandan CIN, 50 saniye boyunca hızlı ve kalıcı bir hücre içi kalsiyum konsantrasyon artışına yol açmıştır. Panel B'deki ek görsel, her bir yanıt için ilk 500 milisaniyenin genişletilmiş bir görünümünü göstermektedir.

Progesteronun tetiklediği hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artışında bir gecikmenin olmaması, progesteronun ara sinyalleşme olmaksızın kalsiyum kanalı CatSper'i doğrudan aktive ettiğini öne süren önceki raporlarla uyumludur. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu, kapasite olmuş ve kapasite olmamış insan spermlerinde akış sitometrisi kullanılarak da ölçülmüştür. Bu temsili ileri ve yan saçılım grafiklerinde.

Kapasite kazanmış hücreler mavi, kapasite kazanmamış hücreler ise kırmızı renktedir. Seçilen kapı mavi çizgi ile belirtilmiştir ve sonraki analizler için yalnızca bu alan içindeki hücreler kullanılmıştır. Panel B, Boyanmamış spermatozoaların Fitzy kanalındaki floresan histogramını göstermekte ve Panel D, Panel D'de gözlemlendiği üzere flu oh 3:00 AM ile boyanmış spermatozoaların FZ kanalındaki floresan histogramını göstermektedir. Mavi iz ile temsil edilen kapasite kazanmış spermlerin floresan değerlerinin dağılımı, kırmızı iz ile temsil edilen kapasite kazanmamış spermlere kıyasla daha yüksek değerlere kaymıştır.

Panel C, boyanmamış hücrelerin PI kanalındaki floresan histogramını; panel E ise ölü hücrelerin PI kanalındaki floresan histogramını göstermektedir. Her bir hücreye ait floresan değerleri, burada sunulan iki boyutlu floresan nokta grafiklerinde (dot plot) gözlemlenebilir. Boyanmamış hücreler ile flu oh 3:00 AM ve pi ile çift boyanmış hücreler için her bir kadranda kaydedilen hücre yüzdesi kırmızı rakamla belirtilmiştir.

Önemli bir nokta olarak, ölü hücrelerden kaynaklanan sinyal ortadan kaldırılabilir. Son olarak, progesteronun tetiklediği hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişimi, tekil sperm hücrelerinde görüntüleme yoluyla ölçülmüştür; bu temsili yalancı renkli görüntüler, hücrelerin başlangıçta ve progesteron, CIN ve manganez klorür eklemelerinden sonraki durumlarını göstermektedir. Progesteron eklemesi, hem sperm başındaki hem de lumindeki hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda bir artışa neden olur; manganez klorür ise fluoresan sinyalini azaltmak için kullanılır.

Söndürme yoluyla floresan ölçümünün saat 3:00'deki verilerine ait, deneydeki dokuz ayrı hücreden elde edilen temsili normalize edilmiş floresan izleri bu şekilde gösterilmiştir. Popülasyon deneylerinde gözlemlendiği gibi, tek hücre analizi progesteron için geçici, ionomycin için ise kalıcı bir artış ortaya çıkarmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde üç ila dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, hücrelerin canlılığının doğrulanması ve prosedürün ardından uygun kontrollerin gerçekleştirilmesi önemlidir. Geliştirilmesinin ardından, uygun solüsyonlar ve simülasyon protokolleri kullanılarak, kalsiyum artışlarında rol oynayan spesifik iyon kanallarının belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hücre fizyolojisi alanındaki araştırmacıların yaşayan hücrelerdeki kalsiyum dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, yanıtlamak istediğiniz spesifik soruya bağlı olarak, herhangi bir hücre tipinde floresan boya kullanarak hücre içi kalsiyum artışlarını ölçmek için en uygun tekniği nasıl seçeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan semen örnekleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve sağlıklı olduğu kanıtlanmış donörlerin kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken lateks eldiven kullanımı ile solüsyon ve malzemelerin uygun şekilde bertaraf edilmesi gibi önlemler her zaman alınmalıdır.