Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

Bu prosedürün genel amacı, retinal protez güvenliğinin değerlendirmesini iyileştirmektir. Bu işlem, ilk olarak optimal şekilde fikse edilmiş enükle edilmiş bir gözün yüzeyinin, implante edilmiş bir elektrodun konumunu belirtmek amacıyla doku boyaları ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, elektrot dizisi çıkarılır ve göz dokusu şeritler halinde diseke edilir.

Ardından şeritler agarda stabilize edilir ve daha sonra parafine gömülür. Son adımda, işaretlenen ilgi alanları kesitlenir ve boyama için lamlar üzerine toplanır. Nihayetinde, her bir elektroda komşu implantlanmış bölgelerin sağlığı, parlak alan ve immünofloresan mikroskopi ile değerlendirilebilir.

Bu tekniğin temel avantajı, fiksasyonla ilişkili artefakt ve delaminasyonun minimize edilebilmesi ve aynı zamanda geniş örneklerde elektrot bitişiğindeki doku bölgelerinin doğru şekilde takip edilebilmesidir. Ayrıca, diğer göz hastalıkları için yeni implantların güvenliğinin değerlendirilmesinde de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, retinanın delaminasyona eğilimli olması ve örneklerin işlenmesi için yüksek düzeyde el becerisi gerektirmesi nedeniyle bu işlemi zorlayıcı bulacaklardır.

Hassas dokunun işaretlenmesi ve işlenmesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önem taşımaktadır. Bu çalışmadan önce, suprakoroidal elektrot dizisi implantasyonunun ardından gözler, yıldızla belirtildiği üzere optimal olmayan bir teknik kullanılarak işlenmiştir. Bu ilk görüntü, elektrot dizisi boşluğu boyunca temsilci bir ortogonal kesiti göstermektedir.

Retinanın dış göz dokusundan ayrıldığını fark edin. Bu durum, ok ucuyla belirtildiği üzere, özellikle implantlanan bölgenin altında belirgindir. Ayrıca, retinanın hangi kısmının dizideki her bir elektroda komşu olduğunun belirlenmesinin mümkün olmadığını not edin.

Bu daha yüksek büyütmede, ok uçlarıyla belirtildiği gibi retinal tabakalarda salınım temelli birçok düzenli artefaktın yanı sıra, kedi gözündeki yansıtıcı tabaka olan torpedo tabakasından meydana gelen büyük bir ayrılma görülmektedir. Daha fazla büyütme yapıldığında, fotoreseptörlerin dış segmentlerinin ve pigmente epitelyumun ise bozulmadan kaldığı gözlemlenebilir; bu durum, daha önce gözlemlenen ayrılmaların in vivo travma veya patolojiden kaynaklanmak yerine, işlemleme sürecinin artefakt benzeri yan etkileri olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, fiksasyonla ilişkili bu artefaktları ve delaminasyonu en aza indirmek için aşağıdaki teknik uygulanmıştır.

Nükleasyon ve tespit işlemlerinin ardından, implante edilmiş bir göz küresini etanolden çıkararak başlayın ve konjunktiva ile tendon kapsülü dahil olmak üzere fazla dokuları dikkatlice kesin. Optik siniri iki ila üç milimetre uzunluğunda olacak şekilde kısaltın. Elektrot dizisi, yarı saydam sklera üzerinden görülebilmektedir.

Ardından, elektrotları önceden belirlenmiş bir renk koduyla işaretlemek için ince uçlu bir boya fırçası kullanarak dokuya dikkatlice histolojik boyalar uygulayın. Boyayı dağıtmamaya özen gösterin. İlgi noktalarını belirlemek veya kesitlerin hizalanmasına yardımcı olmak için ek boya işaretlemeleri yapılabilir.

Burada, maksimum düzeyde stimüle edilen elektrotlar yeşil ile işaretlenmiştir. Diğer aktif elektrotlar kırmızı ile işaretlenmiştir. Daha büyük çaplı dönüş elektrotları sarıya boyanmış, ek kılavuzlar veya anatomik işaretlemeler ise mavi boya ile işaretlenmiştir.

Beş dakika boyunca havada kuruttuktan sonra, boyayıyehidrate etmek için küreyi %70 ethanol içine geri koyun. Ardından, az önce gösterildiği gibi ekilmemiş kontrol göz küresindeki fazla dokuları tıraşladıktan sonra, nukleasyon ve fiksasyon adımında takılan sekiz naylon sütürü, kontrol ve implante gözleri aynalanmış bir çift olarak hizalamak için kullanın. Daha sonra, elektrot dizisiyle aynı boyutlara sahip bir silikon şablonu, kontrol gözündeki, implante gözdeki dizinin konumuna karşılık gelen aynalanmış konuma yerleştirin.

Ardından, her bir implant elektrot bölgesinin anatomik olarak karşılaştırılabilir bir konumda bir kontrol çiftine sahip olması için, kontrol küresini az önce gösterildiği şekilde etiketleyin. Sonrasında, implant dizisini gözden çıkarın ve ardından kornea, iris ve lensi kapsayan gözün ön kısmını uzaklaştırın. Daha sonra, kalan göz çukurundaki vitreus sıvısını boşaltın.

Şimdi implante edilmiş gözü, her biri kalıpla işaretlenmiş bölgelerin bir kısmını içeren, iki milimetre kalınlığında birden fazla şeride ayırın. Şeritlerin yönü, dokunun implanta verdiği yanıtın çeşitli yönlerinin değerlendirilmesine yardımcı olacak şekilde seçilmeli; kalıp işaretlerinin örnekler üzerindeki konumları, gelecekte başvurmak üzere dikkatlice belgelenmelidir.

Ardından, şeridi önce kesilecek tarafı aşağıya bakacak şekilde sıvılaştırılmış agarın sığ bir havuzuna yerleştirin. Agar donduğunda, örneğin etrafından kesin ve köpük destekli bir doku kasetine yerleştirin. Kontrol gözünü disseke edip gömdükten sonra, kasetleri nötr tamponlu formine yerleştirin ve standart bir otomatik 12 saatlik parafin işleme tekniği ile gece boyunca işleme tabi tutun.

Ertesi gün, işlenmiş dokuyu, önce kesilecek tarafı aşağı bakacak şekilde parafine gömün. Ardından, parafin bloklarını beş mikron kalınlığında kesitler halinde kesin. Son olarak, boyanmış bölgelerin her birinden alınan kesitleri lamlar üzerine monte edin.

DY bölgesini tespit etmek için lamları düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin. Skleradaki her boyanmış noktanın hemen bitişiğindeki bölgeler, dizideki ilgili elektroda en yakın olan bölgeler olacaktır. Son olarak, kesitleri isteğe bağlı olarak boyayın.

Yüksek dinamik aralık. Davidson fiksatif ile fikse edilmiş ve elektrot dizisi henüz çıkarılmamış enükle edilmiş bir kedi gözünün, in situ suprakoroidal elektrot dizisini içeren makro fotoğrafları gösterilmiştir. Yarı saydam sklera, dizideki münferit elektrotların görüntülenmesini sağlamaktadır.

Ok başıyla belirtildiği gibi, elektrotlar önceden tanımlanmış bir boya renk şemasıyla işaretlenmiştir. Anatomik işaret noktalarından düzenli aralıklarla yerleştirilen bu boya işaretleri, deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için kullanılır. Elektrot dizisi çıkarıldıktan sonra göz, elle örnek şeritler halinde diseke edilir.

Ok başları, sklera üzerindeki elektroda komşu iki bölgeyi göstermektedir. Kesikli çizgi, önceki şekildeki örneğin kesilmesiyle elde edilen bu temsili kesitteki kesit düzlemini belirtmektedir; örnek şeridinin genel şekli, minimum diferansiyel doku artefaktı ile korunmuştur. Ok başlarıyla gösterildiği üzere, her iki boya işareti de sklera üzerinde hala görünür durumdadır.

Yeşil boya kırmızıya göre daha dayanıklı olsa da, boyanın konumu bir elektrodun yerini belirtmektedir. Bu nedenle, komşu retinal doku, elektriksel stimülasyonun neden olduğu olası hasarlar açısından değerlendirilebilir; bu büyütmede görüldüğü üzere, önceki görüntüde izlenen yeşil boyaya komşu retinal tabakalar aslında ayrılmamıştı ve retinal morfoloji burada korunmuştu. Mevcut protokole göre işlenen retinal doku kesitlerinin temsili özel boyamaları ve immünohistokimyası bu ilk görüntüde gösterilmiştir.

Hematin hücre çekirdeklerini maviye boyarken, eozin hücre sitoplazmasını, kolajeni ve destek dokusunu pembenin çeşitli tonlarına boyadı. Bu görüntüde, luxol fast blue myelini maviye boyamıştır. Kreatal viyole karşıt boyası, perikaryon içindeki Nissl cisimciklerini maviye boyayarak ve çevredeki uydu hücreleri belirginleştirerek ganglion hücrelerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu Masson's trichrome blue işlem görmüş kesitte, BRIC Scarlet asit füzyon çözeltisi kas liflerini kırmızıya boyarken, anilin mavisi kolajeni maviye boyamıştır.

Bu vakada, bu kesit için skleranın periyodik asit Schiff ile boyanmasıyla bazal membranın glikoprotein bileşenleri ve bağ doku bileşenleri mor görünürken, hematoksilin karşı boyamasıyla hücre çekirdekleri mavi görünmektedir. Bu görüntüde gösterilen subskleral kesit, hemoraji bölgesinde Pearl's Prussian blue ile işlenmiştir. Degrade olmuş eritrositlerden hemosiderin oluşumu ve demir komplekslerinin salınımı mor bir renk meydana getirmiştir.

Bu görüntüde nötral kırmızı eklenmesi lizozomları kırmızıya boyamış, anti glutamin sentetaz ise boyanmıştır. Mueller hücrelerinde bulunan ve yeşil renkte görülen bu nörotransmitter yıkıcı enzim, iç nükleer tabaka içindeki Mueller hücre gövdeleriyle ve iç sınırlayıcı membranı oluşturan Mueller hücresi uç ayaklarıyla her iki yöne doğru uzanır. Nörofilament proteininin boyanması için, hücre somasında ve uzantılarında bulunan bu ağır zincirli hücre iskeleti proteini yeşil ile işaretlenmiştir; nörofilament proteini, nöronların yapısını korumak için diğer nörofilamentlerle çapraz bağlar kurar.

Kedi retinasında, ganglion hücreleri ve aksonları ganglion hücresi ve sinir lifi tabakalarında gözlemlenebilirken, iç nükleer tabakanın dış sınırında yer alan horizontal hücrelerin aksonları yeşil görünür. Bu son görüntüde, gliyal fibriler asidik protein kırmızı renkte gösterilmiştir; bu hücre iskeleti proteini, gliyoz sırasında Müller hücreleri ve astrositlerde çoğalır ve sinir lifi tabakasını astarladığı görülür; Müller hücreleri ise içten dış retina tabakalarına doğru ince uzantılar oluşturur. Mavi renkteki DPI ile karşıt boyama, retina tabakalarının görselleştirilmesini sağlar.

Bu prosedürü uygularken, örnek iş akışını üç boyutlu olarak görselleştirmek ve prosedür boyunca örneklerin yönelimini düzenli olarak göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, geliştirme aşamasından sonra güvenlikle ilgili ek soruları yanıtlamak için tüm histolojik yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, biyonik göz geliştirme alanındaki araştırmacıların, görme engelli hastalar için uzun vadeli güvenli stimülasyon seviyelerini değerlendirmelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bir biyonik göz implantının güvenliğinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.