Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Aşağıdaki deneyin genel amacı, özellikle seçilmiş modifiye litik bakteriyofajlar kullanarak metisilin dirençli (MRSA) ve metisilin duyarlı (MSSA) staphylococcus aureus suşlarını ayırt etmektir. Bakteriler litik fajların uzun esnek kuyruklarına tutunduğunda, tutunan hücreler ile sensör yüzeyi arasındaki mesafe, QCm'nin akustik dalga penetrasyonundan daha büyük olur. Bu nedenle, bağlanma olayının sinyali oluşmaz.

Sağlam faji sferoid ile değiştirmek, QC m'nin akustik dalga penetrasyon derinliği içinde bakterilere bağlanan kısa kuyruklu ve tam fonksiyonel fajlar ile sonuçlanır; bu nedenle faji steroidleri A-Q-C-M-D kristaline yerleştirilip karışık bakteri süspansiyonuna maruz bırakıldığında frekans ve sönümlenme değişimlerine katkıda bulunur. Bunlar, staphylococcus aureus'un hem MRSA hem de MSSA suşlarına bağlanır ancak diğer bakterilere bağlanmaz; böylece kristal yüzeyindeki staphylococcus aureus'u diğer bakterilerden ayırır. Son olarak, MRSA'ya özgü PPP iki A antikor bağlı boncuklar eklendiğinde, staphylococcus aureus'un MRSA suşlarının varlığında bir sinyal oluşturulur. Bu tekniğin PCR gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajları, DNA ekstraksiyonu gerektirmemesi ve empiriklere karşı hassas olmamasıdır.

Bu yöntem, staphylococcus orus taraması ve dezenfeksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer antibiyotiğe dirençli bakterilere de uygulanabilir. Biyosensörlerin üretimi hassasiyet, doğruluk ve sabır gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. İşleme, altın kaplı kuvars parçaların Argonne cihazında 10 dakika boyunca plazma aşındırma ile temizlenmesiyle başlayın; ardından parçaları steril bir kabin içinde UV ışığı altında altı saat boyunca sterilize edin. Sterilizasyondan sonra, steril bir Petri kabı içindeki her bir parçanın altın yüzeyine 50 µL fage süspansiyonu ekleyin ve parçaları oda sıcaklığındaki nemli bir haznede gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, titrasyon için kalan fage süspansiyonunu uzaklaştırın, ardından bağlanmamış fagları temizlemek için her bir kuvars parçayı PBS ile beş kez yıkayın.

Kuru bir yüzey üzerindeki immobilize faji enfektivitesini test etmek için öncelikle, bir gece boyunca kültüre edilmiş staphylococcus aureus'u bir NZY eRate üzerine yayın ve süspansiyonun kurumasına izin verin. Ardından, immobilize faj içeren altın kaplı kuars parçayı yüzü plakaya gelecek şekilde yerleştirin. 37 °C'de 12 saat sonra, enfektiviteyi belirten bir lizis zonu gözlemlenebilir; bu yöntem, sıvı ortamdaki serbest fajın litik aktivitesini test etmek için kullanılabilir.

İlk olarak, dört adet 300 mililitrelik yan kollu erlenin her birine 10 mililitre NZY içerisinde gecelik staphylococcus aureus bakteriyel kültürü ekleyin. Ardından, flakonlardan ikisine mililitre başına iki x 10⁶ PFU serbest faj ekleyin. Şimdi, her bir flakon için 30 dakikalık aralıklarla optik yoğunluk ölçümü yaparak staphylococcus hücre lizisinin zaman seyrini 570 dakika boyunca izleyin ve 24. saatte son bir ölçüm yapın.

Sıvı ortamdaki bağlı fajın litik aktivitesini test etmek için, az önce gösterilen adımları tekrarlayın ancak serbest faj yerine, deney flasklarına bağlı faj içeren altın parçacıkları ekleyin. Faj steroidlerini hazırlamak için önce, oda sıcaklığında bir mililitrelik bir viyale 400 µL stok faj 1 2600 süspansiyonu ile eşit hacimde spektrofotometrik saflıkta kloroform karıştırın. Ardından, faj kloroform süspansiyonunu bir dakika boyunca, beş saniyelik aralıklarla beş ila altı kez hafifçe vorteksleyin.

Süspansiyonun 30 saniye boyunca stabilize olmasına izin verdikten sonra, steroid süspansiyonunu içeren üst fraksiyonu toplayın. Steroid süspansiyonundan birkaç mikrolitreyi, transmisyon ve taramalı elektron mikroskobisi için 500 mikrolitre hacmindeki bir viyale aktarın. Geriye kalan steroid süspansiyonunu biyosensör üretimi için bir mililitrelik bir viyale kaydedin.

Biyosensörü hazırlamak için öncelikle, QCMD sensörlerini bir plazma temizleyicide 10 dakika boyunca argon ile plazma aşındırma işlemine tabi tutarak temizleyin. Ardından, organik safsızlıkları gidermek için sensörleri heksan ile durulayın. Sonrasında, film terazisinin bir haznesini, Olson ve ark. tarafından Journal of Microbiological Methods'ta daha önce açıklandığı şekilde temizleyin.

Bir LB teknesi alt faz çözeltisi ile doldurulur ve tekne bariyeri ile temizlenir. Ardından tekne, 20 °C'de 10 dakika boyunca stabilize edilir. Şimdi, kısmen alt fazın içine daldırılmış eğimli bir cam çubuk yardımıyla, 300 µL faj 1 2600 sulu süspansiyonunu dikkatlice damlatarak LB alt faz çözeltisi üzerinde bir faj tek tabakası oluşturun. Tek tabakasının 10 dakika boyunca stabilize olmasına izin verdikten sonra, 19 N/m'lik sabit bir basınca ulaşılana kadar tek tabakasını dakikada 30 mm hızla sıkıştırın.

Dikey film biriktirme, bu prosedürün en zor kısmıdır. Başarıyı sağlamak için, bu prosedürün tüm bileşenlerinin temiz olduğundan emin olunmalı ve ayrıca tek tabaka biriktirme parametreleri optimize edilmelidir. Dikey bir film biriktirme işlemi gerçekleştirmek için sensörü, dakikada 4.5 milimetre hızla, art arda yedi kez tek tabakanın içine daldırıp çıkarın.

Dik konumlandırılmış QCMD sensörünün üzerine. Dikey film biriktirme, bozulmamış fajı biyosensör yüzeyine bağlar. Son olarak, hem serbest hem de bağlı fajların MRSA tespiti, elektron mikroskopisi ve el optometrisi için üretilen faj biyosensörlerini kullanın.

Bu adıma, qof T yazılımını kullanarak QCM sensörünün su içindeki baz çizgilerini, rezonans frekansını ve enerji dissipasyonunu belirleyerek başlayın. Yaklaşık 30 dakika sonra, canlı metisilin duyarlı staphylococcus aureus veya MSSA bakteri hücrelerinin su içindeki süspansiyonunu test hücresinden geçirin. Mavi çizgi frekans değerini, kırmızı çizgi ise enerji dissipasyon seviyesini göstermektedir.

Yatay çizgiler baz çizgisinin oluşturulduğunu göstermektedir. Ekranın ortasındaki iki sayısı, olayların sensörle ilgili olduğunu belirtir. Dördü arasından iki numara, gösterilen birinci armonik için sensörlerin rezonans frekansı ve enerji sönümlenmesindeki değişimleri sürekli olarak izler.

Bakteriler test hücresinden geçtikten sonra meydana gelen değişimler burada gösterilmiştir. Sensörlerin rezonans frekansındaki değişimler ve iç enerji kaybı doygunluk seviyelerine ulaştığında, PVP antikor konjuge latekslerin süspansiyonunun akışa verilmesiyle frekansın düşmesi ve enerji kaybının artması sadece birkaç saniye sürer; ardından frekans kaybının sürekli izlenmesine devam edilir. Burada; baz çizgilerinin oluşturulmasını, bakteri eklenmesinden sonra frekans ve enerji kaybında meydana gelen birkaç saniyelik değişimi, doygunluğu ve son olarak boncukların eklenmesinden sonraki değişimleri içeren tüm tespit süreci gösterilmektedir.

Bu tablo, faj spot testi ile belirlendiği üzere, MRSA suşları da dahil olmak üzere test edilen tüm S reus suşlarına karşı gösterilen faj litik aktivitesini göstermektedir. Plak boyutları genel olarak beş ile 15 milimetre arasında değişmiştir. Diğer test kültürlerine karşı herhangi bir aktivite saptanmamıştır.

Burada, staphylococcus Urus A TCC 1 2600'ün 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde NZ Y besiyerindeki normal büyümesi, bakteri sayısının mL başına 3,2 × 10⁶ CFU'dan 4,0 × 10⁸ CFU'ya yükselmesiyle gösterilmiştir. Yaklaşık 24 saat içinde, altın yüzeye immobilize edilen fajlar, süspansiyon halindeki fajların aktivitesine benzer bir litik aktivite sergilemiştir. İmmobilize fajlar; 24 saatlik bir büyüme deneyinde kullanıldıktan, birkaç kez yıkandıktan ve 4 °C'de PBS içerisinde altı gün saklandıktan sonra bile taze bir bakteri enfeksiyonunda enfektif kalmaya devam etmiştir.

Bu görüntüde, altın parçanın etrafındaki lizozom gözlemlenebilmekte olup bu durum, immobilize edilmiş fajların bakteri hücrelerini lizize edebildiğini göstermektedir. Bu nedenle, burada örneklendiği üzere, bakteri ve demobilize faj ko-kültüründe saptanan bakteriyel büyümedeki etkili azalma, süspansiyon halindeki bakteriler ile bağlı fajlar arasındaki birincil etkileşimin bir sonucudur. Burada, altın substrat yüzeyindeki bozulmamış litik faj 1 2600'e ait transmisyon ve taramalı elektron mikrografları gösterilmektedir; faj süspansiyonu kloroform işlemine tabi tutulduğunda, fajın kuyruğu boyca kısalıp kalınlaşmakta ve poligonal baş yuvarlak veya steroid bir hal almaktadır.

Önemli yapısal değişikliklere rağmen, plak sayılarıyla ölçülen steroidin litik aktivitesi kloroform uygulaması sonucunda değişmemiştir. İmmobilize litik fajlar içeren QCM sensörleri, MRSA'ya maruz kaldıklarında rezonans frekansında veya enerji dissipasyonunda anlamlı bir değişim göstermemiştir; bu durum, MRSA-faj etkileşiminin nominal bir kütle değişimiyle sonuçlandığını göstermektedir.

Buna rağmen, QCM'ye göre, analiz sonrası biyosensörlerin elektron mikrografları sensör yüzeyinde önemli miktarda bakteriyel bağlanma olduğunu ortaya koymuştur. Faj steroid biyosensörlerin bulunduğu akış hücresine MRSA süspansiyonları enjekte edildiğinde, frekansta belirgin bir düşüş ve dissipasyonda bir artış gözlemlenmiştir. Faj sfero bakteriyel MRSA bağlanma etkileşimlerinin ardından, analiz sensörleri BBP iki A antikor konjuge lateks hız süspansiyonlarına maruz bırakılmıştır.

Bu MRSA analiz biyosensörleri, frekansta daha fazla azalma ve dissipasyonda artış gözlemlenmesiyle BPP two A antikor konjuge lateks küre süspansiyonlarına yanıt vermiştir. MSA'nın faj problarına ve PPP two A antikor konjuge lateks kürelere bağlanması, taramalı elektron mikroskobu incelemeleriyle doğrulanmıştır. Faj steroid biyosensörü MSSA'ya maruz bırakıldığında, faj steroid-MSSA bağlanma etkileşimlerini takiben frekansta belirgin bir azalma ve dissipasyonda artış gözlemlenmiş, ardından analiz sensörleri PPP two A antikor konjuge lateks küre süspansiyonları ile test edilmiştir.

Başlangıçta, MSSA analiz biyosensörü, MSSA ve PPP two A antikor konjugeli lateks kürecik etkileşimlerinden birkaç dakika sonra frekansta kısa süreli artışlar ve dissipasyonda azalmalar göstermiştir. Ancak, frekans PVP two A antikor uygulaması sonrası seviyelere geri dönerken, enerji kaybı artmıştır. MSSA'nın faj problarına bağlanması daha sonra taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilmiş, ancak MSSA ile PPP two A antikor konjugeli lateks kürecikler arasında herhangi bir bağlanma gözlemlenmemiştir; burada litik fajın elipsometrik kalınlık profili ve 3B kalınlık haritası gösterilmektedir.

Kalınlık profilini oluşturmak için kalınlık haritası üzerinden bir hat çizilmiştir. Bu son görüntüler, A-Q-C-M-D sensörünün altın yüzeyine bağlanmış fajlar tarafından yakalanan MRSA'nın temsili CCD optik kamera görüntülerini ve 10⁸ CFU/mL ile 10⁹ CFU/mL konsantrasyonlardaki faj immobilize cam alt tabakalar üzerindeki MRSA'nın 3D yoğunluk profillerini göstermektedir. Her bir yuvarlak daire tek bir bakteriyi temsil eder.

Sıvı süspansiyondaki bakteri konsantrasyonunun mililitre başına 10⁸ CFU'dan 10⁹ CFU'ya çıkarılmasının, 3D yoğunluk profillerinde yakalanan bakterilerde belirgin bir artışa yol açtığı açıkça görülmektedir. Üst katmandaki beyaz piklerin sayısı, yakalanan bakteri sayısıyla orantılıdır ve beklendiği üzere, bakteriyel maruziyet mililitre başına 10⁸'den 10⁹ CFU'ya yükseldiğinde piklerin yoğunluğu önemli ölçüde artmaktadır. En alttaki koyu mavi katman, altın alt tabaka ile temas eden faji katmanı temsil etmektedir.

Daha fazla bakteri yakalandıkça, fajların bakterilere bağlanmasıyla optik özellikleri değişir ve bu durum daha koyu, daha yoğun bir mavi renge yol açar. Bu prosedürün ardından, faj-bakteri etkileşimlerini geliştirme sonrası anlamak amacıyla bakteriyel yakalama verimliliğini tanımlayabiliriz. Bu teknik, bakteri faj terapisi alanındaki araştırmacıların hayvanlarda ve insanlarda patojen inhibisyonunu incelemelerine olanak sağlar. Patojenik bakterilerle organik çözücüler kullanılarak çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve katı düzenlemelere uymanın çok önemli olduğunu unutmayın.