Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Aşağıdaki deneyin genel amacı, metisiline dirençli veya MRSA ve metisiline duyarlı veya staphylococcus aureus'un MSSA suşlarını özel olarak seçilmiş anti modifiye litik bakteri fajı ile ayırt etmektir. Bakteriler litik fajın uzun esnek kuyruklarına bağlandığında, bağlı hücreler ile sensör yüzeyi arasındaki mesafe, QC m'nin akustik dalgasının penetrasyonundan daha büyüktür. Bu nedenle, bağlama olayının sinyali oluşturulmaz.

Sağlam fajın sferoid ile değiştirilmesi, bakterileri QC m'nin akustik dalgasının penetrasyon derinliği içinde bağlayan kısa kuyruklu tamamen işlevsel faj ile sonuçlanır, bu nedenle faj steroidleri A-Q-C-M-D kristali üzerinde biriktirildiğinde ve karışık bakteri süspansiyonuna maruz kaldığında frekans ve dağılım değişikliklerine katkıda bulunur, staphylococcus aureus'un hem MRSA hem de MSSA suşlarını bağlarlar, ancak staphylococcus aureus'u kristal yüzeyindeki diğer bakterilerden ayıran diğer bakteriler değil. Son olarak, Mr.RSA'ya özgü PPP'ye iki A antikoruna bağlı boncuk eklendiğinde, staphylococcus aureus'un Mr.RSA suşlarının varlığında bir sinyal üretilir. Bu tekniğin PCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, bu yöntemin DNA ekstraksiyonu gerektirmemesi ve ampiriklere duyarlı olmamasıdır.

Bu yöntem, staphylococcus orus'un taranması ve dezenfeksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer antibiyotiğe dirençli bakterilere de uygulanabilir. Biyosensörlerin üretimi hassasiyet, doğruluk ve sabır gerektirdiğinden bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Altın kodlu kuvars parçalarını Argonne'da plazma aşındırma ile 10 dakika boyunca temizleyerek başlayın ve daha sonra parçaları steril bir Petri kabında her bir parçanın altın yüzeyine 50 mikrolitre faj süspansiyonunda sterilize ettikten sonra steril bir dolapta UV ışığı altında altı saat sterilize edin ve ardından parçaları ertesi sabah oda sıcaklığında nemli bir odada gece boyunca inkübe edin, titreme için kalan faj süspansiyonunu çıkarın, ardından herhangi bir bağlanmamış fajı çıkarmak için her bir kuvars parçasını PBS ile beş kez bağlı fajla yıkayın.

Kuru bir yüzeyde hareketsizleştirilmiş faj enfektivitesini test etmek için, önce bir gece boyunca staphylococcus aureus kültürünü bir NZY eRate üzerine yayın ve süspansiyonun kurumasını bekleyin. Ardından, yüzü aşağı bakacak şekilde hareketsiz hale getirilmiş altın kaplı bir kuvars parçasını plakaya yerleştirin. 37 santigrat derecede 12 saat sonra, sıvıdaki serbest fajın litik aktivitesini test etmek için enfektiviteye işaret eden bir lizis bölgesi gözlemlenebilir.

İlk olarak, dört adet 300 mililitrelik yan kol şişesinin her birinde 10 mililitre NZY'ye bir gece boyunca bakteri kültürü staphylococcus aureus ekleyin. Daha sonra, şişelerden ikisine mililitre serbest faj başına altı PFU'ya iki kez 10 ekleyin. Şimdi, staphylococcus hücre lizizinin zaman seyrini, her bir şişe için 30 dakikalık aralıklarla optik yoğunluk ölçümü ile 570 dakika boyunca izleyin ve 24 saatte son bir ölçüm yapın.

Bağlı fajın sıvı içindeki litik aktivitesini test etmek için, az önce gösterilen adımları tekrarlayın, ancak serbest faj yerine deney şişelerine bağlı faj içeren altın parçaları ekleyin. Faj steroidlerini hazırlamak için, önce 400 mikrolitre stok faj 1 2600 süspansiyonunu eşit hacimde spektrum fotometrik dereceli kloroform ile oda sıcaklığında bir mililitrelik bir şişeye birleştirin. Daha sonra, faj kloroform süspansiyonunu bir dakikalık bir süre boyunca beş saniyelik aralıklarla beş ila altı kez hafifçe girdaplayın.

Süspansiyonun 30 saniye boyunca stabilize olmasına izin verdikten sonra, steroid süspansiyonunu içeren üst fraksiyonu toplayın. İletim ve taramalı elektron mikroskobu için steroid süspansiyonunun birkaç mikrolitresini 500 mikrolitrelik bir şişeye aktarın. Kalan steroid süspansiyonunu biyosensör üretimi için bir mililitrelik bir şişede saklayın.

Önce biyosensörü hazırlamak için, QCMD sensörlerini bir plazma temizleyicide 10 dakika boyunca argonda plazma aşındırma ile temizleyin. Ardından, organik kirleri gidermek için sensörleri hekzan ile durulayın. Ardından, daha önce Olson Etal tarafından Journal of Microbiological methods'da açıklandığı gibi film dengesinin bir çukurunu temizleyin.

Bir LB oluğunu bir alt faz solüsyonu ile doldurarak ve bir oluk bariyeri ile temizleyerek. Ardından oluğu 20 santigrat derecede 10 dakika stabilize edin. Şimdi, 300 mikrolitrelik bir Eloqua faj 1 2600 sulu süspansiyonu dikkatlice damlatarak LB alt faz çözeltisi üzerinde bir faj tek tabakası oluşturun, kısmen SOPH fazına daldırılmış eğimli bir yenilebilir cam çubuk yapın Tek tabakanın 10 dakika stabilize olmasına izin verdikten sonra, tek tabakayı metre başına 19 newton'luk sabit bir basınç elde edilene kadar dakikada 30 milimetre hızında sıkıştırın.

Dikey film biriktirme, bu prosedürün en zor kısmıdır. Başarıyı sağlamak için, bu prosedürün tüm bileşenlerinin temiz olduğundan emin olunmalı ve ayrıca tek katmanlı biriktirme parametrelerinin optimize edilmesi gerekir. Şimdi, dikey bir film biriktirme işlemi gerçekleştirmek için sensörü dakikada 4,5 milimetre hızında art arda yedi kez tek katmanın içine ve dışına daldırın.

Dikey olarak konumlandırılmış QCMD sensörünün üzerine. Dikey film biriktirme, sağlam fajı biyosensör yüzeyine bağlar. Son olarak, hem serbest hem de bağlı fajın MRSA algılama elektron mikroskobu ve el optometrisi için fabrikasyon faj biyosensörleri kullanın.

Bu adıma, qof T yazılımını kullanarak sudaki QCM sensörünün taban çizgilerini, rezonans frekansını ve enerji dağılımını belirleyerek başlayın. Yaklaşık 30 dakika sonra, test hücresinden su içinde canlı metisiline duyarlı staphylococcus aureus veya MSSA bakteri hücrelerinin bir süspansiyonunu çizin. Mavi çizgi frekans değerini, kırmızı çizgi ise enerji dağılım seviyesini gösterir.

Yatay çizgiler taban çizgisinin oluşumunu gösterir. Ekranın ortasındaki iki rakamı, olayların sensörle ilgili olduğunu gösterir. Dört numaradan ikisi, gösterilen ilk üst ton için sensörlerin rezonans frekansındaki ve enerji dağılımındaki değişiklikleri sürekli olarak izler.

İşte bakteriler test hücresini geçtikten sonra meydana gelen değişiklikler. Sensörlerin rezonans frekansındaki ve iç enerji dağılımındaki değişiklikler, PVP antikoru konjuge lateks hızlarının süspansiyonunda doygunluk seviyelerine ulaştığında, frekansın azalmasının ve enerji dağılımının artmasının sadece birkaç saniye sürdüğünü unutmayın ve frekans dağılımının sürekli izlenmesine devam edin. Burada gösterilen, taban çizgilerinin oluşturulmasını, bakteri eklendikten sonra frekans ve enerji dağılımındaki birkaç saniyelik değişimi, doygunluğu ve son olarak boncukların eklenmesinden sonraki değişiklikleri gösteren tüm algılama sürecidir.

Bu tablo, faj nokta testi ile gösterildiği gibi MRSA suşları da dahil olmak üzere, test edilen tüm S reus suşlarına karşı gösterilen faj litik aktivitesini göstermektedir. Plak boyutları genellikle beş ila 15 milimetre arasında değişmektedir. Diğer test kültürlerine karşı herhangi bir aktivite bulunamadı.

Burada, staphylococcus Urus A TCC 1 2600'ün 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatörde NZ Y ortamında normal büyümesi, bakteri sayısının mililitre başına 3.2 çarpı 10'dan altıya ve 4.0 çarpı 10'a sekiz CFU'ya yükselmesiyle gösterilmiştir. Yaklaşık 24 saat içinde, altın bir yüzey üzerinde hareketsiz hale getirilen faj, süspansiyondaki fajın aktivitesine benzer bir litik aktivite gösterdi. İmmobilize faj, 24 saatlik bir büyüme deneyinde kullanıldıktan sonra bile taze bir bakteriyel enfeksiyonda enfektif kaldı, birkaç yıkama ve PBS'de altı gün boyunca dört santigrat derecede saklandı.

Bu görüntüde, altın parçasının etrafındaki lizozom gözlemlenebilir, bu da hareketsiz hale getirilmiş fajların bakteri hücrelerini parçalayabildiğini göstermektedir. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi, bakteri ve demobilize fajın ko-kültüründe bulunan bakteri büyümesinin etkili bir şekilde azalması, suda asılı bakterilerin ve bağlı fajın birincil etkileşiminin bir sonucudur. Burada, altın bir substrat yüzeyi üzerindeki bozulmamış litik faj 1 2600'ün iletim ve taramalı elektron mikrografları, faj süspansiyonu kloroform işlemine tabi tutulduğunda, fajın kuyruğunun uzunluğu daraldığında ve kalınlaştığında ve poligonal kafa yuvarlaklaştığında veya steroid haline geldiğinde gösterilmiştir.

Önemli yapısal değişikliklere rağmen. Plak sayıları ile ölçülen steroidin litik aktivitesi, kloroform tedavisinin bir sonucu olarak değişmedi. İmmobilize litik fajlara sahip QCM sensörleri, MRSA'ya maruz kaldıklarında rezonans frekansında veya enerji dağılımında önemli bir değişiklik göstermedi, bu da MRSA faj etkileşiminin bir nom kütle değişikliği ile sonuçlandığını gösteriyor.

Bununla birlikte, QCM'ye göre, tahlil sonrası biyosensörlerin elektron mikrografları, sensör yüzeyinde önemli bakteri bağlanması olduğunu ortaya çıkardı. MRSA süspansiyonları faj steroid biyosensörler ile akış hücresine enjekte edildiğinde, frekansta önemli bir azalma ve dağılımda bir artış gözlendi. Faj sfero bakteriyel MRSA bağlanma etkileşimlerini takiben, tahlil sensörleri BBP iki A antikoru konjuge lateks hız süspansiyonlarına maruz bırakıldı.

Bu MRSA test biyosensörleri, BPP'ye iki A antikoru konjuge lateks hız süspansiyonuna yanıt verdi, frekansta daha fazla azalma ve dağılımda bir artış gözlendi. MSA'nın faj problarına ve PPP iki A antikoru konjuge lateks hızlarına bağlanması, taramalı elektron mikroskobu araştırmaları kullanılarak doğrulandı. Faj steroid biyosensörü MSSA'ya maruz kaldığında, faj steroid MSSA bağlanma etkileşimlerini takiben frekansta önemli bir azalma ve dağılımda bir artış gözlendi, tahlil sensörlerine PPP iki A antikoru konjuge lateks hız süspansiyonları ile meydan okundu.

Başlangıçta, MSSA tahlil biyosensörü, birkaç dakikalık MSSA ve PPP iki A antikoru konjuge lateks hızları etkileşimlerinden sonra frekanstaki artışların ve dağılımdaki azalmaların kısa bir geçiciliğini gösterdi. Bununla birlikte, frekans PVP sonrası iki A antikor giriş seviyesine geri döner, ancak desi enerjisi artmıştır. MSSA'nın faj problarına bağlanması daha sonra taramalı elektron mikroskobu ile analiz edildi, ancak burada MSSA ve PPP iki A antikoru konjuge lateks hızları arasında herhangi bir bağlanma gözlenmedi, bir elips simetrik kalınlık profili ve litik fajın 3 boyutlu kalınlık haritası gösterildi.

Kalınlık profilini oluşturmak için kalınlık haritası boyunca bir çizgi çizildi. Bu son görüntüler, A-Q-C-M-D sensörünün altın yüzeyine bağlı fajlar tarafından yakalanan MRSA'nın temsili CCD optik kamera görüntülerini ve mililitre başına 10 ila sekiz CFU ve mililitre başına 10 ila dokuz CFU konsantrasyonda faj immobilize edilmiş cam substratlar üzerinde MRSA'nın 3D yoğunluk profillerini göstermektedir. Her yuvarlak daire tek bir bakteriyi temsil eder.

Sıvı süspansiyondaki bakteri konsantrasyonunun mililitre başına 10'dan sekiz CFU'ya mililitre başına 10 ila dokuz CFU'ya yükselmesinin, 3D yoğunluk profillerinde yakalanan bakterilerin önemli ölçüde artmasına neden olduğu açıktır. Üst tabakadaki beyaz tepelerin sayısı, yakalanan bakteri sayısı ile orantılıdır ve beklendiği gibi, bakteri maruziyeti mililitre başına 10'dan sekize 10'a ila 10'a dokuz CFU'ya yükseltildiğinde tepe noktalarının yoğunluğu önemli ölçüde artar. Alttaki koyu mavi katman, altın bir alt tabaka ile temas eden faj katmanına karşılık gelir.

Daha fazla bakteri yakalandıkça, faj optik özellikleri bakterileri bağladıkça değişir ve bu da daha koyu, daha yoğun bir mavi renge neden olur. Bu prosedürü takiben, geliştirme sonrası faj bakteri etkileşimlerini anlamak için bakteri yakalama verimliliğini tanımlayabiliriz. Bu teknik, bakteri faj tedavisi alanındaki araştırmacıların hayvanlarda ve insanlarda patojen inhibisyonunu keşfetmeleri için yol göstermektedir Patojenik bakterilerde organik çözücülerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve sıkı düzenlemelere uymanın çok önemli olduğunu unutmayın.