Name: Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics S. Typhimurium Bakteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin tümör hedefli S. Typhimurium bakterilerinin büyüme ve gen ifade dinamiklerini fare ksenogreft modelinde biyolüminesans görüntüleme ile. Bu yöntem kanser tedavisinde bakteri terapilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının eleştirel okuma ve düzenleme için H. Fleming teşekkür ederim. Bu çalışma Misrock Doktora Sonrası Bursu (TD) ve NDSEG yüksek lisans bursu (AP) tarafından desteklenmiştir. SNB bir HHMI Araştırmacı olduğunu.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak geçişi hücre çizgileri dahildir. Bu deneyde, OVCAR-8 hücreleri (NCI DCTD Tümör Deposu, Frederick, MD) kullanılır. 100% - 80 confluency bir hedef hücreleri büyütün. </li><li> 5 dakika boyunca 5 ml tripsin ile inkübe hücreleri, ardından + FBS tripsin inaktive 5 ml RPMI ortamı ilave edin. </li><li> Hemasitometre üzerinde hasat ve sayısı hücreleri. 5 x 10 7 hücre / ml ya da şişesi başına yaklaşık 200 ul bir hedef konsantrasyonunda kırmızı fenol içermeyen DMEM içinde süspanse edin. </li><li> 15% daha az büyüme faktörü Matrigel (BD Biosciences) ekleyin ve implantasyon kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol> 2. Tümör İmplantasyonu <ol><li> Izofluran% 3 ile 4 haftalık dişi NCR / Nu fareler anestezi ve derin anestezi sağlamak için yaklaşık 5 dakika bekleyin. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> 1 ml şırınga içinde hücreleri (hem tümör başına 100 ul) yerleştirin ve 27 1 takmak/ 2 iğne. </li><li> İki lider, karşılıklı arka yan enjeksiyon sitelerin her biri için, bir çadır yapmak ve tabanda hücreleri enjekte forseps ile cildi nazikçe kaldırın. Kan üreten, çok derin nüfuz dikkat edin. Hafifçe sıçrama olmadan şırınga kaldırmak için cımbız kullanın. </li><li> 2 arasında bir tümör çapı kadar 20 gün - 4 - mm ulaşıldığında 10 günlük tümör büyümesini izlemek. </li></ol> 3. Bakteri Hazırlık <ol><li> Bir -80 C derin dondurucu hisse senedi veya soğutulmuş plaka 3 ml LB medya + ampisilin bakteri bir gecede kültürü başlatın. Bu deneyde, S. kullanılan typhimurium suşu ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-). </li><li> Sabah, filtre LB içine kültür 1:100 sulandırmak ve OD600 0,4 büyümeye - 0.6. </li><li> Aşağı Spin ve fosfat 3 kez yıkayın tuzlu su (PBS) tamponlu ve 0.1 bir son OD600 (1 x 10 7 hücre / ml) de tekrar süspansiyon. </li></ol> 4. Bakteri enjeksiyonu <ol><li> Bir hayvan anestezisikuyruk da dominant el doğru bakacak şekilde yan d konumu. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> Ilık su veya ısı lambası kullanarak kuyruk ven dilate. </li><li> 1 ml şırınga içinde bakteri (fare başına 100 ul) yükleyin ve 90 dereceden sadece daha az ucu bükün. </li><li> Kuyruk ven ile şırınga ucu aynı hizaya getirin, sığ bir derinliğe (direnç hissetmelisiniz) de nüfuz ve bakteri enjekte. Başarılı bir enjeksiyon için kan akımını değiştirme dikkat edin. </li></ol> 5. Fare Görüntüleme <ol><li> Indüksiyon odasında hayvanların anestezisi sonra görüntüleme platformu üzerinde, her bir fare yerleştirin. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. Zaman noktaları arasında kantitatif sonuçları elde etmek için hassas konumlandırma koruyun. </li><li> IVIS Spectrum görüntüleme sistemi (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanarak görüntü hayvanlar. Aralarında görüntüleme 1&#39;den fazla hayvan, yer ışık bariyerleri çapraz illu önlemek için iseğerlendirmesi. Hayvanlar bakteri lokalizasyonu onaylamak için ventral tarafta ilk görüntülü olmalıdır. </li><li> Görüntü hayvan dorsal deney (36 saat) süresince IVIS her 2 saat kullanarak. Belirli bir yatırım getirisi için bir süre ders oluşturun. </li></ol> 6. Bakteriyel biolojik dağılım miktarının <ol><li> Emici bebek bezi üzerinde arkasında CO 2 ve yer kullanarak hayvanlar euthanize. </li><li> Iki arka yan subkutan tümörler ortaya çıkarmak için hayvan çevirin. Tümörler ayırmak ve kaldırmak için, etrafını saran dokulardan kesin. Cımbız ile tümör Holding, bir ters makas hareketi kullanarak cilt kaldırmak. Cilt çoğunluğu ayrılmış zaman, tam cımbız kullanarak tümör çıkarmak. </li><li> Önceden tartılmış mikrosantrifüj tüpleri içinde organları. Bu tüplerin kitle önemli ölçüde değişebilir çünkü nicel sonuçlar için bunları önceden tartmak önemlidir. </li></ol> 7. Bakteriyel biolojik dağılım miktarının <ol><li> Her zaman noktası, tüketim ve tümörler tartın. </li><li> 500 ul PBS +% 15 gliserol ekleyin ve bir Doku-Tearor (BioSpec) kullanarak homojenize. Örnekleri arasında etanol ile homojenleştirici 3 kez yıkayın. </li><li> Seri seyreltme ve bakteri kolonisi sayımı için plaka oluşturun. Tek bir tabak kullanımı ön kesitli plakalar üzerinde plaka birden fazla seyreltme için. </li></ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu prosedür kullanılarak, böylece tümörü kolonize bakteri büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri için zaman içerisinde elde edebiliyoruz. Bu ölçümler rutin parti kültür ya da mikroflüidik cihazlar, in vitro olarak gerçekleştirilir olsa da, in vivo olarak gerçekleştirmek için çok daha zordur. Bu yöntemler uygulanabilir çeşitli değişiklikler vardır. Bizim fare modelleri oluşturmak için OVCAR-8 hücre kullanılır iken, diğer hücre hatları, bir dizi eşit şekilde kullanılabilir. ...

Sentetik biyoloji son on yılda hızla ilerlemiştir ve şimdi enerji ve sağlık önemli sorunları etkisi konumlandırılmış. Ancak, klinik alana genişleme güvenlik endişeleri ve in vivo genetik devrelerinde için tasarım kriterleri geliştirme bir yokluğu ile yavaşladı edilmiştir. Yüksek darbe tıbbi uygulamaları hızlandırılması tıbbi altyapı, kontrollü laboratuar ortamı dışında işlev genetik devreleri, ve güvenli ve klinik-kabul mikrobiyal bilgisayarlar ile doğrudan arabirim yöntemleri kullanarak gerektirecektir. Suş tümörlerde tercihen büyümeye yeteneklerine bağlı olarak kanser tedavisi için incelenmiştir. Bu C eklemiş novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, ve S. typhimurium 3-8. S. onlar 9-12 insan klinik çalışmalarda bir dizi güvenlik ve hoşgörü sergilenen gibi typhimurium özel bir ilgi yarattı. Bu bakteri<html> Bir ilk konak bağışıklık sisteminin uyarılması yoluyla ve kanser hücre metabolizması için gerekli besinlerin tükenmesi ile bir anti-tümör etkileri oluşturmak için gösterilmiştir. Tedavi kargo üretimi daha sonra genetik değişiklikler ile eklendi. Bu çalışmalar tümör tedavileri için bakteri kullanımı önemli ilerlemeler temsil ederken, mevcut çabalar çoğunluğu genellikle çok yüksek dozlarda, hedef dışı etkiler ve ana 13-16 direnç gelişimi teslimat ile sonuçlanan yüksek düzeyde ekspresyon yararlanmıştır . Şimdi, sentetik biyoloji gelişmiş algılama ve dağıtım 17-20 gerçekleştirebilirsiniz hesaplama tasarlanmış genetik devreleri kullanarak programlanabilir yük üretim ekleyebilirsiniz. Bu devreler, tümör spesifik uyaran ve gerektiğinde kendi kendini düzenleyen kargo üretim anlamda dağıtım sistemleri olarak hareket için dizayn edilebilir. Ancak, in vivo olarak, bu devrelerin fonksiyonu çalışmalarında şimdiye kadar zor olmuştur. plazmid sentetik devreleri için ortak bir çerçeve olan ve_content &quot;&gt; bu yana, bir fare modeli kullanılarak in vivo plazmid tabanlı gen ifadesinin dinamiklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler zaman atlamalı lüminesans görüntüleme ve biodistribution kantitatif ölçümü kullanmaktadır. birlikte, Bu yaklaşımların klinik uygulamalar için in vivo plazmid tabanlı ağlar eğitim için bir çerçeve sağlar.

<table><tbody><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc İnsülin Şırıngası</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Ortamı 1640 (1X), sıvı, L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Et</td><td>suyu Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani et suyu</td><td>BD Biyobilimler</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

tümör hedefli ölçülmesi büyüme ve gen İfade dynamics<em&gt; s. typhimurium</em&gt; bakteri

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Bu deneylerin amacı, hafifletilmiş S. büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir tümörleri içinde büyüyen typhimurium bakteri kolonileri. Bir insan yumurtalık kanseri hücre hattı deri altına enjeksiyon, OVCAR-8 (NCI DCTD Tümör Deposu&#39;ndan, Frederick, MD). Farelerde modeli ksenograft tümörler oluşturulan Biz, S. zayıflatılmış suş transforme görselleştirme 2 plazmid yapıcı şekilde tanımlanmış lusiferaz (luxCDABE) ile: typhimurium bakteriler (SL1344 phoPQ-1 ELH430). Fare 1, esas olarak non-virulent kalarak Bu suşlar, özellikle tümörler kolonize olur. Ölçülebilir tümörler tesis edildiğinde, bakteri dozaj değişen kuyruk damarı yoluyla venöz içinden enjekte edildi. Tümör-lokalize, bakteri gen ekspresyonundaki kullanarak 60 saatlik bir süre boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmiştirin vivo görüntüleme sistemi (IVIS) içinde. Her zaman noktasında, tümörler homojenize eksize ve gen ekspresyon verileri ile korelasyon için bakteri kolonileri ölçmek için kaplandı. Birlikte, bu veriler tümörler içinde büyüyen bakterilerin in vivo büyüme ve gen dinamikleri içinde bir nicel ölçü verir.

Bu protokol kullanarak, tümör hedef bakteri in vivo büyüme ve gen dinamikleri veri elde edebiliyoruz. Genel akışı Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. İlk aşamada, biz lüminesans (mavi) bir muhabir olarak ile gen ekspresyon ölçmek için IVIS kullanarak hayvan bakteri enjekte (yeşil) ve görüntü. Daha sonra, ikinci aşamada, biz tüketim, homojenize ve koloni sayımı için plaka tümörler tümör büyüyen bakteri sayısını belirlemek için. <p...

Bu deneylerin amacı, zayıflatılmış büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir<em&gt; S. typhimurium</emTümörleri içinde büyüyen&gt; bakteri kolonileri. Bu video tümör hücre hazırlama ve implantasyonu, bakteri hazırlanması ve enjeksiyon, tam hayvan lüminesans görüntüleme, tümör eksizyonu ve bakteri kolonisi sayma kapsar.

Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bakteri

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Bu deneyin genel amacı, tümörlerin içinde büyüyen S tyrian bakterilerinin in vivo gen ekspresyon dinamiklerini incelemektir. İlk olarak, bir fare ksenogreft kanser modelinde bakteriler kuyruk veni aracılığıyla intravenöz olarak enjekte edilir. Bakteriler tümörü kolonize ederek eksponansiyel olarak büyürken, gen ekspresyonu lüminesans raporlayıcılar kullanılarak görselleştirilir.Tüm hayvan biyolüminesans görüntülemesi, IVUS spektrum görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. 24 ila 48 saatlik bir süre boyunca IVUS görüntülerinden oluşan bir zaman dizisi alınır. Bu görüntü serisi, tümörlerin homojenize edilmesi ve plaklara ekilmesiyle elde edilen koloni sayılarıyla ilişkilendirilir.Tüm bu veriler, tümör hedefli bakterilerin gen ekspresyonunu ve popülasyon dinamiklerini in vivo olarak gerçek zamanlı hücre hazırlama pasajında ve standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak hücre hatlarında kantitatif olarak ölçmemize olanak tanır. Bu deneyde, %80 ila %100 hedef konfluensle ocar sekiz hücreleri gross hücreler kullandık. Hücreleri bir hemositometre ile hasat edin ve sayın; ardından fenol kırmızısı içermeyen DMEM içinde mililitre başına 5 × 10⁷ hücre hedef konsantrasyonda veya flask başına yaklaşık 200 µL olacak şekilde yeniden süspande edin. %15 indirgenmiş büyüme faktörü matrigel ekleyin ve hücre süspansiyonunu tümör implantasyonuna kadar buz üzerinde tutun.Dört haftalık dişi nude fareler %3 isofluorine kullanılarak anestezi altına alındı. Hücreleri, her tümör için 100 µL olacak şekilde 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve her iki bilateral arka yan enjeksiyon bölgesi için 27,5 gauge iğne takın. Bir çadır oluşturmak için deriyi pensle nazikçe kaldırın ve hücreleri tabana enjekte edin.Kanamaya yol açacak kadar derin penetrasyon yapmamaya dikkat edin. Şırıngayı, sıçratma yapmadan nazikçe çıkarmak için cımbız kullanın. Tümör çapı iki ila dört milimetreye ulaşana kadar, 10 ila 20 gün boyunca tümör büyümesini günlük olarak izleyin.Bakteri hazırlığı için, -80 °C dondurucudaki stoktan veya soğutmalı plakadan alınan bakterilerin, antibiyotikli 3 mL LB besiyerinde gece boyu kültürü başlatın. Bu deneyde sabah saatlerinde ELH430 suşuna sahip S. typhi kullanılmıştır. Kültürü filtre edilmiş LB içerisinde 1/100 oranında seyreltin ve OD 600 değeri 0,4 ile 0,6 arasına gelene kadar büyütün.Santrifüjleyerek çöktürün, fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın ve final OD 600 değeri 0,1 veya yaklaşık 1 × 10⁷ hücre/ml olacak şekilde yeniden süspanse edin. Bakteri enjeksiyonu için hayvanları anestezi altına alın ve kuyruğu baskın elinize doğru bakacak şekilde konumlandırın. Kuyruk venini bulun ve sıcak su veya bir ısı lambası kullanarak genişletin.Bakterileri fare başına 100 µL olacak şekilde bir mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve çipi 90 derecenin biraz altında olacak şekilde bükün. Şırınga ucunu kuyruk veni ile hizalayın, herhangi bir direnç hissetmeden sığ bir derinlikte penetrasyon gerçekleştirin ve bakterileri enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon için kan akışı yer değiştirmesini gözlemleyin.Kolonizasyonun gerçekleşmesi için görüntülemeden önce yaklaşık 12 ila 18 saat bekleyin. Fare görüntüleme işlemi için hayvanları indüksiyon odasında anesteziye alın. Ardından her bir fareyi görüntüleme platformuna yerleştirin.Zaman noktaları arasında kantitatif sonuçlar sağlamak için hassas konumlandırmayı koruyun, hayvanları Ibis Spectrum görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleyin. Birden fazla hayvan görüntüleniyorsa, çapraz aydınlatmayı önlemek için aralarına ışık bariyerleri yerleştirin; tümörü cımbızla tutarak hayvan diseksiyonunu gerçekleştirin. Ters makas hareketi kullanarak cildi çıkarın.Deri büyük oranda ayrıldığında, tümörü cımbız yardımıyla tamamen çıkarın. Organları önceden tartılmış mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Bu tüplerin kütlesi önemli ölçüde farklılık gösterebildiğinden, kantitatif sonuçlar elde etmek için önceden tartılmaları önemlidir.Her bir zaman noktası için bakteriyel biyodağılımı nicelleştirmek amacıyla tümörleri çıkarın ve tartın; 500 µL PBS artı %15 gliserol ekleyin ve bir doku parçalayıcı kullanarak homojenize edin, seri dilüsyonlar hazırlayın ve bakteriyel koloni sayımı için plaka yapın; temsili sonuçlar. Bu protokolü kullanarak, tümör hedefli bakterilerin in vivo büyüme ve gen ekspresyon dinamikleri üzerine veriler elde edebiliyoruz. Genel iş akışı burada özetlenmiştir.İlk aşamada, bakteri enjekte ettik ve raporlayıcı olarak lüminesans ile gen ekspresyonunu ölçmek için ivus kullanarak hayvanı görüntüledik. Ardından ikinci aşamada, tümörde büyüyen bakteri sayısını belirlemek amacıyla kolon sayımı için tümörleri çıkardık, homojenize ettik ve plaklara ektik. Bakteri suşları tarafından üretilen biyolüminesans ivus ile görselleştirilir; sinyal, enjekte edilen dozla birlikte artış gösterir ve zayıflamalar nedeniyle tüm vakalarda minimum kolonizasyon dozu yaklaşık 5 × 10⁵ civarındadır.Bakteriler ya tümörleri spesifik olarak kolonize eder ya da farelerde belirgin bir büyüme göstermezler; sinyal, pozlama süresini normalize etmek için radyan birimleri kullanılarak nicelleştirilir ve belirli bir enfeksiyon için 10⁶ veya üzerindeki tipik değerler kolonizasyonu gösterir. Sinyal, 24 ila 48 saat boyunca zamanla artar. Burada pik başlangıcı enjeksiyondan yaklaşık 36 saat sonradır, ancak zamanlama kullanılan suşa ve plazmide bağlı olarak değişebilir. Bir sonraki deney setinde nicel sonuçlar elde etmek için farenin her seferinde tam olarak aynı şekilde konumlandırıldığından emin olun.Farklı organlarda zaman içindeki bakteri büyümesini ölçmek için bakteriyel biyodağılım miktar olarak belirlenir; canlı bakteriler ve tümörler, tümörün çıkarılıp homojenize edilmesi ve seri dilüsyonlarının ekilmesi yoluyla miktar olarak belirlenir. Diğer organlar da benzer şekilde miktar olarak belirlenebilir. Burada, dilüsyon faktörü kullanılarak geriye dönük hesaplama yapıldıktan sonra tümör-dalak oranı bakteriyel özgüllüğün tipik bir ölçümü olduğundan dalak kullanılmıştır.Bu sayımlar, belirli bakteri popülasyonunu zaman içinde ölçmemize olanak tanır. Solda, bakteri sayısının deney süresi boyunca istikrarlı bir şekilde arttığını görebiliyoruz. Bir ila üç saat arasındaki iki katına çıkma süresi, batch kültür deneylerindekinden önemli ölçüde daha düşüktür.Bu durum muhtemelen tümör mikroçevresindeki yetersiz besin koşullarından kaynaklanmaktadır. Sağda, tümör-dalak oranını niceliksel olarak belirledik ve bunun deney boyunca arttığını gözlemledik. Bu deneylerin amacı, IVUS görüntüleme ve koloni sayım tekniklerini kullanarak bakterilerin büyüme ve gen ekspresyon dinamikleri ile tümör ortamlarını nicel olarak izlemektir.Bakteri popülasyonlarının tümör ortamlarında in vivo olarak karakterize edilebileceğini göstermiş bulunuyoruz. Gelecekte, bakterilerde gelişmiş terapötik iletim sistemleri oluşturmak amacıyla daha karmaşık gen ekspresyon programları tasarlanabilir ve mühendisliği yapılabilir.I.

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Liu, P.C., ve diğerleri. Antibiyotik ilaç seçimi altında bakterilerin adaptif evrimi için düşük maliyetli, otomatik bir morbidostat tasarımı ve kullanımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, trimetoprim antibiyotik stresi altında vahşi tip ve trimetoprim dirençli E. coli suşlarının büyümesini ve morfolojisini görselleştirmek ve karşılaştırmak için mikroakışkan bir çipin kullanımını göstermektedir.

Antibiyotik İlaç Direncini İncelemek için Mikroakışkan Çip Üzerinde Bakteri Üremesi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Burada, varsayılan faj genlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için fenomik yaklaşımlar sunuyoruz. Teknikler, katabolik metabolizmaya etkileri ölçebilen yerleşik metabolomik yöntemine ek olarak, konakçı anabolik metabolizmayı izleyebilen gelişmiş bir tahlil, Çoklu Fenotip Test Plakaları (MAP'ler) içerir.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

evrim senaryolarda çeşitler (mekansal ayrışmanın) rolü mekansal dağılımı ayarı kontrollü izin laboratuvarda basit mikrobik sistemler kullanılarak incelenebilir. Kurucu hücre yoğunluğu değiştirerek, çeşitli çeşitler seviyeleri, Bacillus subtilis, koloni biyofilm floresan etiketli bakteriyel suşlar kullanılarak görüntülenebilir.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Öğrenin tümör hedefli S. Typhimurium bakterilerinin büyüme ve gen ifade dinamiklerini fare ksenogreft modelinde biyolüminesans görüntüleme ile. Bu yöntem kanser tedavisinde bakteri terapilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics

Daha fazla video keşfet