Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics S. Typhimurium Bakteri

Bu deneyin genel amacı, tümörlerin içinde büyüyen S tyrian bakterilerinin in vivo gen ekspresyon dinamiklerini incelemektir. İlk olarak, bir fare ksenogreft kanseri modelinde, bakteriler kuyruk damarı tarafından intravenöz olarak enjekte edilir. Bakteriler tümörü kolonize eder ve katlanarak büyürken, gen ekspresyonu ışıldayan raportörler kullanılarak görselleştirilir.

Tüm hayvan biyolüminesans görüntüleme, IVUS spektrum görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. 24 ila 48 saatin üzerinde bir zaman diliminde IVUS görüntüleri alınır. Bu görüntü serisi, tümörlerin homojenleştirilmesi ve kaplanması ile oluşturulan koloni sayıları ile ilişkilidir.

Bu veriler birlikte, standart hücre kültürü tekniklerini kullanarak gerçek zamanlı hücre hazırlama geçişini, hücre hatlarını in vivo olarak tümör hedefli bakterilerin gen ekspresyonunu ve popülasyon dinamiklerini kantitatif olarak ölçmemize olanak tanır. Bu deneyde, sekiz hücreli brüt hücreleri% 80 ila% 100'lük bir hedef koakıence kadar kullandık ve bir hemo, sitometre, resus, süspansiyon ve fenol kırmızı içermeyen DMEM'deki hücreleri beş kez 10 ila yedi hücreye veya şişe başına yaklaşık 200 mikrolitre. % 15 azaltılmış büyüme faktörü matrigel ekleyin ve implantasyon tümör implantasyonuna kadar hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.

Anes, dört haftalık dişi çıplak farelere% 3 flor kullanarak anestezi uygulandı. Hücreleri bir değirmenlik şırıngaya tümör başına 100 mikrolitre yükleyin ve iki taraflı arka yan enjeksiyon bölgesinin her biri için 27 buçuk gauge iğne takın. Bir çadır yapmak ve tabana hücre enjekte etmek için cildi forseps ile nazikçe kaldırın.

Çok derine nüfuz ederek kan üretmemeye dikkat edin. Şırıngayı sıçramadan nazikçe çıkarmak için cımbız kullanın. İki ila dört milimetrelik bir tümör çapına ulaşılana kadar tümör büyümesini 10 ila 20 gün boyunca günlük olarak izleyin.

Bakteri hazırlama, üç mil LB ortamında bir gece bakteri kültürü ve eksi 80 dondurucu stoğundan veya soğutulmuş bir plakadan antibiyotik başlatın. Bu deneyde sabahları 30 saat dört ELH suşu kullandık. Kültürü bir ila 100 oranında filtrelenmiş lb'ye seyreltin ve 0.4 ila 0.6 arasında bir OD 600'e büyütün.

Fosfat tamponlu tuzlu su içinde üç kez döndürün ve yıkayın ve son OD 600'de 0.1 veya yaklaşık bir kez 10 ila mil başına yedi hücrede yeniden süspanse edin. Bakteri enjeksiyonu, hayvanları uyuşturun ve kuyruk baskın elinize bakacak şekilde pozisyon alın. Kuyruk damarını bulun ve ılık su veya bir ısı lambası kullanarak genişletin.

Bakterileri fare başına 100 mikrolitre bir mil şırıngaya yükleyin ve çipi 90 dereceden biraz daha az bükün. Şırınga ucunu kuyruk damarı ile hizalayın, direnç hissetmeden sığ bir derinliğe nüfuz edin ve bakteri enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon için kan akışının yer değiştirmesini gözlemleyin.

Kolonizasyonun gerçekleşmesi için görüntülemeden önce yaklaşık 12 ila 18 saat bekleyin. Fare görüntüleme, indüksiyon odasındaki hayvanları uyuşturur. Ardından her bir fareyi görüntüleme platformuna yerleştirin.

Zaman noktaları arasında nicel sonuçlar elde etmek için hassas konumlandırmayı koruyun, Ibis Spectrum görüntüleme sistemini kullanarak hayvanları görüntüleyin. Birden fazla hayvanı görüntülüyorsanız, tümörü cımbızla tutarak çapraz aydınlatmalı hayvan diseksiyonunu önlemek için aralarına ışık bariyerleri yerleştirin. Ters makas hareketi kullanarak cildi çıkarın.

Hareket: Derinin çoğunluğu ayrıldığında, cımbız kullanarak tümörü tamamen çıkarın. Organları yerleştirin ve önceden tartılmış mikro santrifüj tüplerini yerleştirin. Bu tüplerin kütlesi önemli ölçüde değişebileceğinden, kantitatif sonuçlar için bunları önceden tartmak önemlidir.

Tümörlerin her zaman noktası eksize edilmesi ve tartılması için bakteriyel biyo dağılımın ölçülmesi, 500 mikrolitre PBS artı% 15 gliserol ekleyin ve bir doku yırtılması kullanarak homojenize edin, bakteri kolonisi sayımı temsili sonuçları için seri seyreltme ve plaka oluşturur. Bu protokolü kullanarak, tümör hedefli bakterilerin in vivo büyümesi ve gen ekspresyon dinamikleri hakkında veri üretebiliyoruz. Genel iş akışı burada özetlenmiştir.

İlk aşamada, bakteri enjekte ettik ve raportör olarak lüminesans ile gen ekspresyonunu ölçmek için ivus kullanarak hayvanı görüntüledik. Daha sonra ikinci aşamada, tümörde üreyen bakteri sayısını belirlemek için koloni sayımları için tümörleri eksize ettik, homojenize ettik ve kapladık. Bakteri suşları tarafından üretilen biyolüminesans, zayıflamalara bağlı olarak tüm vakalarda minimum kolonizasyon dozu yaklaşık beş kez 10 ila beş olan enjekte edilen dozaj ile ivus sinyal artışları kullanılarak görselleştirilir.

Bakteriler ya spesifik olarak kolonize tümörler ya da farelerde önemli ölçüde büyüyemez, sinyal, maruz kalma süresini normalleştirmek için ışıma birimleri kullanılarak ölçülür veya 10 ila altı veya daha büyük tipik değerler, belirli bir enfeksiyon için kolonizasyonun göstergesidir, Sinyal 24 ila 48 saat boyunca zamanla artar. Burada pik başlangıç enjeksiyondan yaklaşık 36 saat sonradır, ancak zamanlama kullanılan suş ve plazmide bağlı olarak değişebilir. Bir sonraki deney kümesinde nicel sonuçlar elde etmek için fareyi her seferinde tam olarak aynı şekilde konumlandırdığınızdan emin olun.

Bakteriyel biyodağılım, farklı organlarda zaman içinde bakteri üremesini ölçmek için ölçülür, canlı bakteriler ve tümörler, tümörün eksize edilmesi ve homojenize edilmesi ve seri seyreltmesinin kaplanmasıyla ölçülür. Diğer organlar ölçülebilir. Benzer şekilde, tümör dalak oranı, seyreltme faktörü kullanılarak geriye dönük hesaplama yapıldıktan sonra bakteriyel özgüllüğün tipik bir ölçüsü olduğu için burada dalak kullandık.

Bu sayımlar, zaman içinde spesifik bakteri popülasyonunu ölçmemize izin verir. Sol tarafta, deney süresi boyunca bakteri sayısının istikrarlı bir şekilde büyüdüğünü görebiliriz. Bir ila üç saat arasında bir ikiye katlama süresi ile, toplu kültür deneylerinden önemli ölçüde daha düşük.

Bu muhtemelen tümör mikro ortamındaki zayıf besin koşullarından kaynaklanmaktadır. Sağ tarafta, tümör dalak oranını ölçtük ve deney boyunca arttığını gözlemledik. Bu deneylerin amacı, IVUS görüntüleme ve koloni sayımı tekniklerini kullanarak bakteri ve tümör ortamlarının büyüme dinamiklerini ve gen ekspresyonunu kantitatif olarak izlemektir.

Bakteri popülasyonlarının tümör ortamlarında in vivo olarak karakterize edilebileceğini gösterdik. Gelecekte, bakterilerde sofistike terapötik dağıtım sistemleri oluşturmak için daha karmaşık gen ekspresyon programları tasarlanabilir ve tasarlanabilir.