Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi
15 Ağustos 2013
Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.
Bu prosedürün genel amacı, proteini bir hücre lizatından saflaştırmadan bir protein ligand etkileşiminin bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu, ilk olarak herhangi bir yapışık hücre hattında ilgilenilen GFP kaynaşmış proteininin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre lizat ve ligand seyreltmelerinin hazırlanmasını takiben, hücre lizat ligand karışımları hazırlanır ve kılcal damarlara yüklenir.
Daha sonra, değişen ligand konsantrasyonlarının varlığında GFP kaynaşmış proteinin termo direnci ölçülür. Son adım, mikro ölçekli termo ferez veya MST ölçümlerinin veri analizidir. Sonuç olarak, GFP kaynaşmış proteinler ve çeşitli ligandlar arasındaki etkileşimlerin bağlanma afinitelerini belirlemek için mikro ölçekli termo resis kullanılır.
Titrasyon, kalorimetri veya yüzey plazma mono gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, protein saflaştırılmasını, ikili etkileşimlerin önemli ölçüde basitleştirici ve hızlandırıcı kantitatif karakterizasyonunu önlemesidir. Bu yöntem, zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri gibi ifade edilmesi ve saflaştırılması zor proteinlerle çalışırken önemli avantajlar sunar. Mikro ölçekli termo ferezin en büyük avantajlarından biri, çeşitli tamponlarda çalışması ve sistemdeki deterjanların ve hücrelerimin varlığını tolere etmesidir Tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir biyolog olan Karen Stefka olacaktır Başlamak için, hücreleri buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ile kısa bir süre yıkayın T 75 şişesi başına 10 mililitre tampon kullanarak.
Hücreleri beş dakika boyunca veya şişeden ayrılmaya başlayana kadar buz üzerinde tutun. Gerekirse ayırmak için hücreleri hücre kazıyıcı ile kazıyın. Hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın ve önceden soğutulmuş 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri beş dakika boyunca 400 ila 600 Gs ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Sitozolik proteinlerin ekstraksiyonu için süspansiyonu önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne aktarın.
Yerel aşırı ısınmayı en aza indirmek için hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri% 30 genlikte üç kez on saniyelik sonikasyon darbeleri ile leyin. İki ila üç milimetrelik bir ön soğutma ucu kullanarak, köpürmeyi en aza indirmek için ucu yüzeyin altında tutun. Tampon içeren deterjan kullanırken bu adımı atlayın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
Bunun yerine, lizat çözeltisini, gerekirse beş molar sodyum klorür stok çözeltisinden 100 milimolar sodyum klorür fizyolojik tuz konsantrasyonu içerecek şekilde düzeltin. Son olarak, lizatları 10 dakika boyunca yaklaşık 25.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. MST cihazında dalga boyu 470 nanometreye eşit olan ışık yayan diyotu veya LED uyarma kaynağını seçin.
MST tamponu ile iki ve 10 kez seyreltilmiş hücre özütü ile kılcal damarları yükleyin ve bunları MST cihazına yerleştirin. MST cihazının kontrol yazılımında kılcal damarları bulma işlemini gerçekleştirin. Seyreltilmiş lizattaki optimum floresan aralığı 400 ila 1500 floresan birimidir.
Metin protokolünde açıklandığı gibi optimal ligand konsantrasyon aralığını belirlemeye devam edin. Buz pipetine gerekli sayıda 0,5 mililitre düşük bağlamalı santrifüj tüpü içeren bir tüp rafı yerleştirin, her tüpün dibine 25 mikrolitre MST tamponu yerleştirin, ilk tüpe 25 mikrolitre ligand stok çözeltisi yerleştirin ve tüplerin geri kalanını kullanarak ligandın seri iki kat seyreltmesini gerçekleştirin. Ligand örneklerini içeren rafı buz üzerinde tutun.
Bağlanma reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimal seviyesini elde etmek için hücre lizat seyreltmesini hesaplayın. Nihai protein konsantrasyonu, beklenen bağlanma ayrışma sabitine yakın veya daha düşük olmalı ve gerekli sayıda floresan sayısı elde etmek için ayarlanmalıdır. Son çözeltide, hücre lizatını MST Tamponu ile seyreltmeye devam edin.
0.5 mililitrelik düşük bağlama tüplerini, ligand seri seyreltme numuneleri olan tüplerin karşısındaki tüp rafına yerleştirin. Her tüpün dibine dikkatlice 15 mikrolitre hücre lizatı ekleyin. Numune kaybını önlemek için tüp duvarlarına dokunmamaya çalışın.
İlgili tüpe en yüksek konsantrasyona sahip 15 mikrolitre ligand numunesi ekleyin. Birincisi, hücre lizatı ile. İyice karıştırın ve pipet ucunu değiştirin.
Bu adımı, ligand içermemesi gereken sonuncusu hariç diğer tüplerle tekrarlayın. Son tüpe 15 mikrolitre MST tamponu ekleyin ve karıştırın. İlk kılcal damarın yaklaşık üçte ikisini bir numaralı tüpten gelen bağlayıcı karışımla doldurun.
Çözeltiyi merkeze doğru hareket ettirmek için eğin ve kılcal damarı kılcal tepsinin üzerine konumuna yerleştirin. Birincisi, bu adımı kılcal damarların geri kalanıyla tekrarlayın. Kılcal uçlar daha uzun deneyler için balmumu ile tıkanabilir.
Tepsiyi MST cihazının içine yerleştirin ve cihaz kapağını kapatın. Ardından, dalga boyu 470 nanometreye eşit olan LED uyarma kaynağını seçin. MST cihazında, cihazın kılcal damarların tam konumlarını bulmasına ve floresan sinyal yoğunluğuna dayalı olarak numunelerin floresansını ölçmesine izin vermek için kılcal damarları bul komutunu gerçekleştirin.
LED gücünü 400 ila 1500 birim aralığına getirecek şekilde ayarlayın. Thermo Resis Deneyini gerçekleştirmek için başlat düğmesine tıklayın. Deney için birden fazla kızılötesi lazer gücü seçilebilir.
Belirli bir sistem için en uygun sıcaklık gradyanını bulmak için, 16 kılcal damardan oluşan bir seti çalıştırmak 10 ila 12 dakika sürer. Ölçümlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için aynı kılcal damar seti için iki ila üç çalıştırmadan veri toplayın. Veri analizine başlamak için analiz yazılımını açın ve proje klasörünü yükleyin.
Görünen bilgilerde, belirli bir IR lazer gücü termo retic eğrilerinde toplanan görüntüleyiciyi çalıştırın. Çeşitli koşullar altında toplanan tüm termoretik izleri bir kerede açma ve ardından bunları açıp kapatarak analiz için herhangi bir eğriyi seçme seçeneği vardı. Değerlendirme noktaları grafiği penceresinde, T atlama mavisi ve kırmızı çizgilerle termo resis veya termo ferezi seçin.
Yazılım tarafından analiz için manuel olarak seçilen deneysel eğrilerin iki bölgesini tanımlayın. Thermo Resis'te maksimum değişikliği sağlamak için mavi ve kırmızı çizgilerin doğru konumlandırıldığından emin olun. Standart sapmalarla ortalama noktaları elde etmek için, ortalamayı kullan'ı seçin veya ayrı çalıştırmalar için çalıştırmaları ayırt edin.
Bir ayrışma sabiti uyumunu çizmek için, ortalamayı kullan'ı seçin, etiketli molekül konsantrasyon değerini girin ve sabitleyin ve eğriyi sığdırın. Bağlanma ayrışma sabiti veya standart sapmasıyla birlikte KD değeri, ayrı bir bilgi açılır penceresinde görünür. Ortalama sığma verilerini bir metin dosyasına kaydedin ve Excel.Heck'e aktarın.
STAT 3G FP'yi eksprese eden 2, 9, 3 hücre, floresan etiketli stat üç kaynağı olarak kullanıldı. A DNA bağlanma testi için, yüksek yüklü oligonükleotidlerin bağlanması, STAT üç hareketliliğinde önemli değişikliklere neden oldu. Sıcaklık gradyanında.
Termoretik sinyal, oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Her veri noktası, üç ölçümün ortalamasını temsil eder. Görünür KD değerlerini belirlemek ve belirlemek için nano zamansal analiz yazılımı kullanıldı.
Görünür ayrışma sabitleri, gaz motifine bağlanmak için 37.9 artı veya eksi 1.0 mikromolar ve zengin oligonükleotid s artı 100'e bağlanmak için 23.3 artı veya eksi 0.6 mikromolar idi. Şaşırtıcı bir şekilde, s artı 100 dizi, gazdan biraz daha sıkı bağlanma gösterdi. Üç ölçüm tekrarında, A'nın G'ye ikame edilmesi, s artı 100 mutant olanın afinitesinde dramatik bir azalmaya neden oldu.
S artı 100 mutant iki saptanabilir bir bağlanma göstermezken, bu nedenle STAT üçünün dizi seçici bağlanmasını doğrular. s artı 100 Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, zar proteinlerinin ekstraksiyonu için en uygun koşulların farklı proteinler için farklılık göstereceğini ve genellikle optimizasyon gerektireceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteini hücreden saflaştırmadan bir proteinin zarife bağlanma afinitesini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Lizat.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, protein-ligand etkileşimlerinin bağlanma afinitesini doğrudan hücre lizatlarından belirlemek için mikroölçekli termoforesi (MST) kullanımını açıklamaktadır. Yöntem, bir GFP-füzyon proteininin ifadesini, hücre lizatlarının hazırlanmasını ve değişen ligand konsantrasyonları ile MST sinyallerinin ölçülmesini içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein-Ligand Etkileşimleri
- Termoforetik Teknikler
Arka Plan
- Mikroölçekli termofores, bağlanma afinitelerini ölçmek için kullanılan bir tekniktir.
- Protein saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırarak analizi mümkün kılar.
- GFP-füzyon proteinlerin kullanımı, tespiti kolaylaştırır.
- Hücre lizatları, etkileşimler için daha fizyolojik bir bağlam sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Protein-ligand etkileşimlerinin bağlanma afinitelerini belirlemek.
- Daha doğru ölçümler için hücre lizatlarını kullanmak.
- Protein saflaştırma işlemini atlayarak süreci hızlandırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yapışkan hücre hatlarında GFP-füzyon proteinlerin aşırı ekspresyonu.
- Non-denatüre edici koşullar altında hücre lizatlarının hazırlanması.
- MST analizi için ligand seyreltmelerinin hazırlanması.
- Değişen ligand konsantrasyonlarına karşı MST sinyallerinin ölçülmesi.
Ana Sonuçlar
- MST kullanarak bağlanma afinitelerinin başarılı bir şekilde belirlenmesi.
- Yöntemin çeşitli ligandlara uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- MST ölçümlerinin veri analizi ile sonuçlarının doğrulanması.
- Protein etkileşimi çalışmalarında daha geniş uygulama potansiyeli.
Sonuçlar
- MST, protein-ligand etkileşimlerini incelemek için etkili bir yöntemdir.
- Protokol, hücre lizatlarından doğrudan analiz yapılmasını sağlar.
- Bu yaklaşım, biyokimyasal etkileşimlerin anlaşılmasını artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Determining binding affinity directly from cell lysates eliminates the bottleneck of protein purification, accelerating early-stage target validation and lead identification. This approach enables rapid assessment of protein-ligand interactions in a near-physiological context, improving predictive confidence for downstream screening campaigns. By reducing time and resource investment in protein production, the method supports higher-throughput screening of difficult targets such as transcription factors and membrane proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring binding affinities of GFP-tagged proteins to oligonucleotides, peptides, or small molecules directly from lysates.
- Operational Value: Avoids protein purification steps, reducing timelines and costs associated with expressing and isolating difficult targets like STAT3.
- Predictive Value: Provides quantitative KD measurements that support target prioritization and go/no-go decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible, quantitative binding data from lysate-based systems suitable for hit confirmation and SAR exploration.
- Scalability: Compatible with serial ligand dilution formats and capillary-based MST platforms, enabling medium-throughput affinity profiling.
- Contextual Relevance: Maintains physiological buffer conditions and tolerates detergents, preserving native protein states for more translatable interaction data.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by validating target engagement in lysate systems that reflect cellular complexity.
- Biomarker Alignment: Enables assessment of how mutations or post-translational modifications affect binding, informing structure-function relationships relevant to disease variants.
- Risk-Adjusted Advancement: Affinity data from native-like environments improves confidence in selecting leads with favorable target interaction profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a lysate-compatible alternative to purified-protein assays for affinity measurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying binding of GFP-fused transcription factors to DNA or protein ligands without purification.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lysate preparation and ligand titration, yielding reproducible MST thermophoresis curves for affinity ranking.
- Analytics: Generates KD values with standard deviations from averaged MST thermophoresis traces, providing statistical outputs for comparing ligand potency and selectivity.
- Translational Research: Connects early binding data to preclinical relevance by using lysates from disease-relevant cell models (e.g., HEK293 expressing STAT3-GFP) to assess target behavior in near-native conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lysate-based MST workflow applicable across multiple targets and ligand classes, reducing dependency on protein purification bottlenecks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through quantitative affinity measurements that reduce mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
- Operational Value: Increases standardization and reproducibility by eliminating variability introduced during protein purification and enabling direct comparison across lysate preparations.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating hit validation and reducing late-stage attrition due to poor target engagement predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lysate-derived affinity data, supporting better resource allocation in early discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent protein tagging, cell culture, and lysate preparation under non-denaturing conditions.
- Dependent on access to an MST instrument with appropriate LED excitation (e.g., 470 nm for GFP) and capillary loading capabilities.
- Necessitates standardization of lysate dilution and ligand titration protocols to maintain fluorescence within the optimal 400–1500 unit range.
- Requires optimization for different protein classes (e.g., membrane proteins may need detergent-containing buffers) and ligand solubility considerations.
- Limited by the need for detectable fluorescence changes upon binding; may require validation for ligands that induce minimal thermophoresis shifts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Cell Lysate
4:02
Microscale Thermophoresis Binding Studies
7:05
Microscale Thermophoresis Data Analysis
8:25
Results: Measuring the Affinity of Non-phosphorylated STAT3 Protein Binding to Oligonucleotides
9:40
Conclusion
3:20
Determination of Optimal Lysate Dilution
