Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, proteini bir hücre lizatından saflaştırmadan, bir protein ligand etkileşiminin bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen GFP füzyon proteininin herhangi bir adherent hücre hattında eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre lizatı ve ligand dilüsyonlarının hazırlanmasını takiben, hücre lizatı ligand karışımları hazırlanır ve kapilerlere yüklenir.

Ardından, farklı ligand konsantrasyonları varlığında GFP füzyon proteininin termoforesi ölçülür. Son adım, mikroölçekli termofores veya MST ölçümlerinin veri analizidir. Nihayetinde, mikroölçekli termofores, GFP füzyon proteinleri ile çeşitli ligandlar arasındaki etkileşimlerin bağlanma afinitelerini belirlemek için kullanılır.

Bu tekniğin titrasyon, kalorimetri veya yüzey plazmon rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein saflaştırmayı gerektirmemesi, böylece ikili etkileşimlerin kantitatif karakterizasyonunu önemli ölçüde basitleştirmesi ve hızlandırmasıdır. Bu yöntem, membran proteinleri ve transkripsiyon faktörleri gibi ekspresyonu ve saflaştırılması zor olan proteinlerle çalışırken önemli avantajlar sunar. Mikroölçekli termoforezin en büyük avantajlarından biri, çeşitli tamponlarda çalışabilmesi ve sistemdeki deterjanların ve hücrelerin varlığını tolere edebilmesidir. Tekniği, laboratuvarımdan biyolog Karen Stefka gösterecektir. Başlamak için, T 75 flask başına 10 mililitre tampon kullanarak hücreleri buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ile kısaca yıkayın.

Hücreleri beş dakika boyunca veya flasktan ayrılmaya başlayana kadar buz üzerinde bekletin. Gerekirse, ayırmak için hücreleri hücre kazıyıcı ile kazıyın. Hücreleri 10 milliliters buz soğukluğunda PBS içinde yeniden süspande edin ve önceden soğutulmuş 14 milliliters yuvarlak tabanlı santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri 400 ila 600 Gs'de ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Süpernatanı uzaklaştırın ve pellet'i 200 microliter buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspande edin. Sitozolik proteinlerin ekstraksiyonu için süspansiyonu önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın.

Lokal aşırı ısınmayı en aza indirmek için hücreleri buza yerleştirin ve %30 genlikle, üç kez on saniyelik sonikasyon darbeleriyle hücreleri lize edin. İki ila üç milimetrelik önceden soğutulmuş bir uç kullanarak, köpürmeyi en aza indirmek için ucu yüzeyin altında tutun. Deterjan içeren tampon kullandığınızda bu adımı atlayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Bunun yerine, gerekirse beş molar sodyum klorür stok çözeltisi kullanarak lizat çözeltisini 100 millimolar sodyum klorür fizyolojik tuz konsantrasyonuna getirin. Son olarak, lizatları yaklaşık 25, 000 Gs ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. MST cihazı üzerinde dalga boyu 470 nanometreye eşit olan ışık yayan diyot veya LED eksitasyon kaynağını seçin.

MST tamponu ile 2 ve 10 kat seyreltilmiş hücre ekstraktlarını kapillerlere yükleyin ve bunları MST cihazına yerleştirin. MST cihazının kontrol yazılımı üzerinden kapillerleri bulma (find capillaries) işlemini gerçekleştirin. Seyreltilmiş lizattaki optimal floresan aralığı 400 ile 1500 floresan birimi arasındadır.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde optimal ligand konsantrasyon aralığını belirleme işlemine geçin. Gerekli sayıda 0,5 milliliter düşük bağlanma özellikli santrifüj tüpü içeren bir tüp rafını buz üzerine yerleştirin; her tüpün tabanına 25 microliters MST tamponu pipetleyin, ilk tüpe 25 microliters ligand stok çözeltisi ekleyin ve kalan tüpleri kullanarak ligandın seri iki katlı seyreltmesini gerçekleştirin. Ligand örneklerinin bulunduğu rafı buz üzerinde tutun.

Bağlanma reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimal seviyesini elde etmek için hücre lizatı dilüsyonunu hesaplayın. Nihai protein konsantrasyonu, beklenen bağlanma disosiyasyon sabitine yakın veya daha düşük olmalı ve gerekli floresans sayım sayısını elde edecek şekilde ayarlanmalıdır. Nihai çözeltide, hücre lizatını MST Tamponu ile seyrelterek işleme devam edin.

Düşük bağlanma özellikli 0,5 mililitre tüpleri, ligand seri dilüsyon örneklerinin bulunduğu tüplerin karşısındaki tüp rafına yerleştirin. Her tüpün dibine dikkatlice 15 mikrolitre hücre lizatı ekleyin. Örnek kaybını önlemek için tüp duvarlarına değdirmemeye çalışın.

En yüksek konsantrasyona sahip ligand örneğinden 15 µL'yi ilgili tüpe ekleyin. Hücre lizatı içeren bir numaralı tüpe ekleme yapın. İyice karıştırın ve pipet ucunu değiştirin.

Son tüp hariç diğer tüm tüpler için bu adımı tekrarlayın; son tüpte ligand bulunmamalıdır. Son tüpe 15 µL MST tamponu ekleyin ve karıştırın. İlk kılcal borunun yaklaşık üçte ikisini bir numaralı tüpteki bağlanma karışımıyla doldurun.

Çözeltiyi merkeze doğru hareket ettirmek için eğin ve kılcal boruyu kılcal boru tepsisindeki birinci konuma yerleştirin; bu adımı diğer kılcal borularla tekrarlayın. Daha uzun süreli deneyler için kılcal boru uçları balmumu ile tıkanabilir.

Tepsiyi MST cihazının içine yerleştirin ve cihaz kapağını kapatın. Ardından, dalga boyu 470 nanometre olan LED eksitasyon kaynağını seçin. Kılcal tüplerin tam konumlarının belirlenmesi ve floresan sinyal yoğunluğuna göre örneklerin floresansının ölçülmesi için MST cihazında "find capillaries" (kılcal tüpleri bul) komutunu çalıştırın.

LED gücünü 400 ile 1500 birim aralığına getirmek için ayarlayın. Termal Direnç Deneyini gerçekleştirmek için başlat düğmesine tıklayın. Deney için birden fazla kızılötesi lazer gücü seçilebilir.

Söz konusu sistem için optimal sıcaklık gradyanını belirlemek amacıyla, 16 kılcal tüpten oluşan bir seti çalıştırmak 10 ila 12 dakika sürer. Ölçümlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için aynı kılcal tüp setiyle iki ila üç çalışma gerçekleştirerek veri toplayın. Veri analizine başlamak için analiz yazılımını açın ve proje klasörünü yükleyin.

Görünen bilgi çalıştırma görüntüleyicisinde, belirli bir IR lazer gücünde toplanmış termoretik eğrileri seçin. Çeşitli koşullar altında toplanan tüm termoretik izlerini aynı anda açma ve ardından bunları açıp kapatarak analiz için herhangi bir eğriyi seçme seçeneği mevcuttu. Değerlendirme noktaları grafik penceresinde, T sıçramalı mavi ve kırmızı çizgilerle termorezistans veya termoferezi seçin.

Yazılım tarafından analiz için manuel olarak seçilen deney eğrilerinin iki bölgesini tanımlayın. Thermo Resis değerindeki maksimum değişimi sağlamak için mavi ve kırmızı çizgilerin doğru şekilde konumlandırıldığından emin olun. Standart sapmalarıyla birlikte ortalama nokteleri elde etmek için "use average" (ortalamayı kullan) seçeneğini seçin veya ayrı deneyler için "distinguish runs" (deneyleri ayır) seçeneğini kullanın.

Bir disosiyasyon sabiti uyumu çizmek için, ortalamayı kullan seçeneğini belirleyin, etiketli molekül konsantrasyon değerini girip sabitleyin ve eğriyi uydurun. Bağlanma disosiyasyon sabiti veya KD değeri, standart sapmasıyla birlikte ayrı bir bilgi açılır penceresinde görünür. Ortalama uyum verilerini bir metin dosyasına kaydedin ve Excel'e aktarın.Heck.

STAT 3G FP eksprese eden 2 9 3 hücreleri, floresan işaretli stat üç kaynağı olarak kullanıldı. A için DNA bağlanma analizinde, yüksek yüklü oligonükleotidlerin bağlanması STAT üç mobilitesinde belirgin değişikliklere yol açtı. Sıcaklık gradyanında.

Termometrik sinyal, oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür. Her bir veri noktası, üç ölçümün ortalamasını temsil etmektedir. Görünür KD değerlerini belirlemek ve uyum sağlamak için Nano temporal analiz yazılımı kullanılmıştır.

Görünür disosiyasyon sabitleri, gas motifine bağlanma için 37,9 ± 1,0 µM ve AT zengini s+100 oligonükleotidine bağlanma için 23,3 ± 0,6 µM olarak belirlenmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, s+100 dizileri gas dizilerine göre biraz daha sıkı bir bağlanma göstermiştir. Üç ölçüm tekrarında, A'dan G'ye yapılan substitusyon, s+100 mutant 1'in afinitesinde dramatik bir azalmaya yol açmıştır.

S artı 100 mutant ikisi tespit edilebilir bir bağlanma göstermezken, bu durum STAT üçün s artı 100'e olan sekans seçici bağlanmasını doğrulamıştır. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde iki saatten kısa bir sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, membran proteinlerinin ekstraksiyonu için optimal koşulların farklı proteinler için farklılık göstereceğini ve genellikle optimizasyon gerektirdiğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir proteinin hücre lizatından protein saflaştırması yapmadan bir ligandla olan bağlanma afinitesinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.