Name: Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin mikro ölçekli termoforez yöntemiyle hücre lizatlarından protein-ligand bağlanma afinitesini saflaştırma yapmadan nasıl belirleyeceğinizi. GFP füzyonlu proteinler kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gelen ve federal fonların, NCI ve Calidris Tedavi arasındaki işbirliği araştırma Anlaşma,, OT için Amerikan Kanser Derneği hibe IRG 97-152-17 Bu çalışma kısmen NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir sözleşme HHSN26120080001E altında Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH,.

1. Hücre lizatının hazırlanması Bu protokol, bir GFP kaynaşık proteini ifade yapışık hücreler için tasarlanmıştır. Gerekli hücre sayısı protein ifade seviyesine bağlı olarak, gibi düşük bir çok 20 x 10 6 hücre 6 10 olarak değişebilir. Örneğin, HEK hücreleri eksprese GFP-STAT3 lizat 1 mL lizis tamponu ile% 70 yakın konfluent 10 T75 şişeleri içinde yetiştirilen hücreler muamele etmek suretiyle hazırlandı. Bununla birlikte, bu lizat MST deney için optimum seviyede floresan sağlamak üzere 150-kat sulandırılmış gerekiyordu. Hücre parçalama protokolü araştırılmaktadır özellikleri ve proteinin hücre içi lokalizasyonu kuvvetle bağlıdır. Deterjan kullanarak, çünkü protein istikrarsızlık istenmeyen ise, sonikasyon aşağıda açıklanan, en iyi seçenek olabilir. Farklı katkı maddeleri protein modifikasyonu reaksiyonları önlemek için lizis tamponu ilave edilebilir: EDTA fosforilasyon engeller, sodyum vanadat, böylece tirozin protein fosfatazlar inhibefenoksimetilpenisilin florür Ser / Thr fosfatazların bir inhibitörüdür. <ol><li> Lizis tamponu hazırlayın. Kolay elde sitoplazmik proteinler için aşağıdaki bileşime iyi çalışır: 25 mM Tris HCI, pH 8.0, ve proteaz inhibitörü kokteyl, 2 mM AEBSF, 0.3 uM aprotinin, 130 uM Bestatin, oluşan 100 kat (Sigma-Aldrich P2714, seyreltilmiş 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM löpeptin). Alternatif olarak, daha az çözünür proteinler için, bir proteaz inhibitörleri kokteyli ve denatüre edici olmayan deterjan ile ticari RIPA tampon kullanabilir. Buz üzerinde tampon tutun. </li><li> Buz gibi soğuk PBS T75 şişesi başına tampon 10 ml kullanarak kısa bir süre hücreleri yıkayın. 5 dakika buz üzerinde hücre tutmak kadar veya hücreler şişeden ayırma başlar. Gerekirse ayırmak için hücre kazıyıcı ile hücreleri kazıyın. </li><li> 10 ml buz gibi soğuk PBS ile önceden soğutulmuş bir 14 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne transfer süspansiyon hücreleri. </li><li> 4 de 400-600 x g&#39;de santrifüj ile topak hücrelere ° C 5 dakika. Ben bu noktada birkaç matara hücreleri birleştirinf gerekli. </li><li> Buz gibi soğuk lizis tamponu 200 ul PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet kaldırmak, bir ön süspansiyon aktarılması 1.5 ml Eppendorf tüp soğutulmuş. </li><li> Yerel aşırı ısınma en aza indirmek için buz üzerinde hücreleri tutun. Önceden soğutulmuş ucu 2-3 mm ile% 30 genlikte sonication 3x 10 sn bakliyat, hücreleri lyse. Yüzeyinin altında ucu frothing en aza indirmek için tutun. Bunun yerine 30 dakika boyunca buz üzerinde deterjan içeren tampon ve inkübe kullanılıyorsa bu adımı sayın. </li><li> Fizyolojik tuz konsantrasyonu (100 mM NaCI) 5 M NaCI kullanılarak gerektiğinde içeren Lizat çözeltisi düzeltin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 26,000 x g&#39;de santrifüj ile lizatları toplayın. </li><li> Optimum seyreltme lizat (aşağıda Bölüm 3, açıklandığı gibi) ve bir titrasyon (önceden seyreltilmiş lizat tipik olarak yaklaşık 300 ul) için gerekli lizat miktarını belirler. </li><li> Inceleme altındaki bir protein (-80 ° C, bir çok durumda) için uygun bir sıcaklıkta kısım lizat ve saklayın. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST Tampon seçimi ve hazırlanması <ol><li> Protein-ligand etkileşimleri tampon şartlarına bağlı olduğu için, MST, tampon bileşimi, belirli bir sistemin özelliklerine bağlı olarak seçilir. Bu, en az iki farklı tampon test etmek için genel olarak avantajlıdır. </li><li> 2 5x MST tamponlar hazırlayın. Ve Tris HCI (250 mM Tris HCI, pH 7.4, 750 mM NaCI, 50 HEPES (, 25 mM MgCl2,, 500 mM NaCI,% 0.25 NP-40, 250 mM HEPES, pH 7.4): Bu iki bileşimler ile iyi deneyimleri mM MgCl2,% 0.05 Tween-20). BSA ilavesi (son bağlayıcı karışım 5%) plastik tüpler ve cam kılcal proteinlerin yapışmasını önlemeye yardımcı olabilir. NaN3 (0.5 mm) de mikroorganizmaların büyümesini engellemek için dahil edilebilir. </li></ol> 3. Optimal Lizat Seyreltme Belirlenmesi <ol><li> Dalga boyu ile LED uyarma kaynağı seçin λ MST cihaz üzerinde = 470 nm. </li><li> Ce ile kılcal Yük2 seyreltilmiş ve MST tamponu ile 10x ayıklamak edeceğiz. </li><li> MST aletin Kontrol Yazılımı &quot;Kılcal bul&quot; işlemi gerçekleştirin. Sulandırılmış lizatında uygun floresan aralığı 400 ila 1500 floresans birimleri olup. </li></ol> 4. Optimal Ligand Konsantrasyon aralığı belirlenmesi <ol><li> Ligandın en yüksek konsantrasyon beklenen ayrışma sabiti en az 20x daha yüksek olmalıdır. </li><li> Düşük ligand konsantrasyonunun floresan protein molar konsantrasyonundan daha düşük olmalıdır. </li></ol> Ligand konsantrasyon aralığı tahmini için NanoTemper Teknolojileri Konsantrasyon Bulucu aracı bakın. 5. Hücre lisatı ve ligand çözeltiler hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde 0.5 ml LoBind santrifüj tüpleri gerekli bir dizi (genellikle 10-16) ile bir tüp raf yerleştirin. Her bir tüpün alt MST tampon pipetle 25 ul. Birinci küvet ligand stok solüsyonu 25 ul ekleE (# 1, ligandı en yüksek konsantrasyon) ve tüp dinlenme kullanarak ligandın iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. Buz üzerinde ligand örnekleri ile raf tutun. </li><li> Çözülme hücre buz üzerinde yavaşça lizat. </li><li> Bağlama reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimum seviyesini sağlamak için MST tampon maddesi ile hücre lizatı seyreltin. Nihai protein konsantrasyonu tahmin Kd veya daha düşük yakın olmalıdır. Bu nihai çözüm floresan sayıları gerekli olan sayı elde etmek için ayarlanmalıdır. Lizat GFP-STAT3 konsantrasyonunun belirlenmesi için, alet floresein bir yardımı ile kalibre edildi. Lizattaki GFP molar konsantrasyonu sırasıyla floresein ve EGFP kuantum verimleri, 0.85 ve 0.61 oranı ile tespit edildi. 15 </li></ol> 6. Mikro Termoforosis Bağlama Çalışmaları <ol><li> MST cihaz üzerinde λ = 470 nm ile LED uyarma kaynağını seçin. </li><li> T yerleştirin 0.5 ml LoBind tüplerligand seri seyreltme örnekleri ile tüpler karşısında ube raf. Dikkatle Her tüpün alt hücre lizatı 15 ul ekle. Örnek kaybını önlemek için tüp duvarları dokunmamaya gayret edin. </li><li> Hücre lizatı ile ilgili tüp en yüksek konsantrasyonu (# 1) # 1 ile ligandın Örnek 15 ul ekle. İyice karıştırın ve bir pipet değiştirin. Ligand içermelidir sonuncusu hariç tüplerin geri kalanı ile bu adımı tekrar edin. </li><li> Son tüp MST tampon 15 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tüp # 1 bağlayıcı karışımı ile yaklaşık 2/3 ilk kılcal doldurun, bu merkeze doğru çözüm taşımak için eğin, ve (tepsi açılış en yakın konumu) pozisyon # 1 kılcal tepsiye kılcal yerleştirin . Geri kalanı kılcal ile bu adımı yineleyin. Kılcal biter uzun deneyler için balmumu ile takılabilir. </li><li> MST araç içindeki tepsi yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın. </li><li> &quot;Kılcal Bul&quot; gerçekleştirkomutu alet kılcal damarların tam pozisyon bulmak ve örneklerin floresan ölçmek izin. </li><li> Floresan sinyal yoğunluğuna göre, 400-1,500 birimleri aralığı haline getirmek için LED güç (% 10-100 itibaren) ayarlayın. </li><li> Termoforosis deney gerçekleştirmek için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. Birden fazla kızılötesi lazer güç belirli bir sistem için optimal sıcaklık gradyanı bulmak için deney için seçilebilir. Ölçümlerin tekrarlanabilirliği sağlamak için kılcal damarların aynı seti 2-3 çalışır veri toplamak. Bu 16 kılcal damarların bir set çalıştırmak için 10-12 dakika sürer. </li></ol> 7. Mikro Termoforosis Veri Analizi <ol><li> Analiz yazılımını açın. </li><li> Proje klasörü yükleyin. Ortaya Bilgi Çalıştır Görüntüleyici seçtiğiniz belirli bir IR lazer güç thermophoretic eğrileri toplanan. Bu IR lazer gücü gibi çeşitli koşullar altında toplanan tüm thermophoretic izleri açma bir seçenek vardır, s LEDOver, sıcaklık, konsantrasyon, vb. az bir kez ve daha sonra onlara ve kapatarak analiz için herhangi bir eğrileri seçerek (deney adı tıklayın). </li><li> Değerlendirme Puan grafik penceresinde, T-atlama ile Termoforosis veya Termoforosis seçin. Mavi ve kırmızı çizgiler doğru konumda olduğundan emin olun. Standart sapma ile ortalama puan alma, seçme &quot;Ortalama Kullanım&quot; veya ayrı çalışan için &quot;ayırt çalışır&quot;. </li><li> Bir ayrışma sabit uygun arsa, etiketli molekül konsantrasyonu değeri (bir uyum pencere menüsündeki &quot;konsantrasyon&quot; kare kontrol) girin ve düzeltmek, &quot;Ortalama Kullanım&quot; seçin ve eğri uygun. Standart sapma ile K D değeri ayrı bir bilgi pop-up penceresi görünür. Tepesi yöntemi kullanarak bir uyum çizmek için, Hill yöntemi &quot;ortalama&quot; seçin ve sonra eğri uygun. Standart sapma ile EC 50 benzerlik değeri, bu durumda gösterilmiştir. Zaman doygunluk K D veya Tepesi &quot;sınır&quot; özelliği de kullanılabilirBir bağlı durumda ulaşmış değildir. </li><li> Bir metin dosyasına ortalama uyum verileri kaydetmek ve Excel&#39;e aktarmak. </li><li> Arsa F normu (normalleştirilmiş floresan), mesafe kadar taşınmış normuna (farklı deney karşılaştırılırsa normalleştirilmiş floresan fark), ya da bir kısmı, etiketsiz (titre) molekül konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak (bakınız, aşağıdaki formül) bağlanmıştır. </li></ol> Fraksiyon (karmaşık bir molekül fraksiyonu) = (Therm, (C)-serbest) / (ilişkili-bağlı olmayan), termal (C) konsantrasyonu C ölçülen Termoforosis olduğu, Bound bağlanmamış (moleküller olduğunda ilişkisiz bir durum için olan Termoforosis bir karmaşık) ve bağlı tamamen bağlı devlet için Termoforosis olduğunu.

<ol><li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li>
<li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-protein+binding%3A+a+critical+review+of+analytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+a+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li>
<li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway+at+twenty%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li>
<li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li>
<li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Bu yayının içeriği mutlaka Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı görüş ve politikalarını yansıtmamaktadır, ne de ticari isimler, ticari ürünler, veya kuruluşların söz ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, ancak, en güncel olarak kullanılan yöntem ile etkileşimleri &quot;Kd belirlenmesi için gerekli olan bir zahmetli ve pahalı bir adımdır. MST uygulanması önemli ölçüde etkileşimlerinin kantitatif karakterizasyonu basitleştirilmesi ve hızlandırılması böylece protein saflaştırma kaçınarak sağlar. Bu tür bir zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri olarak zor olan açıklama ve saflaştırmak proteinler durumunda, özellikle önemli bir avantaj sunar. <p class="jove_conten...

Moleküller arası etkileşim yakınlık nicel karakterizasyonu biyomedikal araştırma birçok alanda önemlidir. Bağlama sabiti (Kd) ayrılma sadece ilaç keşfi değil, aynı zamanda gerekli olan herhangi bir biyolojik sistem herhangi bir ikili etkileşim karakterizasyonu önemli bir parametredir. Bu immunoprecipitation ve maya iki hibrit ekran gibi protein-protein etkileşimleri tespiti için kullanılan biyokimyasal yöntemler, yakınlık bu özel kompleks in vivo olarak verilen koşullar altında olup olmadığını tanımlar iken nasıl sıkı bu etkileşimler vardır bize haber yok. Ilaç keşfi işlemde, bağlanma tahlili geliştirilmesi gerekli ve sıklıkla en çok zaman tüketen aşamalar biridir. K D belirlenmesi En sık kullanılan yöntemler floresan polarizasyon, 1 yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisi, 2 radyo-bağlama, 3 izotermal titrasyon kalorimetre, 4 equilibri dahilum diyaliz (ED), 5 ultrafiltrasyon (UF), 5 ve ultra-santrifüj (UC). 6 bunların tüm hedef saflaştırılmış proteinin önemli miktarlarda gerektirir. Mikro Termoforosis (MST) bir mikroskobik sıcaklık degrade moleküllerin yönelik hareketi algılayan hızla gelişen bir yöntemdir. Sıcaklık eğimi boyunca hareket göreli bir değişiklik biyomoleküllerin sonucu hidrasyon kabuk herhangi bir değişiklik. 7 MST bağlanma afiniteleri belirlemek için kullanılan ve bir hedef proteine ​​floresan ile etiketlenmiş proteinleri, ya da floresan ligandlarına ligand incelemek için uygulanmıştır. 8, 9 MST bir yüzeye immobilizasyon ihtiyacı (immobilizasyon-ücretsiz teknolojisi) doğrudan çözüm etkileşimleri ölçümü sağlar. Değişikliğin boyutunu önemli ölçüde sistemden sisteme farklı olmasına rağmen, pratik olarak herhangi bir bağlayıcı, MST sinyali bir değişiklik eşlik eder. MST tarafından molekülün hareket tespiti için, floresan gerekirnt. Yöntemin bu büyük sınırlama bir avantaj dönüştürülebilir. Bir protein herhangi bir sistem, bir GFP füzyon olarak ifade edilirse, bu tek flüoresan molekül olacak ve böylece hücre lizatı veya hücre içermeyen ekspresyon sisteminden izole edilmeden incelenebilir. Az eserler ile bağlama koşulları için izin hücre lizatları üretimi önemli bir sorundur. Burada birçok Çözünür ve zar proteinleri için kullanılabilir hücre lizatı hazırlanması ve MST deney bir protokol açıklamaktadır. STAT proteinleri hücre dışı sinyallere yanıt olarak tirosin fosforilasyon ile aktif hale sitoplazmik transkripsiyon faktörleri gizli olan ve bağışıklık, hematopoiez, iltihaplanma, ve gelişme. Memelilerde 10 de dahil olmak üzere birçok biyolojik proseslerde yer alan, STAT etti STAT 1, 2, 3, 4 oluşmaktadır , 5A, 5B ve 6. Bütün aktif STAT aynı DNA sekansına bağlamak için bilinen, bu nedenle GAZ motifi olarak adlandırılan, IFN-gama sekansı aktifleştirildi. Bununla birlikte, transcriFarklı STAT bir ptional etkileri çok farklıdır. 11. birçok patolojik süreçler ve 17.000 yayınlar üzerinde verimli yoğun çalışmalar karışmakla rağmen, farklı DNA dizileri ile STAT etkileşimleri K D belirlenmemiştir. GAZ motifinin varyantlarına farklı durum arasında sadece göreli afinite karakterize edilmiştir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, 11 güçlükler istatistik &#39;DNA bağlama seçicilik karakterizasyonu en önemli engeller vardır. Çalışmaların çoğunluğu Tyr-fosforile transkripsiyon faktörü için eş anlamlı hale geldi &quot;aktif&quot; STAT, transkripsiyon düzenlenmesi olmayan fosforile STAT (U-STAT) rolü rolü odaklanmış olmasına rağmen hızla ortaya çıkmaktadır. 12. Ancak, bu mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ve U-STAT aslında DNA bağlamak ya da diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşim yoluyla hareket kesin değildi vardır. Yakın zamanda U-STAT3 DNA istif bağlamak göstermiştirdaha yüksek afinite ile GAZ motifleri farklı ces. 13 bulgu bu önemli proteinin biyolojik fonksiyonları anlayışımızı için önemli etkileri vardır. Biz GAZ için STAT3 göreceli yakınlık belirlemek için mikro Termoforosis uygulanan ve AT-zengin oligonükleotid S +100 (Şekil 4) var. Hemen hemen aynı protokol farklı bir STAT3 ligandı bir lipopeptid inhibitör bağlanma için Kd tayini için kullanılmıştır. 14, negatif bir kontrol olarak kullanılmıştır ilgili bir transkripsiyon faktörü, GFP STAT1 bağlanma Resim böylece etkileşim seçiciliği teyit saptanabilir. 14

<table><tbody><tr><td>RIPA tamponu</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td>Diğer üreticilerin tamponları da çalışır</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörleri kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Monolit NT.115</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>G008</td><td></td></tr><tr><td>Monolit NT.115 Kılcal Tepsi</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>Monolit NT.115 Standart İşlem Görmüş Kılcal damarlar</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>K002</td><td></td></tr><tr><td>NT Kontrol yazılımı</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>2.0.2.29</td><td></td></tr><tr><td>NT Analiz yazılımı</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>1.4.27</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td> Protein LoBind Tüpü sağlayan <td>diğer mikrotüp soğutmalı santrifüjler </td></tr><tr><td>0.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td></td></tr></tbody></table>

mikro termoforosis tarafından bağlama affinity belirlenmesi protein saflaştırma-ücretsiz yöntemi

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein etkileşimleri kantitatif karakterizasyonu özellikle yaşam bilimleri, ilaç keşfi hemen her alanında gereklidir. K D tayin mevcut yöntemlerin çoğu zaman alıcı ve pahalı olabilir nesil olan ilgi protein, saflaştırılmış erişim gerektirir. Bu hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan mikro Termoforosis (MST) ile bağlanma afinitesinin belirlenmesine olanak sağlayan bir protokol geliştirmiştir. Yöntem, denatüre edici olmayan koşullar altında GFP kaynaşık protein ve hücre lisisinin aşırı içerir. STAT3-GFP yönteminin uygulanması geçici olarak ilk kez farklı dizileri ile oligonükleotidler için en iyi incelenmiş olan transkripsiyon faktörünün afinitesini belirlemek için izin HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Protokol basittir ve küçük moleküller, peptidler, DNA, RNA ile protein etkileşimleri çalışmak için uygulama çeşitli olabilir, ve proteins.

Oligonükleotidler için bağlayıcı olmayan fosforile STAT3 protein afinitesi ölçülmesi. STAT3-GFP eksprese eden HEK293 hücreleri DNA bağlama deneyi için floresan etiketli STAT3 kaynağı olarak kullanılmıştır. Hücre lizatları RIPA tamponu (20x10 6 hücre / ml) kullanılarak hazırlandı. Bağlama çalışmaları için, lizatları bağlanma reaksiyonu (20 nM) &#39;de floresan protein en uygun düzeyde sağlamak için MST DNA bağlayıcı tampon maddesi ile 150x seyreltilmiştir. Sigara tran...

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Bu prosedürün genel amacı, proteini bir hücre lizatından saflaştırmadan, bir protein ligand etkileşiminin bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen GFP füzyon proteininin herhangi bir adherent hücre hattında eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre lizatı ve ligand dilüsyonlarının hazırlanmasını takiben, hücre lizatı ligand karışımları hazırlanır ve kapilerlere yüklenir.Ardından, farklı ligand konsantrasyonları varlığında GFP füzyon proteininin termoforesi ölçülür. Son adım, mikroölçekli termofores veya MST ölçümlerinin veri analizidir. Nihayetinde, mikroölçekli termofores, GFP füzyon proteinleri ile çeşitli ligandlar arasındaki etkileşimlerin bağlanma afinitelerini belirlemek için kullanılır.Bu tekniğin titrasyon, kalorimetri veya yüzey plazmon rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein saflaştırmayı gerektirmemesi, böylece ikili etkileşimlerin kantitatif karakterizasyonunu önemli ölçüde basitleştirmesi ve hızlandırmasıdır. Bu yöntem, membran proteinleri ve transkripsiyon faktörleri gibi ekspresyonu ve saflaştırılması zor olan proteinlerle çalışırken önemli avantajlar sunar. Mikroölçekli termoforezin en büyük avantajlarından biri, ç

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu video, protein-lipid etkileşimini incelemek için mikro ölçekli termoforezi göstermektedir. Tahlil, bir sıcaklık gradyanına yanıt olarak floresan etiketli proteinlerin termoforetik hareketini ölçerek moleküller arasındaki etkileşimi tespit eder. Floresan molekülü, floresan olmayan lipid moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile karıştırılır ve çözeltideki moleküllerin karışımı kılcal damarlara yüklenir. Kılcal damarlardaki numunelere bir sıcaklık gradyanı uygulanır ve floresan molekülünün...

Çözeltideki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için mikro ölçekli termoforez

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Öğrenin mikro ölçekli termoforez yöntemiyle hücre lizatlarından protein-ligand bağlanma afinitesini saflaştırma yapmadan nasıl belirleyeceğinizi. GFP füzyonlu proteinler kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Daha fazla video keşfet