Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, proteini bir hücre lizatından saflaştırmadan bir protein ligand etkileşiminin bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu, ilk olarak herhangi bir yapışık hücre hattında ilgilenilen GFP kaynaşmış proteininin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre lizat ve ligand seyreltmelerinin hazırlanmasını takiben, hücre lizat ligand karışımları hazırlanır ve kılcal damarlara yüklenir.

Daha sonra, değişen ligand konsantrasyonlarının varlığında GFP kaynaşmış proteinin termo direnci ölçülür. Son adım, mikro ölçekli termo ferez veya MST ölçümlerinin veri analizidir. Sonuç olarak, GFP kaynaşmış proteinler ve çeşitli ligandlar arasındaki etkileşimlerin bağlanma afinitelerini belirlemek için mikro ölçekli termo resis kullanılır.

Titrasyon, kalorimetri veya yüzey plazma mono gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, protein saflaştırılmasını, ikili etkileşimlerin önemli ölçüde basitleştirici ve hızlandırıcı kantitatif karakterizasyonunu önlemesidir. Bu yöntem, zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri gibi ifade edilmesi ve saflaştırılması zor proteinlerle çalışırken önemli avantajlar sunar. Mikro ölçekli termo ferezin en büyük avantajlarından biri, çeşitli tamponlarda çalışması ve sistemdeki deterjanların ve hücrelerimin varlığını tolere etmesidir Tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir biyolog olan Karen Stefka olacaktır Başlamak için, hücreleri buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ile kısa bir süre yıkayın T 75 şişesi başına 10 mililitre tampon kullanarak.

Hücreleri beş dakika boyunca veya şişeden ayrılmaya başlayana kadar buz üzerinde tutun. Gerekirse ayırmak için hücreleri hücre kazıyıcı ile kazıyın. Hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın ve önceden soğutulmuş 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 400 ila 600 Gs ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Sitozolik proteinlerin ekstraksiyonu için süspansiyonu önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne aktarın.

Yerel aşırı ısınmayı en aza indirmek için hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri% 30 genlikte üç kez on saniyelik sonikasyon darbeleri ile leyin. İki ila üç milimetrelik bir ön soğutma ucu kullanarak, köpürmeyi en aza indirmek için ucu yüzeyin altında tutun. Tampon içeren deterjan kullanırken bu adımı atlayın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Bunun yerine, lizat çözeltisini, gerekirse beş molar sodyum klorür stok çözeltisinden 100 milimolar sodyum klorür fizyolojik tuz konsantrasyonu içerecek şekilde düzeltin. Son olarak, lizatları 10 dakika boyunca yaklaşık 25.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. MST cihazında dalga boyu 470 nanometreye eşit olan ışık yayan diyotu veya LED uyarma kaynağını seçin.

MST tamponu ile iki ve 10 kez seyreltilmiş hücre özütü ile kılcal damarları yükleyin ve bunları MST cihazına yerleştirin. MST cihazının kontrol yazılımında kılcal damarları bulma işlemini gerçekleştirin. Seyreltilmiş lizattaki optimum floresan aralığı 400 ila 1500 floresan birimidir.

Metin protokolünde açıklandığı gibi optimal ligand konsantrasyon aralığını belirlemeye devam edin. Buz pipetine gerekli sayıda 0,5 mililitre düşük bağlamalı santrifüj tüpü içeren bir tüp rafı yerleştirin, her tüpün dibine 25 mikrolitre MST tamponu yerleştirin, ilk tüpe 25 mikrolitre ligand stok çözeltisi yerleştirin ve tüplerin geri kalanını kullanarak ligandın seri iki kat seyreltmesini gerçekleştirin. Ligand örneklerini içeren rafı buz üzerinde tutun.

Bağlanma reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimal seviyesini elde etmek için hücre lizat seyreltmesini hesaplayın. Nihai protein konsantrasyonu, beklenen bağlanma ayrışma sabitine yakın veya daha düşük olmalı ve gerekli sayıda floresan sayısı elde etmek için ayarlanmalıdır. Son çözeltide, hücre lizatını MST Tamponu ile seyreltmeye devam edin.

0.5 mililitrelik düşük bağlama tüplerini, ligand seri seyreltme numuneleri olan tüplerin karşısındaki tüp rafına yerleştirin. Her tüpün dibine dikkatlice 15 mikrolitre hücre lizatı ekleyin. Numune kaybını önlemek için tüp duvarlarına dokunmamaya çalışın.

İlgili tüpe en yüksek konsantrasyona sahip 15 mikrolitre ligand numunesi ekleyin. Birincisi, hücre lizatı ile. İyice karıştırın ve pipet ucunu değiştirin.

Bu adımı, ligand içermemesi gereken sonuncusu hariç diğer tüplerle tekrarlayın. Son tüpe 15 mikrolitre MST tamponu ekleyin ve karıştırın. İlk kılcal damarın yaklaşık üçte ikisini bir numaralı tüpten gelen bağlayıcı karışımla doldurun.

Çözeltiyi merkeze doğru hareket ettirmek için eğin ve kılcal damarı kılcal tepsinin üzerine konumuna yerleştirin. Birincisi, bu adımı kılcal damarların geri kalanıyla tekrarlayın. Kılcal uçlar daha uzun deneyler için balmumu ile tıkanabilir.

Tepsiyi MST cihazının içine yerleştirin ve cihaz kapağını kapatın. Ardından, dalga boyu 470 nanometreye eşit olan LED uyarma kaynağını seçin. MST cihazında, cihazın kılcal damarların tam konumlarını bulmasına ve floresan sinyal yoğunluğuna dayalı olarak numunelerin floresansını ölçmesine izin vermek için kılcal damarları bul komutunu gerçekleştirin.

LED gücünü 400 ila 1500 birim aralığına getirecek şekilde ayarlayın. Thermo Resis Deneyini gerçekleştirmek için başlat düğmesine tıklayın. Deney için birden fazla kızılötesi lazer gücü seçilebilir.

Belirli bir sistem için en uygun sıcaklık gradyanını bulmak için, 16 kılcal damardan oluşan bir seti çalıştırmak 10 ila 12 dakika sürer. Ölçümlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için aynı kılcal damar seti için iki ila üç çalıştırmadan veri toplayın. Veri analizine başlamak için analiz yazılımını açın ve proje klasörünü yükleyin.

Görünen bilgilerde, belirli bir IR lazer gücü termo retic eğrilerinde toplanan görüntüleyiciyi çalıştırın. Çeşitli koşullar altında toplanan tüm termoretik izleri bir kerede açma ve ardından bunları açıp kapatarak analiz için herhangi bir eğriyi seçme seçeneği vardı. Değerlendirme noktaları grafiği penceresinde, T atlama mavisi ve kırmızı çizgilerle termo resis veya termo ferezi seçin.

Yazılım tarafından analiz için manuel olarak seçilen deneysel eğrilerin iki bölgesini tanımlayın. Thermo Resis'te maksimum değişikliği sağlamak için mavi ve kırmızı çizgilerin doğru konumlandırıldığından emin olun. Standart sapmalarla ortalama noktaları elde etmek için, ortalamayı kullan'ı seçin veya ayrı çalıştırmalar için çalıştırmaları ayırt edin.

Bir ayrışma sabiti uyumunu çizmek için, ortalamayı kullan'ı seçin, etiketli molekül konsantrasyon değerini girin ve sabitleyin ve eğriyi sığdırın. Bağlanma ayrışma sabiti veya standart sapmasıyla birlikte KD değeri, ayrı bir bilgi açılır penceresinde görünür. Ortalama sığma verilerini bir metin dosyasına kaydedin ve Excel.Heck'e aktarın.

STAT 3G FP'yi eksprese eden 2, 9, 3 hücre, floresan etiketli stat üç kaynağı olarak kullanıldı. A DNA bağlanma testi için, yüksek yüklü oligonükleotidlerin bağlanması, STAT üç hareketliliğinde önemli değişikliklere neden oldu. Sıcaklık gradyanında.

Termoretik sinyal, oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Her veri noktası, üç ölçümün ortalamasını temsil eder. Görünür KD değerlerini belirlemek ve belirlemek için nano zamansal analiz yazılımı kullanıldı.

Görünür ayrışma sabitleri, gaz motifine bağlanmak için 37.9 artı veya eksi 1.0 mikromolar ve zengin oligonükleotid s artı 100'e bağlanmak için 23.3 artı veya eksi 0.6 mikromolar idi. Şaşırtıcı bir şekilde, s artı 100 dizi, gazdan biraz daha sıkı bağlanma gösterdi. Üç ölçüm tekrarında, A'nın G'ye ikame edilmesi, s artı 100 mutant olanın afinitesinde dramatik bir azalmaya neden oldu.

S artı 100 mutant iki saptanabilir bir bağlanma göstermezken, bu nedenle STAT üçünün dizi seçici bağlanmasını doğrular. s artı 100 Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, zar proteinlerinin ekstraksiyonu için en uygun koşulların farklı proteinler için farklılık göstereceğini ve genellikle optimizasyon gerektireceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteini hücreden saflaştırmadan bir proteinin zarife bağlanma afinitesini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Lizat.