CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerde yüksek kapasiteli DNA hasarı ölçümleri gerçekleştirmek için COMET çipinin nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu işlem, öncelikle memeli hücrelerin COMET çipine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, hücrelerin DNA hasarına neden olduğu bilinen kimyasallarla işleme tabi tutulmasıdır.

Ardından, hücreler geleneksel COMET deneyi protokolleri kullanılarak lizize edilir ve elektroforez uygulanır. Son adım, hasarlı DNA'nın göçünü görselleştirmek için hücresel DNA'nın floresan görüntülemesidir. Nihayetinde, DNA hasarının boyutunu nicelendirmek için görüntü analiz yazılımı kullanılır.

Komet deneyi oldukça uzun süredir kullanılmaktadır ve birçok farklı DNA hasarı türünü incelemek için çok yararlı bir yöntemdir. Ancak, düşük işlem kapasitesine sahip olması ve hassasiyetinin yetersiz olması bir sorun teşkil ediyordu. Bu nedenle, temel olarak Komet deneyinin çok yüksek işlem kapasiteli bir versiyonu olan ve örneğin ilaç taramaları ile epidemiyolojik çalışmalar için yüksek kapasiteli tarama yapmayı mümkün kılan COMET çipini geliştirdik.

Laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Jing GA prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Coma çipi, tek bir hücrenin çapı kadar küçük çaplı mikro sütunlara sahip mikro fabrikasyonla üretilmiş bir damga ile oluşturulan mikro kuyucuk dizilişli bir jeldir; yerleştirmeye başlamak için jel bağlama filmi tarafı aşağı gelecek şekilde tek kuyucuklu dikdörtgen bir plakaya yerleştirilir. Jeli 25 mL 1X PBS içinde iki kez yıkadıktan sonra, coma çipini bir cam plaka üzerine yerleştirin ve ardından jelin yönünü uygun şekilde etiketleyin.

Şimdi, tüm 96 kuyucuğun jel alanının içinde kaldığından emin olarak, ters çevrilmiş altı açık bir 96 kuyucuklu plakayı nazikçe jelin üzerine bastırın. Ardından, 96 kuyucuklu plakanın her iki yanını 1,5 inçlik ataçlarla cam plakaya sabitleyin. Son olarak, her birinden fazla PBS'yi aspire ederek uzaklaştırın.

Süspansiyon veya adherent hücreleri standart prosedürlere göre hasat edin ve hücreleri, mililitre başına 100.000 ila 1 milyon hücre nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde medya ile seyreltin. Gerektiğinde hücre filtresinden geçirerek tek hücre süspansiyonu elde edildiğinden emin olun. Hazırlanan comet chip 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin.

Buharlaşmayı önlemek için plakayı jel bağlama filmiyle kapatın ve plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. 30 dakika dolduğunda, her kuyucuktaki medyumu aspire edin, ardından mandalları ve altı açık 96 kuyucuklu plakayı çıkarın. Comet çipini cam plaka ile açılı tutun ve aros üzerindeki fazla hücreleri temizlemek için 1X PBS ile nazikçe durulayın. Şimdi, optimal hücre yüklemesini kontrol etmek için plakayı aydınlık alan mikroskobunda 4x objektif lens aracılığıyla inceleyin. Yeterli miktarda hücre yüklendikten sonra, comet çipini düz bir yüzeye yerleştirin ve üzerine 37 °C'ye önceden ısıtılmış %1 düşük erime noktalı agaroz katmanı ekleyin.

Kaplamanın oda sıcaklığında üç dakika boyunca katılaşmasını bekleyin ve ardından, hücreleri ilgili kimyasallarla dozlamak için tam sabitleme amacıyla beş dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. İlk olarak, comet çipindeki kuyucukları yeni bir dipsiz 96 kuyucuklu plakadaki kuyucuklarla dikkatlice hizalayın ve üzerine bastırın. 96 kuyucuklu plakayı, daha önce olduğu gibi binder klipslerle cam plakaya sabitleyin.

Ardından plakayı buz üzerine yerleştirin ve her bir kuyucuğa istenen dozda 100 µL ilgili kimyasalı ekleyin. İncelenen kimyasalın, dozlama sonrası istenen süre boyunca hücreler üzerinde kalmasına izin verin; her kuyucuğa kimyasal çözeltiyi aspire edin ve gerekirse bir kez XPBS ile durulayın. Jeli ayrı parçalara bölün. Daha sonra onarım kinetiğini incelemek için kuyucuklara kültür ortamı ekleyip inkübe edin ve alkali comet analizi için hücreleri lizlemek amacıyla belirli zaman noktalarında hücre lizisine geçin.

Alkalen lizis stok çözeltisine %1 Triton X 100 ekleyerek her bir çip için yaklaşık 25 mililitre çalışan alkalen lizis tamponu hazırlayın. Ardından dört santigrat derecede ön soğutma yapın. Alkolen lizis tamponunu, comet çipinden biraz daha büyük bir kaba boşaltın.

Ardından, alkali çipi soğutulmuş çalışan alkali lizis tamponuna daldırın, buzdolabına yerleştirin ve lizisin dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca ilerlemesine izin verin. Ertesi gün, comet çipini lizis tamponundan çıkarın ve hızla bir kez XPBS ile durulayın. Daha sonra çipi, jel film tarafı aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasına yerleştirin ve çift taraflı bant ile sabitleyin.

Hazneyi dört derece santigrat sıcaklıktaki soğuk odaya alın ve hazneyi, jeli sadece örtecek seviyeye kadar soğuk alkali elektroforez tamponu ile doldurun. Ardından, alkali açılmanın gerçekleşmesi için çipi dört derece santigrat sıcaklıkta 40 dakika boyunca bekletin. Son olarak, jeli santimetre başına bir volt ve 300 miliamperde 30 dakika boyunca çalıştırın.

Soğuk odada, istenen çalışma akımını elde etmek için haznedeki elektroforez tamponu hacmini ayarlayın. Nötr kuyruklu yıldız analizi (comet assay) için, nötr liz stok solüsyonuna %1 Triton X 100 ve %1 DMSO ekleyerek çalışan nötr liz tamponunu hazırlayın. Yine her bir çip için yaklaşık 25 mililitre çalışan liz tamponu hazırlayın.

Çalışma nötr lizis tamponunu ön ısıtma için 43 °C'ye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Nötr lizis tamponu ısındıktan sonra, virgül çipini nötr lizis tamponuna daldırın ve gece boyunca 40 °C'lik bir inkübatörde bekletin. Ertesi gün, nötr lizis tamponunu uzaklaştırın ve ardından çipi 4 °C'de 15 dakika boyunca iki kez nötr elektroforez tamponu ile yıkayın. Her seferinde çipi elektroforez odasına sabitleyin ve soğuk odaya taşıyın.

Daha önce olduğu gibi, elektroforez haznesini jel yüzeyini hafifçe örtecek seviyeye kadar soğuk nötr elektroforez tamponu ile doldurun ve jeli soğuk odada 60 dakika bekletin; ardından jeli soğuk odada, santimetre başına 0,6 volt ve altı miliamperde 60 dakika boyunca çalıştırın. Gerektiğinde, istenen çalışma akımını elde etmek için haznedeki elektroforez tamponu hacmini yeniden ayarlayın. Com çipini soğuk odadan çıkardıktan sonra, jelleri nötralizasyon tamponu ile iki kez, her biri 4 °C'de 15 dakika boyunca yıkayarak nötralize edin.

Cyberg gold veya iridyum bromür gibi floresan bir DNA boyası ile çip içinde bekletin. Üretici talimatlarına göre boyama yapıldıktan sonra floresan mikroskopi ile görüntülenen; işlem görmemiş TK six lenfoblastlarından elde edilen temsili mikrokuyu kometleri bu diyagramın üst panelinde gösterilmiştir. 50 µM hidrojen peroksite maruz kalan TK six hücrelerinden elde edilenler orta panelde, 100 µM hidrojen peroksite maruz kalanlar ise alt panelde gösterilmiştir.

Tüm pozlama işlemleri 4 °C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirilmiştir. Bu çizgi grafik, TK6 hücrelerinin hidrojen peroksit doz yanıtını göstermektedir. Her bir veri noktası, her deneyde en az 50 bireysel kuyruklu yıldızın (comet) medyan kuyruk DNA yüzdesinin elde edildiği üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir.

Bu grafik, hidrojen peroksite maruz bırakılan TK6 hücreleri için kometa deneyi analizinin örnekten örneğe varyasyonunu göstermektedir; burada her bir kuyucuğun yüzde kuyruk DNA verileri sunulmuştur. Her kutu, her kuyucuktan alınan en az 50 bireysel kometanın medyanını temsil etmektedir. 12 kuyucuğun ortalaması 77,53%, standart sapma 3,99% ve varyasyon katsayısı 5,2%'dir. Bu grafik, deneyden deneye varyasyonu göstermektedir.

Aynı hidrojen peroksit uygulaması altı kez tekrarlanmış olup, her bir tekrarın verileri gri çubuklar şeklinde gösterilmiştir. Her kutu, her tekrardan alınan en az 100 bireysel kuyruk DNA'sının medyan yüzdesini temsil etmektedir. Altı tekrarın ortalaması %49,57'dir ve burada siyah çubuk olarak gösterilmiştir.

Altı tekrarlamanın standart sapması %4,99 ve ortalamanın hata çubuğu, geleneksel yaygın analizlerde olduğu gibi şekilde hata çubuğu olarak gösterilen %2,04'tür. Araştırmacılar, hücrelerde oluşan DNA hasarının türü hakkında ek soruları yanıtlamak için saflaştırılmış lezyona özgü enzimler eklemek gibi modifikasyonlar yapma veya diğer yöntemleri kullanma konusunda serbesttir. Comet chip tekniği, DNA hasarı ve onarımı hakkında bilgi edinmek amacıyla memeli hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara öncülük etmiştir.

Yüksek kapasiteli olduğu için, daha önce örnek sayısının fazlalığı nedeniyle mümkün olmayan klinik ve epidemiyolojik çalışmaların gerçekleştirilmesini sağlar.