CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerinde yüksek verimli DNA hasar ölçümleri yapmak için COMET çipinin nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu, önce memeli hücrelerinin COMET çipine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri DNA hasarına neden olduğu bilinen kimyasallarla tedavi etmektir.

Daha sonra, hücreler parçalanır ve geleneksel COMET tahlil protokolleri kullanılarak Electro East'e gönderilir. Son adım, hasarlı DNA'nın göçünü görselleştirmek için hücresel DNA'nın floresan görüntülemesidir. Sonuç olarak, DNA hasarının derecesini ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanılır.

Kom testi gerçekten uzun bir süredir var ve birçok farklı DNA hasarına bakmak için çok faydalı bir test. Ancak sorun, verimin gerçekten düşük olması ve hassasiyetten yoksun olmasıdır. Bu yüzden COMET çipini yarattık, bu çip temel olarak COMET testinin çok yüksek verimli bir versiyonudur, bu da örneğin ilaç taraması ve epidemiyolojik çalışmalar için yüksek verimli tarama yapmayı mümkün kılar.

Laboratuvarımdaki Jing GA yüksek lisans öğrencisi prosedürü gösterecek. Koma çipi, tek bir hücreninki kadar küçük çaplara sahip mikro direklere sahip mikro fabrikasyon bir damgadan üretilen bir dizi mikro kuyucuklu bir jel kuyucuklu bir jeldir ve tek kuyucuklu dikdörtgen bir plakaya yerleştirilmeye başlar, jel bağ filmi tarafı aşağı bakacak şekilde. Jeli bir XPBS'de 25 mililitrede iki kez yıkadıktan sonra, virgül çipini bir cam tabağa yerleştirin, ardından jelin yönünü buna göre etiketleyin.

Şimdi, ters çevrilmiş dipsiz 96 oyuklu bir plakayı jele hafifçe bastırın ve 96 oyuğun tümünün jel alanı içinde olduğundan emin olun. Ardından 96 oyuklu plakanın her iki tarafını 1,5 inç bağlayıcı klipslerle cam plakaya klipsleyin. Son olarak, her birinden fazla PBS'yi çıkarın.

Standart prosedürlere göre süspansiyonu veya yapışan hücreleri iyi bir şekilde hasat edin ve hücreleri ortamla mililitre başına 100.000 ila 1 milyon hücre nihai konsantrasyonuna seyreltin. Gerekirse bir hücre filtresinden geçirilerek tek hücreli bir süspansiyonun elde edildiğinden emin olun. Her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin, bittiğinde kuyruklu yıldız çipi 96 kuyulu plaka.

Buharlaşmayı önlemek için plakayı jel bağ filmi ile örtün ve ardından plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. 30 dakika geçtiğinde, ortamı her birinden iyice aspire edin, ardından bağlayıcı klipsleri ve dipsiz 96 Kuyulu plakayı çıkarın Kuyruklu yıldız çipini cam plaka ile belirli bir açıyla tutun ve arosun üzerindeki fazla hücreleri çıkarmak için bir XPBS ile hafifçe durulayın. Şimdi, optimum hücre yüklemesini kontrol etmek için plakayı parlak bir alan mikroskobunda dört x objektif mercekten görüntüleyin Yeterli hücreler yüklendikten sonra, 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış %1 düşük erime noktalı agros içeren bir kaplama olan düz bir yüzeye bir çip yerleştirin.

Kaplamanın oda sıcaklığında üç dakika katılaşmasına izin verin ve ardından hücreleri ilgilenilen kimyasallarla dozlamak için tam dasyon için beş dakika boyunca dört santigrat derece yerleştirin. İlk olarak, kuyruklu yıldız çipinin kuyularını yeni bir dipsiz 96 kuyulu plakanın kuyularıyla dikkatlice hizalayın ve aşağı doğru bastırın. 96 kuyulu plakayı daha önce olduğu gibi bağlayıcı klipslerle cam plakaya sabitleyin.

Daha sonra plakayı buzun üzerine yerleştirin ve istenen dozda 100 mikrolitre ilgilenilen kimyasalı ekleyin: Her bir oyuğa, incelenen kimyasalın dozlamadan sonra istenen süre boyunca hücreler üzerinde kalmasına izin verin, kimyasal çözeltiyi her bir oyuktan aspire edin ve gerekirse bir XPBS ile durulayın. Jeli ayrı parçalar halinde kesin. Daha sonra onarım kinetiğini incelemek için, kuyucuklara kültür ortamı ekleyin, inkübe edin ve alkali kuyruklu yıldız tahlili için LY hücrelerine belirli zaman noktalarında hücre lizizine devam edin.

Alkali lizis stok çözeltisine% 1 Triton X 100 ekleyerek her çip için yaklaşık 25 mililitre çalışma alkalin lizis tamponu hazırlayın. Ardından dört santigrat derecede önceden soğutun. Alkalin lizis tamponunu kuyruklu yıldız çipinden biraz daha büyük bir kaba boşaltın.

Daha sonra alkali çipi soğutulmuş çalışma alkali lizis tamponuna daldırın, buzdolabına yerleştirin ve lizisin gece boyunca dört santigrat derecede ilerlemesine izin verin. Ertesi gün, kuyruklu yıldız çipini lizis tamponundan çıkarın ve bir XPBS ile hızlı bir şekilde rens yapın. Ardından çipi, jel film tarafı aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasına yerleştirin ve çift taraflı bantla sabitleyin.

Odayı dört santigrat derece soğuk odaya götürün ve odayı soğuk alkali elektroforez tamponu ile sadece jeli kaplayacak bir seviyeye kadar doldurun. Ardından, alkalin gevşemesine izin vermek için çipi 40 dakika boyunca dört santigrat derecede bırakın. Son olarak, jeli 30 dakika boyunca santimetre başına bir volt ve 300 miliamperde çalıştırın.

Soğuk odada, istenen çalışma akımını elde etmek için odadaki elektroforez tamponunun hacmini ayarlayın. Nötr kuyruklu yıldız tahlili için, nötr lizis stok çözeltisine% 1 Triton X% 110 DMSO ekleyerek çalışan nötr lizis tamponu yapın. Yine, her çip için yaklaşık 25 mililitre çalışma lizis tamponu hazırlamak.

Çalışan nötr lizis tamponunu, ön ısıtma için 43 santigrat dereceye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Nötr lizis tamponu ısıtıldıktan sonra, virgül çipini nötr lizis tamponuna batırın ve gece boyunca 40 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, nötr lizis tamponunu çıkarın ve ardından nötr elektroforez tamponu ile dört santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez res Her seferinde çipi elektroforez odasına sabitleyin ve soğuk odaya aktarın.

Daha önce olduğu gibi, elektroforez odasını soğuk nötr elektroforez tamponu ile jeli sadece kaplayacak bir seviyeye kadar doldurun ve jelin soğuk bir odada 60 dakika oturmasına izin verin, jeli santimetre başına 0.6 volt ve altı miliamperde çalıştırın soğuk odada 60 dakika. Yine, gerekirse istenen çalışma akımını elde etmek için haznedeki elektroforez tamponunun hacmini ayarlayın. Com çipini soğuk odadan çıkardıktan sonra, jelleri her biri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkayarak ve nötralizasyon tamponuyla nötralize edin.

Cyberg gold veya iridium bromür gibi bir floresan DNA lekesi ile çipte kalın. Üreticinin talimatlarına ve görüntüsüne göre, floresan mikroskobu kullanılarak, işlenmemiş TK altı lenfoblasttan gelen temsili Microwell kuyruklu yıldızları bu diyagramın üst panelinde gösterilmektedir. TK altı hücresinden olanlar orta panelde 50 mikromolar hidrojen peroksite ve alt panelde 100 mikromolar hidrojen peroksite maruz kaldılar.

Tüm maruziyetler dört santigrat derecede 20 dakika sürdü. Bu çizgi grafik, TK altı hücresinin hidrojen peroksit doz tepkisini göstermektedir. Her veri noktası, her deneyde en az 50 ayrı kuyruklu yıldızın medyan yüzde kuyruk DNA'sının elde edildiği üç bağımsız deneyin ortalamasıdır.

Bu grafik, TK altı hücreye maruz kalan hidrojen peroksit için virgül çipi testinin numuneden numuneye varyasyonunu gösterir, her bir kuyucuğun yüzde kuyruk DNA verileri burada gösterilmektedir. Her kutu, her kuyudan en az 50 ayrı kuyruklu yıldız olan medyanı temsil eder. 12 kuyunun ortalaması 77 nokta %53, standart sapma %3.99 ve varyasyon katsayısı %5.2'dir. Bu grafik deneyden deneye varyasyonu göstermektedir.

Aynı hidrojen peroksit maruziyeti altı kez tekrarlandı ve her tekrarın verileri gri bir çubuk olarak gösterildi. Her kutu, her tekrardan en az 100 ayrı kuyruklu yıldızın medyan yüzde kuyruk DNA'sını temsil eder. Altı tekrarın ortalaması %49,57'dir.burada arka çubuk olarak gösterilir.

Altı tekrarın standart sapması %4,99'dur ve ortalamanın hata çubuğu %2,04'tür.şekildeki hava çubuğu olarak temsil edilir Geleneksel yaygın tahlil gibi. Araştırmacılar bu prosedürde değişiklikler yapmakta veya hücrelerde üretilen DNA hasarının türü hakkında ek soruları yanıtlamak için saflaştırılmış lezyona özgü enzimler dahil etmek gibi diğer karışıklıkları kullanmakta özgürdürler. Kuyruklu yıldız çipi tekniği, DNA hasarı ve onarımı hakkında bilgi edinmek için memeli hücreleri üzerinde yapılan çalışmaların yolunu açmıştır.

Ve yüksek verim olduğu için, numune sayısı nedeniyle daha önce mümkün olmayan klinik ve epidemiyolojik çalışmaların yapılmasını mümkün kılar.