Name: CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin, COMET chip platformu ile memeli hücrelerde DNA hasarını yüksek verimli ölçme yöntemini. Bu teknik, ilaç taraması ve epidemiyolojik çalışmalar için DNA onarım kinetiği analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, öncelikle 1-R21-R44-ES019498 ve ES021116 kısmi desteği ile 5-UO1-ES016045 tarafından destek oldu. DMW Çevresel Toksikoloji T32-ES007020 yılında NIEHS Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir. Ekipman Çevre Sağlığı Bilimleri P30-ES002109 için Merkezi tarafından sağlandı.

Chip 1. Hazırlık <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağı bir-iyi dikdörtgen plaka, jel film tarafı içine paketi ve yerden çip jel çıkarın. </li><li> Iki kez tekrar, 15 dakika boyunca PBS 1x 25 ml jel yıkayın. </li><li> Cam plaka ve buna göre jel etiket yönelimine ayarlayın jel. </li><li> Yavaşça jel üzerine ters çevrilmiş dipsiz 96 oyuklu plaka basın; Dibi olmayan plaka kuyuları her jelin alanı içinde olduğundan emin olun. </li><li> Cam ile kenetlenmesini sağlamak için, plakanın her yanında 1,5 &#39;bağlayıcı klipsler kullanılır. </li><li> Aşırı PBS kapalı aspire iyi her tampon. </li></ol> 2. Yükleme Hücreler <ol style="margin-left: 40px;"><li> Hücre süspansiyonlarının hazırlanması: <ol><li> Süspansiyon hücre hatları için, 10 ml / 5 -10 6 hücre bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere ortam içinde hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> , Yapışan hücre hatları için normal Ayırma / tripsinizasyon protokolleri takip ve d10 5 -10 6 hücre / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar ortam içinde müstakil hücreleri ilute. Hücrelerin toplam varsa, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre filtresi hücre süspansiyonu geçmektedir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin. </li><li> Jel film ile kapak plakası ortam buharlaşmasını önlemek için. </li><li> Hücreler 37 ° C inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca yük sağlar. </li><li> Her kuyudan kuvöz ve aspire medya çipini çıkarın. </li><li> Bağlayıcı klipleri ve dipsiz 96-plaka çıkarın; bir açıda cam plaka ile çip tutarken agaroz üzerinde aşırı hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Bir 4X objektif lens ile parlak bir alan mikroskobu kullanılarak hücre yükleme kontrol edin. Yetersiz yükleme görülürse, adım 2.1 tekrarlayın. </li><li> Daha da yüzey (bench) yüklenen çipi yerleştirin. Bir% 1 düşük erime noktalı (LMP) agaroza bindirme çip 37 ° C&#39;de önceden ısıtıldı. Yaklaşık kullanın 2̵1 &#39;dir; LMP agaroz 3 ml her bir yonga için gereklidir. </li><li> Üst kaplama 3 dakika boyunca oda sıcaklığında ve daha sonra katılaşan önce tam katılaşma işlemi için 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir buzdolabı için hareket etmesine izin verir. </li></ol> 3. Dozaj ve Onarım NOT: bazal DNA hasarı seviyesini incelemek Adım 4 atlamak için. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dikkatli bir şekilde yeni bir 96 oyuklu dipsiz plakanın gözleri ile (önceki kenetlenmeden oluşturulan), çipin kuyu hizalayın. Re-pres bağlayıcı klipleri ile üst ve güvenli bağlama üzerinde dipsiz 96-plaka. </li><li> 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, istenen doz kimyasal 100 ul ilave et; Buz üzerinde ya da bir zaman istenen miktarda boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında olarak dozajlanması ve / tedavisidir. </li><li> Her iyi gelen, aspirat kimyasallar dozajlama ve 1x PBS kullanılarak kalıntı kimyasal uzaklıkta yıkayın sonra. Direkt hasar burada okudu ise, 4. Adıma geçin. </li><li> Olarak onarmak için çip hücreleri, onarım kinetiğini incelemek izin37 ° C&#39;de ortam. Lyse belirli zaman noktalarında (Adım 4 geçin). Not: tamir bağlı tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka ile çip-üstü gerçekleştirilebilir ya da çip Dibi olmayan 96 oyuklu bir plakanın ayrılmasından sonra, ayrı parçalar halinde kesilebilir. </li></ol> 4. Liziz <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> % 1 Triton X-100 lizis stok çözelti (2.5 M NaCl, 100 mM Na-2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10), alkalin ekleyerek alkalin lisiz tamponu çalışma yapmak. Her çip için lizis tamponu çalışma yaklaşık 25 ml hazırlayın. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta alkalin lisiz tamponu çalışan ön soğutma. </li><li> Soğuk çalışma alkalin lisiz tampon maddesi içinde çip daldırın ve 4 ° C&#39;de lisis buzdolabında O / N yapmasına izin verin. </li></ol></li><li> Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> Nötr lizis stok çözeltisi (2.5 M NaCI, 100 mM Na-EDTA, 2 den 10 a kadar% 1 Triton X-100 ve% 10 DMSO ilave edilerek nötr bir liziz tamponu çalışma yapmakmM Tris,% 1 N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Her çip için lizis tamponu çalışan yaklaşık 25 ml hazırlayın. </li><li> 43 ° C&#39;de nötral lizis tamponu çalışma öncesi sıcak. </li><li> Sıcak çalışma nötr lizis tamponunda çip batığın ve parçalama 43 ° C inkübatör O / N gerçekleştirmek için izin verir. </li></ol></li></ol> 5. Elektroforez <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> 1x PBS ile çip durulayın hızla lizis tamponu çıkarın ve. </li><li> Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip. </li><li> 4 ° C soğuk oda odasına getirin. </li><li> Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar soğuk bir alkali elektroforez tamponu (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) ile oda doldurun. </li><li> 40 dakika için alkalin gevşemek için izin ver. </li><li> 1 V / cm ve soğuk odada 30 dakika boyunca 300 mA&#39;da elektroforez çalıştırın. Cha elektroforez tampon seviyesini ayarlayınİstediğiniz çalışan akımı elde etmek mber. </li></ol></li><li> Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> Liziz tamponunu çıkarın ve 2 x 15 dak, 4 ° C de nötr elektroforez tamponu (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) ile çip yıkayın. </li><li> Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip. </li><li> 4 ° C soğuk oda odasına getirin. </li><li> Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar, soğuk nötral elektroforez tamponu ile hazne (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) doldurun. </li><li> Jel 60 dakika boyunca soğuk odada oturmak için izin. </li><li> 0,6 V / cm elektroforezi çalıştırın ve soğuk bir odada 60 dakika boyunca 6 mA. İstenilen çalışma akımı elde etmek odasında elektroforez tampon seviyesini ayarlayın. </li></ol></li></ol> 6. Floresan Görüntüleme <ol style="margin-left: 40px;"><li> Col Elektroforez odasından çipini çıkarınd oda. </li><li> 4 ° C&#39;de buzdolabında 2 x 15 dakika boyunca nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris, pH 7.5) nötralize jeller. </li><li> Seçtiğiniz floresan DNA boyası ile çip Leke (yani, SYBR Altın, Etidyum Bromür) fabrika altında önerilen prosedürleri. Floresan mikroskopi kullanılarak. </li></ol> 7. Veri Analizi Böyle Komet 5.5 gibi standart kuyruklu yıldız tahlil yazılım tarafından kuyruklu Görüntüler analiz edin.

<ol><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles%2C+Applications%2C+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li>
<li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li>
<li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+comet+assay%3A+use+and+status+in+genotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li>
<li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toxicity+assessment%3A+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III%3A+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+sciences+%3A+an+official+journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Møller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+%26+clinical+pharmacology+%26+toxicology%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).</li>
<li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA%3A+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li>
<li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG%E2%80%A0+inter-laboratory+validation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li>
<li>Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li>
<li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+research+in+toxicology%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li>
<li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+%28comet+assay%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).</li>
<li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li>
<li>Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li>
<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li>
<li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li>
<li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li>
</ol>

CometChip, Wood, Weingeist, Bhatia ve Engelward'ı içeren bir patent başvurusuna dayanarak Trevigen, Inc.'e lisanslanmıştır.

Çevre ve insan hücreler içinde her yerde Genotoksinlerin kaçınılmaz stres ve hücresel DNA hasar gösterirler. Aslında, kararlı durumda 18 insan hücrelerinde bulunan DNA lezyonları 1,000s olduğu tahmin edilmiştir. Insanlarda hasar yatkınlık ve onarım kinetik anlamadan sadece temel araştırma anlayış getiriyor, ama aynı zamanda ilaç geliştirme yararlanır. Ironik kanser teşvik etmek için, DNA hasarının yeteneğine rağmen, DNA&#39;ya hasar veren ajanlar, kanser tedavisi DNA hasarı hakkında bilgi alma ve kişiye özel ilaç ile ilgili tamir etmek için çok yüksek seviyelerde kullanılmaktadır. CometChip uzun var DNA hasarı tahlili devrim mikroimalat uygulamaları kullanan yeni araştırma cihazdır. Geleneksel kuyruklu testin aynı ilkeleri üzerine inşa çip önemli oranda daha yüksek ve daha iyi tekrarlanabilirlik sağlar. Biz burada bu çip kullanan yöntemleri açıklanmaktadır. Kendi programını ve sağlamlığı açıklığa kavuşturmak için, sağa sola sonuçlarını göstermekm çip birkaç farklı DNA hasar maddeleri ile hasarını değerlendirmek için kullanılmıştır ve bu DNA onarımını değerlendirmek için burada kullanıldığı pek çok deney. Birlikte, burada sunulan sonuçlar çip kullanan için yararlı bilgiler sağlar ve DNA hasarı ve onarımı üzerinde yapılan araştırmaya geniş uygulanabilirliğini göstermek. Bu protokolde en önemli adımlardan biri etkili bir hücre yükleme gerçekleştirmek. Birçok hücre hatları süspansiyonu ve yapışık hücreleri de kapsayan, bu sistem üzerinde test edilmiştir. Verimliliği yüklüyor, hücre tipi, hücre boyutu, yükleme konsantrasyon ve zaman gibi pek çok değişkene bağlıdır. Böyle lenfoblastoid hücreler gibi süspansiyon hücre hatları ile çalışmak için en kolay olanıdır. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 96, oyuk başına 10 Nisan - 10 Haziran hücrelerden değişebilir ve yükleme süresi 15-30 dakika içerisinde tamamlanır. Daha yüksek hücre yoğunluğu yüklenmesini kolaylaştırır ve mikro oyuk içine yerleşmek için hücreler için gerekli süreyi kısaltır. Yapışık hücreler için yükleme parametreleri süspansiyon hücreleri farklı olabilir. Bu Çin hamster yumurtalık (CHO) hücreleri, hem hücre çizgileri süspansiyon hücreleri olarak benzer yükleme verimliliğini (alttaki tripsinizasyon) olduğu ve bu nedenle benzer yükleme koşulları kullanarak saptandı. Bu kolayca süspansiyon hücre agregatları oluşturmaz tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri, ek bir işlem gerektirebilir. Süspansiyon, ortam, tripsin, tek bir hücre, hücre süspansiyonları bir filtreden geçen ekleme ve yükleme esnasında hücre kümelerinin oluşumunu bastırabilir. Son olarak, yükleme süresi bakımından, süre 20 dakika ile 1 saat arasında değişebilir mikroçukurlarda yapışık hücre çizgileri yakalamak için gereklidir. Sonuç olarak, kullanıcıların daha ileri tetkikler geçmeden önce en uygun yükleme koşulları belirlemek için pilot deneyler gerçekleştirmeniz tavsiye edilir. Yükleme etkinliği DAPI&#39;nin veya diğer DNA ile kapsüllü hücreler boyanarak daha doğru ortaya parlak bir alan mikroskobu altında görüntülendi veya olabilirfloresan mikroskop altında değerlendirme öncesinde lekeleri. Bu yöntemin ve çipin bir büyük avantajı esnekliktir. İlk olarak, aşırı hücreler yıkanır, çünkü araştırmacılar, belli çalışma hücre konsantrasyonu ile sınırlı değildir ve mikrodizi homojen kuyruklu yıldıza yoğunluğu sağlar. İkinci olarak, mikro-farklı boyutlarda hücre türlerine uyum sağlamak için, farklı boyutlarda yapılabilir. Birden fazla hücre tek MicroWell yakalanır koşullar altında, çok hücreli kuyruklu kendini kalibre ve verimi, tutarlı sonuçlar, tek bir hücre kuyruklu 6,7 kıyasla,. Mikroarreylerinin hücreleri desenlendirme bir diğer yararı tüm kuyrukluyıldızların nedeniyle odaklanmamış kuyruklu gürültüyü azaltmak ve otomatik görüntüleme ve analiz kolaylaştıran, sabit pozisyonları ile aynı odak düzlemi sonra olmasıdır. CometChip sağladığı verim ve hassasiyet açısından önemli gelişmeler büyük ölçekli çalışmalar için, tahlilin uygulanmasını sağlar. Birlikte ele alındığında, çip sağlamakaraştırmacılar, toksikoloji, klinisyenler ve epidemiyologların DNA hasarı değerlendirmesi için sa değerli bir araçtır. Kuyrukluyıldız tahlil DNA hasarının geniş bir saptamada mükemmel hassasiyet için bilinen iken, bu deney aynı zamanda düşük özgüllüğü muzdarip. Bu protokol kullanılarak büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini ve veri akışını arttırır ancak spesifitede bir ilerleme anlamına gelmez. Bununla birlikte, diğer yöntemlerle, tahlil daha yüksek bir kesinlik elde etkili olduğu bildirilmiştir multiplekslemesi. Bir örnek saflaştırılmış lezyon-spesifik enzimlerin dahil. Bu enzimler tespit iplikli kırılmalara ve abasic sitelerine 1,19-21 içine aksi saptanamayan baz lezyonları dönüştürebilirsiniz. Yaygın kullanılan bir örnek oksidatif DNA değişiklikleri 19,22 ortaya onarım endonükleaz formamidopyrimidine-DNA glikosilaz (APG), olduğunu. Enzim sindirimi aşaması, hücre lizizi sonrasında uygulanır için, sistem aynı şekilde tedavi edilebilir aprotokole değişiklikler olmadan sa geleneksel agaroz slayt. Ayrıntılı bir protokol burada tarif edilmemiş olsa da, bu yaklaşım geçmişte birçok geleneksel kuyrukluyıldız tahlil kullanıcılar tarafından adapte edilmiş ve protokolleri kolaylıkla bulunabilir. Bir önceki yayın, floresan ışık hasarını 22 tanımlamak için bu yöntem kullanılır. Bu yöntemin en büyük avantajı, daha önce neredeyse imkansız olan çalışmalara kapılarını açıyor sağladığı verim vardır. Aynı platform üzerinde 96 örnekleri işleyen yeteneği değil, sadece emek ve zamanı azaltır, aynı zamanda deneysel gürültüyü azaltır ve büyük ölçüde tekrarlanmasını arttırır. Inter örnek varyasyon bu çip 6,7 ile gözlenen varyasyon daha 2 kat yüksek olabilir geleneksel slayt-to-slayt varyasyon, önemli ölçüde daha düşüktür. Azaltılmış gürültü de örnekler arasında daha ince farklar ortaya çıkarılmasını sağlayacak, gelişmiş duyarlılık yol açar. Cihaz bir sta istihdam çünkündard 96-iyi biçimi, genel araştırma ekipmanları ile uyumlu ve teknolojileri HTS. Ortalama bir araştırmacı ~ birkaç gün boyunca 30 cam slaytlar işleyebilir olduğunu varsayarak, 100 numune değerlendirmesini gerektiren bir çalışma düşünün. Her bir örnek üç kez gerçekleştirilmesi gereken olduğu göz önüne alındığında, bu da kaçınılmaz olarak örnek varyasyonu için numune muzdarip olan böyle bir çalışma tamamlamak için yaklaşık bir ay sürer. Bunun aksine, bu çip ile işleme koşulları 100, her biri üçlü halde, sadece bir kaç tabak gerektirir ve üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Geçirilendeki Bu önemli gelişme, daha önce ulaşılamaz olan çalışmalara kapıyı açar. Burada sunulan protokol, standart kuyrukluyıldız tahlilini yapmak için temel prosedürleri ve CometChip platformu kullanmak için gerekli modifiye adımları anlatılmaktadır. Doğal DNA hasar seviyelerini ve sonraki onarım yanıtı hem ölçmek için yeteneği ile, tahlil son derece alakalıbiyolojik ve klinik uygulama çeşitliliği. Genom üzerinde belirli kimyasal maruziyetin etkisi hakkında bilgiler, hastalıkların önlenmesi ve tedaviyi kolaylaştırır. Ayrıca, DNA hasarı duyarlılık ve bireyler 23,24 arasında onarım kapasitesinde varyasyonları belirlemede önemli ilgi de var. Bu teknik, büyük ölçekli çalışmalar için gerekli verimi sağlar. Arası bireysel varyasyonlar hakkında bilgi duyarlı insanları tanımlamak için ve bireyselleştirilmiş tedaviler veya önlemler stratejileri tasarlamak için önemlidir. Burada sunulan teknoloji yakın gelecekte bir standart metodoloji olma potansiyeline sahip, yüksek verim, objektif ve kantitatif DNA hasarı analiz platformu sağlar, birlikte ele alındığında.

Tek hücre jel elektroforezi (kuyruklu yıldız tahlil aka) (SCGE) deneyi baz lezyonlar, abasic siteler, tek iplikli kırılmalara, çift iplikli kırılmalara, çapraz bağlardan ve hassas alkali içeren DNA lezyonlarının, geniş bir yelpazenin ölçümü için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir siteleri. Deneyin temel ilkesi, Hasarlı DNA hasar DNA&#39;dan daha nedeniyle parçalanma ve süpersarmal yapısı kaybına daha kolaylıkla göç olmasıdır. Göç ölçüde DNA hasarının miktarı ile orantılıdır, ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Görüntü yakalama ve bireysel kuyrukluyıldız şeklindeki DNA yoğunluğu profili analizi, daha sonra bir hücreye 1-4 içindeki DNA hasarının seviyesini ortaya çıkarmak için kuyruk böyle kuyruk uzunluğu, kuyruk an, ve% DNA gibi parametre ölçümleri sağlar. A) alkalin kuyruklu yıldız tahlil ve b) nötr kuyruklu yıldız tahlil: Şu anda kuyruklu testin yaygın olarak kullanılan iki sürümü vardır. Alkalin kuyruklu yıldız tahlil en yaygın olduğuBöylece elektroforezden önce DNA gevşemek için yüksek pH tamponu kullanır ve kullanılan versiyonu, iplikli kırılmalara ve alkali-duyarlı sitelerin her türlü algılar. Bu çift helisleri korumak ve sadece çift tutam kırılmaları 2,5 tespit etmek için nötr bir tampon kullandığından nötr kuyruklu deney, diğer taraftan, daha az uygulanmaktadır. DSBs neden fiziksel ve kimyasal maddeler için, SSB&#39;ler uyum içinde oluşturulur, ve çok daha yüksek düzeyde oluşturulur (örneğin, γIR kaynaklı SSB&#39;ler DSBs daha fazla ortak bir büyüklük sırası vardır). Çoğu DNA zarar pozlarda, DSBs çok daha az sıklıkla DNA hasarının diğer sınıflara göre daha vardır ve dolayısıyla tespit etmek zordur. Biz önceki yayınlarda hem sürümlerinin algılama penceresini göstermiştir. 6,7 Kuyrukluyıldız tahlil rutin DNA hasarı ve onarımı ve genotoksisite testinin 1,2,8-15 temel araştırma için kullanılıyor olmasına rağmen, tahlil, numune-sı kötü tekrarlanabilirlik sahip bildirilmiştirörnek, kişiden kişiye ve lab-to-laboratuarı değişkenliği. Görüntü elde etme ve veri analizi zahmetli edilir olduğundan, deney düşük akış kısmen,. Birlikte, bu sınırlamalar geniş ölçekli çalışmalarda nispeten düşük kabul katkıda bulunur. Mühendislik teknolojileri ve ilkeleri entegrasyonu sayesinde, CometChip geleneksel kuyruklu testte 6,7 ile ilişkili verim sorunlarına ve tutarsızlıklar bir çözüm getiriyor. Kısaca, çip oluşturmak için bir kalıp tek bir hücrenin bu kadar küçük çaplı microposts oluşturmak için fotolitografi kullanımıyla mikrofabrike edilir. Kalıp daha sonra jel katılaşmasından sonra mikro oyuk bir dizi ile sonuçlanan, erimiş agaroz üzerine eklemek için kullanılır. Cips farklı hücre tipleri ile uyumlu değişken boyutlu kuyuları ile araştırmacılara sunmak için geliştirilmektedir. Çip yüklemek için, ortam içinde hücreler, yerçekimi ile kuyu içine yerleşmek için izin verilir; fazla hücreler yıkanarak uzaklaştırılmıştır. Trapped hücreler daha sonra bizi kapsüllüdüşük erime noktasına sahip ince bir tabaka ing ve dipsiz 96 oyuklu bir plaka daha sonra, alt yüzeyi üzerinde mikro oyuk yüzlerce 96 macrowells, her birini yaratmak için jel yüzeyine kenetlenir. Bu protokol jel hazırlama, hücre yükleme, dozajlama ve onarım, hücre parçalanması, elektroforez ve floresan görüntüleme içeren bu yonga ile deneyler için genel prosedürler açıklanmaktadır. Biz alkali ve sırasıyla tahlil nötr sürümlerini kullanan, bilinen DNA zarar veren ajanlar maruz lenfoblast hücreleri ile doz tepki deneyleri iki örnek göstermektedir. İki onarım deneyleri de onarım tepki maruziyet sonrası sistemi kullanılarak değerlendirilebilir nasıl açıklamak için gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>UltraPure LMP Agaroz (düşük erime noktası)</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td>Birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Kristal NaCl</td><td>Macron Kimyasalları</td><td>7581-06</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Kristal Na2EDTA</td><td>Macron Kimyasalları</td><td>4931-04</td><td>Birden fazla tedarikçi, Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Kristal Tris (baz)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Birden fazla tedarikçi, Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Kristal Tris (asit)</td> <td>JT.Baker</td><td>4106</td><td>Birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Kristal N -lauroylsarcosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td>Çoklu tedarikçiler, Solunduğunda oldukça toksik, Tahriş edici</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Çoklu tedarikçiler, Yutulması halinde zararlıdır., Tahriş edici</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Çoklu tedarikçiler, Yanıcı Sıvı, Hedef Organ Etkisi</td></tr><tr><td>Kristalin NaOH</td><td>Macron Kimyasalları</td><td>7708-06</td><td>Çoklu tedarikçiler, Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR</td><td>BDH3871</td><td>Çoklu tedarikçiler, Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Kristalin borik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>Çoklu tedarikçiler, Hedef Organ Etkisi, Teratojen, Üreme tehlikesi</td></tr><tr><td>CometChip</td><td>Trevigen</td><td></td><td>Dağıtım için geliştirilme aşamasında, gerekli malzemeleri elde etmek için doğrudan Trevigen ile iletişime geçin</td></tr><tr><td>1 kuyulu çanak</td><td>Thomas Scientific</td><td>73521-420</td><td></td></tr><tr><td>Dipsiz 96 kuyulu plaka</td><td>VWR</td><td>655000-06</td><td></td></tr><tr><td>1.5 'bağlayıcı klipsler</td><td>Zımba</td><td></td><td>Birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Cam plaka</td><td>Etiket Donanım</td><td></td><td>96 oyuklu plakanın boyutuna göre özelleştirilmiş</td></tr><tr><td>Baykuş Yatay Elektroforez Sistemi</td><td>VWR</td><td>27372-131</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Birden çok tedarikçi</td></tr></tbody></table>

cometchip: İnsan microarrayed hücrelerde dna hasarına ölçülmesi için bir yüksek verim 96 oyuklu platformu

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA'ya zarar veren ajanlar yaşlanmayı, hastalığı ve kanseri teşvik edebilir ve çevrede her yerde bulunurlar ve insan hücrelerinde normal hücresel metabolitler olarak üretilirler. İronik olarak, yüksek dozlarda DNA'ya zarar veren ajanlar da kanseri tedavi etmek için kullanılır. DNA hasar tepkilerini ölçme yeteneği bu nedenle halk sağlığı, farmasötik ve klinik alanlarda kritik öneme sahiptir. Burada, sabit bir mikrodizideki hücreleri modellemek için mikrofabrikasyon tekniklerinden yararlanan yeni bir platformu açıklıyoruz. 'CometChip', bir elektrik alanındaki bir matris boyunca DNA göçünün derecesini değerlendirerek DNA hasarının seviyesini tahmin eden, iyi bilinen tek hücreli jel elektroforez testine (diğer adıyla kuyruklu yıldız testi) dayanmaktadır. Bu tahlil ile ölçülen hasar türü, abazik bölgeleri, çapraz bağlantıları ve iplik kopmalarını içerir. Geleneksel tahlilde agaroz içinde rastgele dağılmak yerine, hücreler yerçekimi ile bir agaroz mikrokuyu dizisine yakalanır. Platform ayrıca standart bir mikroskop lamının boyutundan 96 oyuklu bir formata genişleyerek paralel işlemeyi mümkün kılar. Burada, bilinen genotoksik ajanların neden olduğu DNA hasarını ve maruziyetten sonra izlenen hücresel onarım tepkisini değerlendirmek için çipi kullanma protokollerini açıklıyoruz. Biyolojik ve mühendislik ilkelerinin entegrasyonu sayesinde, bu yöntem insan hücrelerinde DNA hasarının sağlam ve hassas ölçümlerini güçlendirir ve genotoksisite testi, ilaç geliştirme, epidemiyolojik çalışmalar ve klinik testler için gerekli verimi sağlar.

Bu birinci örnekte, H2O 2 kullanılarak oksidatif hasara maruz kaldıktan sonra, insan limfoblastoid hücrelerde DNA hasarına başlangıç ​​seviyelerinin ölçülmesi için yöntem anlatılmaktadır. H2O 2 ile indüklenen taban lezyonları ve tek kordonlu kırılmaları değerlendirmek amacıyla, alkali kuyruklu koşullar kullanılır. Yükleme tamamlandıktan ve hücreler agaroz kaplaması ile kapsüllenmiş sonra, tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka çip üzerinde 96-bölme oluşturmak için yüzey üzerine bastırılır. 96-deliklerin her biri farklı bir türü ya da kimyasalların konsantrasyonu ile dozlanabilir. Burada H2O 2 dört ayrı dozu kullanılmıştır ve 1 x PBS, negatif kontrol olarak kullanıldı. Dizilmiş kuyruklu temsili görüntüleri arıtılmamış Şekil 1A, (üst), 50 uM (orta) ve 100 uM (alt) H2O 2 -exposed örnekleri kuyruklu kuyrukları farklı seviyelerde ortaya gösterilmiştir. Kuyruklu görüntü analizi performan- edilebilirgenellikle her kuyrukluyıldız kuyruk toplam floresan yoğunluğu ve göç mesafeye göre hasar seviyelerini rakamlarla piyasada mevcut yazılımını kullanarak med. Ölçümler genel olarak hesaplanır 50-100 koşul başına kuyruklu ve medyan değeri (ya% kuyruk DNA ya da kuyruk uzunluğu) üzerinde gerçekleştirilir. Şekil 1B H dört farklı konsantrasyonlarına maruz TK6 lenfoblastoid hücre kuyruklu analiz yüzde kuyruk DNA yanıt eğrisini görüntülemektedir 2 O 2. Bağımsız deneyler arasındaki tutarlılık hücrelerinde kimyasal tedaviler çeşitli düzeylerde DNA hasarı yanıtını değerlendirirken bu yaklaşımın etkinliğini göstermektedir. (Macrowells arasında örneğin) ve aynı deney tekrarları arasında örnekleri arasındaki varyasyon hakkında bilgi edinmek için, inter-örnek ve inter-deneysel değişkenlik sırasıyla Şekil 2A ve 2B çizildi. 96-W her bir deney içinde, her bir gözeell çip farklı bir örneklem eşdeğerdir ve bu nedenle iyi-kuyu varyasyon cihazın arası örnek varyasyonunu göstermektedir. Burada, 96 oyuklu çip 12 kuyu yüklü hücreler TK6 H2O 2 aynı dozu ile muamele edilmiş ve tedaviden hemen sonra lize edildi. Diğer tüm adımlar deney paralel olarak gerçekleştirilmiş ve her bir macrowell en az 50 kuyruklu medians Şekil 2A&#39;da çizilmiştir. Standart sapma 3.99% olan ile medyan ortalama kuyruk 77.53% DNA. Bu verilere göre, örnekler arasında değişkenlik katsayısı Bu deneyde 6,16 geliştirilmiş sağlamlığı gösteren, geleneksel ölçümüne göre birkaç kat daha düşük olan% 5.2 olduğunu hesaplayabilir. Tahlil tekrarlanabilirliği hakkında bilgi edinmek için, 75 uM, H2O ile 2 parçası içinde TK6 hücrelerin maruz kalan ve DNA hasar anında seviyesinin analiz edilmesi. Bu deney, her deney altı kez F ve veri grafiği çizilmiştir tekrarlandıŞEKIL 2B. Aynı deneysel koşullar altında, biz şekildeki gri çubuklar olarak gösterilen, 57.87% 41.76% kadar uzanan sonuçlar elde. Altı tekrar ortalama sadece% 2.04 olan ortalama standart hata ile, 49.57% &#39;dir. Tekrarlar arasındaki varyasyonu düşük bu yeni aygıt üzerinde gerçekleştirilen kuyrukluyıldız deney yüksek tekrarlanabilir olduğunu ima eder. Onarım kinetiğini değerlendirmek için, hücreler tedaviden sonra taze medyada kendi DNA onarmak için izin verilir. Çeşitli zaman noktalarında macrowells yokedici zaman DNA hasarına değişikliği ortaya koymaktadır. Bir örneği Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu deneyde, hücreler ilk TK6, çip kapatıldığı 50 uM, H2O 2 ile muamele edilmiş ve 60 dakika sonraki maruz kalma kadar tamir edilmesine bırakılmıştır. Hücreler, sırasıyla 0, 20, 45 ve 60 dakikada parçalanmıştır. Farklı zaman noktalarında Örnek kuyruklu görsel Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir, ve zaman içinde, DNA hasarı seviyelerinde değişiklik, Şekil çizilmiştir3B. Bu veriler neredeyse tüm hasar 2 O 2 tedavisi 45 dakika sonrası H içinde tamir olduğunu ortaya koydu. Pek çok değişken hücre hattı ve ikinci kimyasal madde tipi de dahil olmak üzere, tamir hızını etkileyebilir. Bu nedenle araştırmacılar protokolü (yani, onarım süresini uzatmak) soruşturmalarında ek ihtiyaçlarını karşılamak için değişiklik yapabilir. Burada 7-metilguanin lezyonlar da dahil olmak üzere temel neden olduğu bilinen bir alkilasyon maddesi TK6 hücreler farklı genotoksik madde N-metil-N &#39;Nitro- K -Nitrosoguanidine (MNNG) ile tehdit burada çipi kullanılarak tamir deney başka bir örneği sağlamak ve 3-metiladenin. Bu lezyonlar kendiliğinden depürinasyon ile ya da DNA glikolazdan ile enzimatik olarak ayrılması ile ya da the abazik dönüştürülür. Elde edilen abazik bölgenin sokulmasını içerir alkalin koşullar altında ayrılır ve böylece çip üzerinde tespit edilebilir. Başlangıç ​​maruz uzunluğunda belirgin hasarına önemli bir artış neden olurhücreler onarım sırasında bütün DNA&#39;yı geri olarak kuyrukları ve zaman içinde bu kuyrukları azalır. Alkilasyon ve oksidatif hasar iki esas olarak baz eksizyon onarım yolağı ile tamir edilir, ancak oluşturulan lezyonların miktarı ve onarımında rol oynayan proteinlerin değişir. Bu varyasyonlar, the yanı sıra, elde edilen abazik sitelerinin tamir farklı oranlarda abazik dönüşüm farklı oranlarına yol açabilir. Şekil 4&#39;te, TK6 hücre onarım kinetiği 0.1, 1, maruz bırakılır ve MNNG 3 ug / ml gösterilmiştir. MNNG kaynaklı hasar uzun bir süre kalıcı görünür ve H 2 O 2 -kaynaklı hasar kıyasla daha yavaş bir hızda temizlenir çünkü bu deneyde, biz 2 saat sonrası maruz kalma deney süresini uzattı. Nötr koşullar kullanılarak DSBs analizi alkalin koşulları kullanılarak tek kordonlu lezyonların analizi için protokole benzer. Ilk hasar düzeylerini göstermek için, TK6 hücreler gir değişken seviyeleri maruz bırakıldı,<html> ve elde edilen hücreler lize edildi ve bir nötr pH değerine (Şekil 5A) ile elektroforez işlemine tabi tutuldu. Bu kuyruklu kuyrukları morfolojisi alkalin deney koşullarında farklı olması dikkat çekicidir. Bu yöntem kullanılarak gözlemlenebilir parçalanmış DNA&#39;nın elde edilmesi için, kullanılan IR dozu alkalin koşulları kullanılarak hasarı görmek için gerekli dozdan daha (0-100 Gy) önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, kuyruk uzunluğu nötr kuyruklu tahlil 7 kullanıldığında, DNA hasarının derecesini yansıtan en duyarlı bir parametre olduğunu bulmuşlardır. Analiz edilen doz-yanıt eğrisi, Şekil 5B&#39;de gösterilmektedir. Hücrelerde DNA çift iplik kırılmalarının tamiri de tespit edilebilir ve Weingeist ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. ark. 7. Birlikte ele alındığında, nötr CometChip DNA DSBs yüksek verimlilik analizi için değerli bir araç sunuyor. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil 1. H2O 2 doz alkali kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre cevabı. (A) 50 uM (orta) ve 100 uM maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücreleri (alt) H2O 2&#39;den dizilmiş mikro kuyruklu 4 ° C&#39;de 20 dakika karıştırıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron. (B) Y, H2O 2 çeşitli seviyesine maruz TK6 hücre 2 O 2 doz tepkisi. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları üç bağımsız deneyler ortalamanın standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Inter-Numune ve Inter-Deneysel Değişkenlik. (A) Örnek-to-Örnek varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 96 oyuklu çip 12 kuyu içine yüklenmiştir. Her bir kuyucuk 50 uM H 100 ul maruz bırakılmıştır 2 O2 4 ° C&#39;de 20 dakika karıştırıldı. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir. Her çukurun veriler aşağıda gösterilmektedir. Her kutu medyan her kuyudan en az 50 bireysel kuyrukluyıldızların temsil eder. 12 kuyu ortalama ± standart sapma% 3.99 ve varyasyon katsayısı% 5.2 olduğu hesaplanır, 77.53% &#39;dir. (B) Deney-to-Deneyi varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 75 uM H2O 2 100 ul maruz kalan, 96 oyuklu bir çip halinde yüklenmiştir. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir.Aynı deney, 6 kere tekrar edildi ve her bir tekrar veri gri bir çubuk olarak gösterilir. Her kutu, her tekrarında en az 100 bireysel kuyrukluyıldızların ortalama% kuyruk DNA temsil eder. 6 tekrarlarının ortalama burada tekrar bar olarak gösterilen, 49.57% &#39;dir. 6 tekrarlarının standart sapması% 4.99, ve ortalamanın standart hatası, şekil hata çubuğu olarak temsil edilen,% 2.04 olduğu hesaplanır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> TK6 lenfoblastlardaki Şekil 3. H tamiri 2 O 2 -kaynaklı hasar. (A) şematik temsili kuyruklu yıldız ile tamir çalışma. TK6 hücreleri hasar maddeleri ile muamele edildi ve liziz önce 37 ° C &#39;de ortam içinde onarmak için izin verilir. (B) 4 ve # 20 dakika boyunca 50 uM, H2O ile muamele edildikten sonra 2 TK6 hücre onarım kinetiği176 C. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları yinelenen deneylerden ortalamanın standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> TK6 lenfoblastlardaki MNNG kaynaklanan hasarı Şekil 4,. Tamiri. TK6 hücreler, 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 0.1, 1 ve 3 mg / ml MNNG ile muamele edilmiş ve 120 dakika mesaja kadar 37 ° C&#39;de ortam içinde onarmak için izin verilen maruz kalma. En az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA&#39;sının üç bağımsız deneyin her biri için elde edilmiştir. Hata çubukları, standart hatayı temsil ederÜç bağımsız deneyden ortalamanın. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> 40 Gy (orta) ve 80 Gy (alt) gama ışımasına maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücrelerden Şekil 5. Nötr kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre İR doz tepkisi. (A), bir mikro dizilmiş kuyruklu. Ölçek çubuğu 100 mikron. Işınlamanın çeşitli seviyesine maruz TK6 hücreleri (B), İR doz tepkisi. Her veri noktası çip üzerinde altı macrowells toplanan en az 300 kuyrukluyıldızların medyan kuyruk uzunluğu (um) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerde yüksek kapasiteli DNA hasarı ölçümleri gerçekleştirmek için COMET çipinin nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu işlem, öncelikle memeli hücrelerin COMET çipine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, hücrelerin DNA hasarına neden olduğu bilinen kimyasallarla işleme tabi tutulmasıdır.Ardından, hücreler geleneksel COMET deneyi protokolleri kullanılarak lizize edilir ve elektroforez uygulanır. Son adım, hasarlı DNA'nın göçünü görselleştirmek için hücresel DNA'nın floresan görüntülemesidir. Nihayetinde, DNA hasarının boyutunu nicelendirmek için görüntü analiz yazılımı kullanılır.Komet deneyi oldukça uzun süredir kullanılmaktadır ve birçok farklı DNA hasarı türünü incelemek için çok yararlı bir yöntemdir. Ancak, düşük işlem kapasitesine sahip olması ve hassasiyetinin yetersiz olması bir sorun teşkil ediyordu. Bu nedenle, temel olarak Komet deneyinin çok yüksek işlem kapasiteli bir versiyonu olan ve örneğin ilaç taramaları ile epidemiyolojik çalışmalar için yüksek kapasiteli tarama yapmayı mümkün kılan COMET çipini geliştirdik.Laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Jing GA prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Coma çipi, tek bir hücrenin çapı kadar küçük çaplı mikro sütunlara sahip mikro fabrikasyonla üretilmiş bir damga ile oluşturulan mikro kuyucuk dizilişli bir jeldir; yerleştirmeye başlamak için jel bağlama filmi tarafı aşağı gelecek şekilde tek kuyucuklu dikdörtgen bir plakaya yerleştirilir. Jeli 25 mL 1X PBS içinde iki kez yıkadıktan sonra, coma çipini bir cam plaka üzerine yerleştirin ve ardından jelin yönünü uygun şekilde etiketleyin.Şimdi, tüm 96 kuyucuğun jel alanının içinde kaldığından emin olarak, ters çevrilmiş altı açık bir 96 kuyucuklu plakayı nazikçe jelin üzerine bastırın. Ardından, 96 kuyucuklu plakanın her iki yanını 1,5 inçlik ataçlarla cam plakaya sabitleyin. Son olarak, her birinden fazla PBS'yi aspire ederek uzaklaştırın.Süspansiyon veya adherent hücreleri standart prosedürlere göre hasat edin ve hücreleri, mililitre başına 100.000 ila 1 milyon hücre nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde medya ile seyreltin. Gerektiğinde hücre filtresinden geçirerek tek hücre süspansiyonu elde edildiğinden emin olun. Hazırlanan comet chip 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin.Buharlaşmayı önlemek için plakayı jel bağlama filmiyle kapatın ve plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. 30 dakika dolduğunda, her kuyucuktaki medyumu aspire edin, ardından mandalları ve altı açık 96 kuyucuklu plakayı çıkarın. Comet çipini cam plaka ile açılı tutun ve aros üzerindeki fazla hücreleri temizlemek için 1X PBS ile nazikçe durulayın. Şimdi, optimal hücre yüklemesini kontrol etmek için plakayı aydınlık alan mikroskobunda 4x objektif lens aracılığıyla inceleyin. Yeterli miktarda hücre yüklendikten sonra, comet çipini düz bir yüzeye yerleştirin ve üzerine 37 °C'ye önceden ısıtılmış %1 düşük erime noktalı agaroz katmanı ekleyin.Kaplamanın oda sıcaklığında üç dakika boyunca katılaşmasını bekleyin ve ardından, hücreleri ilgili kimyasallarla dozlamak için tam sabitleme amacıyla beş dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. İlk olarak, comet çipindeki kuyucukları yeni bir dipsiz 96 kuyucuklu plakadaki kuyucuklarla dikkatlice hizalayın ve üzerine bastırın. 96 kuyucuklu plakayı, daha önce olduğu gibi binder klipslerle cam plakaya sabitleyin.Ardından plakayı buz üzerine yerleştirin ve her bir kuyucuğa istenen dozda 100 µL ilgili kimyasalı ekleyin. İncelenen kimyasalın, dozlama sonrası istenen süre boyunca hücreler üzerinde kalmasına izin verin; her kuyucuğa kimyasal çözeltiyi aspire edin ve gerekirse bir kez XPBS ile durulayın. Jeli ayrı parçalara bölün. Daha sonra onarım kinetiğini incelemek için kuyucuklara kültür ortamı ekleyip inkübe edin ve alkali comet analizi için hücreleri lizlemek amacıyla belirli zaman noktalarında hücre lizisine geçin.Alkalen lizis stok çözeltisine %1 Triton X 100 ekleyerek her bir çip için yaklaşık 25 mililitre çalışan alkalen lizis tamponu hazırlayın. Ardından dört santigrat derecede ön soğutma yapın. Alkolen lizis tamponunu, comet çipinden biraz daha büyük bir kaba boşaltın.Ardından, alkali çipi soğutulmuş çalışan alkali lizis tamponuna daldırın, buzdolabına yerleştirin ve lizisin dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca ilerlemesine izin verin. Ertesi gün, comet çipini lizis tamponundan çıkarın ve hızla bir kez XPBS ile durulayın. Daha sonra çipi, jel film tarafı aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasına yerleştirin ve çift taraflı bant ile sabitleyin.Hazneyi dört derece santigrat sıcaklıktaki soğuk odaya alın ve hazneyi, jeli sadece örtecek seviyeye kadar soğuk alkali elektroforez tamponu ile doldurun. Ardından, alkali açılmanın gerçekleşmesi için çipi dört derece santigrat sıcaklıkta 40 dakika boyunca bekletin. Son olarak, jeli santimetre başına bir volt ve 300 miliamperde 30 dakika boyunca çalıştırın.Soğuk odada, istenen çalışma akımını elde etmek için haznedeki elektroforez tamponu hacmini ayarlayın. Nötr kuyruklu yıldız analizi (comet assay) için, nötr liz stok solüsyonuna %1 Triton X 100 ve %1 DMSO ekleyerek çalışan nötr liz tamponunu hazırlayın. Yine her bir çip için yaklaşık 25 mililitre çalışan liz tamponu hazırlayın.Çalışma nötr lizis tamponunu ön ısıtma için 43 °C'ye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Nötr lizis tamponu ısındıktan sonra, virgül çipini nötr lizis tamponuna daldırın ve gece boyunca 40 °C'lik bir inkübatörde bekletin. Ertesi gün, nötr lizis tamponunu uzaklaştırın ve ardından çipi 4 °C'de 15 dakika boyunca iki kez nötr elektroforez tamponu ile yıkayın. Her seferinde çipi elektroforez odasına sabitleyin ve soğuk odaya taşıyın.Daha önce olduğu gibi, elektroforez haznesini jel yüzeyini hafifçe örtecek seviyeye kadar soğuk nötr elektroforez tamponu ile doldurun ve jeli soğuk odada 60 dakika bekletin; ardından jeli soğuk odada, santimetre başına 0,6 volt ve altı miliamperde 60 dakika boyunca çalıştırın. Gerektiğinde, istenen çalışma akımını elde etmek için haznedeki elektroforez tamponu hacmini yeniden ayarlayın. Com çipini soğuk odadan çıkardıktan sonra, jelleri nötralizasyon tamponu ile iki kez, her biri 4 °C'de 15 dakika boyunca yıkayarak nötralize edin.Cyberg gold veya iridyum bromür gibi floresan bir DNA boyası ile çip içinde bekletin. Üretici talimatlarına göre boyama yapıldıktan sonra floresan mikroskopi ile görüntülenen; işlem görmemiş TK six lenfoblastlarından elde edilen temsili mikrokuyu kometleri bu diyagramın üst panelinde gösterilmiştir. 50 µM hidrojen peroksite maruz kalan TK six hücrelerinden elde edilenler orta panelde, 100 µM hidrojen peroksite maruz kalanlar ise alt panelde gösterilmiştir.Tüm pozlama işlemleri 4 °C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirilmiştir. Bu çizgi grafik, TK6 hücrelerinin hidrojen peroksit doz yanıtını göstermektedir. Her bir veri noktası, her deneyde en az 50 bireysel kuyruklu yıldızın (comet) medyan kuyruk DNA yüzdesinin elde edildiği üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir.Bu grafik, hidrojen peroksite maruz bırakılan TK6 hücreleri için kometa deneyi analizinin örnekten örneğe varyasyonunu göstermektedir; burada her bir kuyucuğun yüzde kuyruk DNA verileri sunulmuştur. Her kutu, her kuyucuktan alınan en az 50 bireysel kometanın medyanını temsil etmektedir. 12 kuyucuğun ortalaması 77,53%, standart sapma 3,99% ve varyasyon katsayısı 5,2%'dir. Bu grafik, deneyden deneye varyasyonu göstermektedir.Aynı hidrojen peroksit uygulaması altı kez tekrarlanmış olup, her bir tekrarın verileri gri çubuklar şeklinde gösterilmiştir. Her kutu, her tekrardan alınan en az 100 bireysel kuyruk DNA'sının medyan yüzdesini temsil etmektedir. Altı tekrarın ortalaması %49,57'dir ve burada siyah çubuk olarak gösterilmiştir.Altı tekrarlamanın standart sapması %4,99 ve ortalamanın hata çubuğu, geleneksel yaygın analizlerde olduğu gibi şekilde hata çubuğu olarak gösterilen %2,04'tür. Araştırmacılar, hücrelerde oluşan DNA hasarının türü hakkında ek soruları yanıtlamak için saflaştırılmış lezyona özgü enzimler eklemek gibi modifikasyonlar yapma veya diğer yöntemleri kullanma konusunda serbesttir. Comet chip tekniği, DNA hasarı ve onarımı hakkında bilgi edinmek amacıyla memeli hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara öncülük etmiştir.Yüksek kapasiteli olduğu için, daha önce örnek sayısının fazlalığı nedeniyle mümkün olmayan klinik ve epidemiyolojik çalışmaların gerçekleştirilmesini sağlar.

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz sinir sistemi ifade profil için DNA mikrodizilerinin kullanımını göstermektedir. Biz, RNA kalite kontrol, örnek etiketleme ve dizi hibridizasyon ve tarama açıklar.

DNA Mikroarray&#39;ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Bu videoda, otomatik kılcal elektroforez kullanarak hücresiz DNA veya cfDNA fragmanlarının boyut dağılımını analiz ediyoruz. Bu teknik, apoptoz sırasında kanser hücreleri tarafından salınan DNA parçalarının profili hakkında bilgi edinmeye yardımcı olur.

cfDNA'nın Otomatik Kapiler Elektroforez Tabanlı Parça Boyutu Dağılımı Analizi: Biyosıvılardan İzole Edilen DNA Parçalarının Boyut Dağılımını İncelemek İçin DNA Mikroçip Tabanlı Bir Yöntem

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Doğal γH2A.X kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yoluyla yaygın kırılgan bölge kırılmalarını tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili hem zamanı hem de işçiliği önemli ölçüde azaltırken, sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini korur.

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Öğrenin, COMET chip platformu ile memeli hücrelerde DNA hasarını yüksek verimli ölçme yöntemini. Bu teknik, ilaç taraması ve epidemiyolojik çalışmalar için DNA onarım kinetiği analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Daha fazla video keşfet