Name: Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarrayler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, sol-jel türetilmiş protein mikroarray'ler geliştirmek için rehberli malzeme tarama yaklaşımını. Bu yöntem, asetilkolinesteraz ve multikinaz mikroarray'leri oluşturarak küçük molekül taramalarında yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar protein microarrays gelişiminde yardım için Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Küçük, Xin Ge ve Laura Lautens teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu iş için fon Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu işin destek için Yenilik ve Ontario Yenilik Güven için Kanada Vakfı teşekkür ederim. JDB Biyoanalitik Kimya ve Biointerfaces yılında Kanada Araştırma Başkanı tutar.

<ol><li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+HH+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li>
<li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li>
<li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
<li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacBeath%2C+GG+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST+slides%3A+a+novel+surface+for+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li>
<li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li>
<li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+biologicals+within+silicate%2C+siloxane%2C+and+hybrid+sol-gel+polymers%3A+An+efficient+and+generic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sol-gel+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-modified+silanes%3A+precursors+for+silica+monoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469(2004).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+protein+microarray+support+materials%3A+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li>
<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan yöntem hızla malzemelerin çok sayıda ekran zorunda kalmadan uygun malzemeler belirlenmesi için bir zaman ve maliyet-etkin bir üretim yöntemini, bir iletişim yazıcı ile basılabilir sol-jel türetilen maddeler belirlenmesi için en uygun olarak seçilmiştir. ~ 20,000 potansiyel malzemeler toplam kaynaktan, tek başına jelleşme süresi temelinde baskı için uygun olan ~ 200 malzemeleri tespit etmek mümkün olmuştur. Bu durum sonraki baskı denemeleri için hazırlıklı olmak gerekli malzemelerin sayısını azalttı. Bu yazdırılabilir malzeme daha sonra 768 malzeme-slayt kombinasyonları olmak üzere toplam 4 slayt yüzeyler üzerine basıldı. Ortalama olarak, bir malzemenin 50 noktalar / çoğaltır örnek yükleme, nokta birikimi ve pin temizlik dahil olmak üzere ~ 3 dakika, basılabilir. Bunlardan, 155 malzeme, ya da kabaca 20%, çözüm alım başına noktalar en fazla sayıda baskı için izin ve tekrarlanabilir nokta boyutları üretti. Şunu belirtmek gerekir ki bu 4 SLide yüzeyler test, malzeme için daha iyi basılmış: amin&gt; epoksi&gt; aldehit&gt; PMMA; PMMA slaytlar herhangi bir malzeme için yararlı diziler vermedi. Bu büyük olasılıkla yüzey kaplama kutup bağlandı. Sözü edilen kızak yüzeyleri karşılaştırıldığında, daha polar bir amin ve epoksi daha PMMA slaytlar göre sulu soller için uygun. Buna ek olarak, test edilen yüzeylerin, amin kaplı slaytlar bağ anyonik sol yatırılır için potansiyel bir pozitif yüklü yüzey sağlar. Biz şüpheli, silika slayt ve sol yüzeyi boyunca etkileşim arasındaki arayüzü nanopartiküller. Epoksi ve aldehit slayt yüzeyler her ikisi de aynı ilk şarj tabanlı etkileşim eksikliği. En iyi nokta birikimi sağlamak için son derece böyle Arrayit gibi bir tedarikçiden ön kaplı slaytlar kullanılması önerilir. In-house kaplama kötü nokta tekrarlanabilirlik 13 ve yol tutarsız yüzeyler üretir, bazı durumlarda, miktar prob yol açabilirvelilerine. eşit önem Of 18, sıcaklık ve nem malzemelerin &quot;printability&quot; etkiler. Sıcaklık ile ilgili etkileri üzerinde detaylı çalışmalar gerçekleştirilmiştir da, baskı her zaman oda sıcaklığında gerçekleştirilir (23 ± 3 ° C) yıkandı. Nem oranı (% 80&#39;den fazla) da küçük miktarlar birikimi (0,7-2,3 nl) ve buharlaşma nedeniyle düzensiz şekil birikmesini önlemek için baskı odası içinde kontrol edildi. Malzeme ekran AChE ve kinazlar, protein her iki tip için çalıştı malzemelerin küçük bir set belirlendi baskı için özel olarak en iyi sol-jel türevli malzemeler tespit doğru yönlendirilir iken. Gerçekten de, kinaz mikrodizi imalatı için tespit edilen malzemenin her iki SS + PVA + gliserol dayanmaktadır, ve her iki malzemenin de AChE mikrodizilerinde seçilen malzeme 26 içinde tespit edilmiştir. Bu &quot;iyi&quot; malzeme daha prote geliştirmek için genel bir başlangıç ​​noktası sunabilirBu kompozisyonlar etrafında in-katkılı sol-jel tabanlı mikroarrayler ve küçük ekranlar mikroarray üretim için daha iyi malzeme tespit edebilir. Unutulmaması gereken ikinci bir nokta kullanılan enzim önemidir. AChE (oldukça sağlam bir enzim) durumunda, test uyumlu olarak tanımlanan özgün 66 malzeme 26 (ya da yaklaşık% 40) sıkışmış AChE aktivitesi korunur. Bununla birlikte, daha hassas kinazlar için, tahlil 69 ile uyumlu bir kompozisyon ya da malzeme yaklaşık% 3, sadece 2&#39;si kinazların aktivitesini koruyan başardık. Farklı enzim yeterli sayıda kesin açıklama yapmak incelenmemiştir olsa da, nispeten kararsız enzimler ile bu optimize dizi üretim mutliplexed mikroarray üretim izin proteinlerin geniş bir tuzağa düşürmek için kullanılan malzemelerin belirlenmesi yol açabilir görünür. Seçilen bir protein bağımsız olarak, yazdırılabilir malzeme belirlenmesi için önemli bir cut-off faktörü uzun için duyulan ihtiyaçmalzeme jelleşme zamanı (&gt; 2.5 saat). SS sol-jel esaslı malzemelerin geliştirilmesi, bu iyon değişimi ve süzme sonrasında, çözeltinin pH değeri yaklaşık 4 olduğu, sağlamak için çok önemlidir. Daha düşük bir başlangıç ​​pH değerine sahip soller enzim aktivitesini etkileyebilir. 19 AYAR SS Dowex (iyon değişimi reçinesi) miktarı Sol nihai pH değiştirebilen bir daha düşük olma, nötr pH ile malzeme ile sonuçlanabilir. Bu reçinenin yeni bir parti hazırlandığı zaman SS reçine oranı protokol bölüm 2&#39;de belirtilen prosedür takip yaklaşık pH 4 olarak soller üretmek için ayarlanabilir olması gerekmektedir. Benzer şekilde, kristal dsu hazırlık genellikle biyomolekülün yakalanmalarında EGM tabanlı soller kullanılıyorsa malzeme yetmezliği ile ilişkili bir hata kaynağıdır. Burada ayrıntılı olarak rapor edilmemiş olmasına rağmen, büyük bir özen polyglycerated silika üretebilir, özellikle kristalin dsu sentezi, sentez sırasında suyun varlığında önlemek için gerek sırasında alınması gerekiryerine monomerik DGS daha tes. Ayrıca, dsu higroskopik doğası nedeniyle, kristalin örnek kurutulmuş ve sentezden sonra 6 ay içinde kullanılan saklanır gerekmektedir. 6 aydan büyük kristal DGS hatta asidik ortamda sonikasyon ile (nedeniyle kısmen yoğunlaştırılmış poligliseril silikat malzeme) tam çözülür olmayabilir. Eksik DGS çözünme bilinmeyen ve kontrol edilemeyen silis içeriği ve bu nedenle, daha az sağlam malzemelerle soller üretir. Temas baskı ile Unutulmaması gereken önemli bir nokta işaretçilerine kalitesidir. Hasarlı veya yanlış kullanılmış işaretçilerine (Şekil 9) yazdırılan malzemenin bağımsız tekrarlanabilir dizileri üretmek asla. Bu kırık veya tıkanmış işaretçilerine kullanılmaz sağlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak pin kalitesini kontrol etmek için önerilir. Dikkatli kullanım işaretçilerine için uzun ömürlü olmasını sağlar. Piminin serbest hareketi de önemlidir. Nem baş ve pin arasındaki baskı kafası, pin sıkışmış durumdadoğru koltuk ve böylece malzeme birikimi eksikliği sonucu, yüzey ile uygun temas yapmaz olmaz. Sonuç olarak, yüksek yoğunluklu protein katkılı pin baskılı mikroarrayler geliştirmek için ayrıntılı, çok adımlı tarama yaklaşım sağladı. Tarama daha odaklı tarama takip malzemelerin baskı, belirli bir test ile uyumlu ve enzim aktivitesi muhafaza edebiliyoruz malzemeleri tanımlamak için izin malzeme özelliklerinin optimizasyonu (jelleşme süresi ve printability) içerir. Bu güdümlü malzeme tarama yaklaşımı zaman ve verimli yüksek yoğunluklu mikrodiziler üretimi ile ilgili maliyet düşürmek için ilave mikrodizi biçimleri uygulanabilir.

Mikroarray&#39;ler tahlil hacmi artırmak için bir yöntem olarak bilimsel topluluk içinde popülerlik kazanmıştır. Mikroarray teknolojisinin gelişmesi 1990&#39;ların ortalarında gen 1 değerlendirmek için, mikroarray&#39;ler protein-protein ve protein-küçük molekül etkileşimleri tanımlamak için, ve benzersiz özelliklere sahip yeni malzemeler bulmak için yüksek verimli deneyleri gelişiminde kullanım bulduk. 2-5 Daha yakın zamanlarda, mikrodiziler uygun bir floresan kullanılarak mikrodizi kendisinde enzimatik aktivitesi ve inhibisyon kolay ölçümü sağlayan, özel malzemeler proteinler sürüklenmiş edildiği bir üç boyutlu mikroarray elemanı üreten, fonksiyonel proteinleri immobilize etmek için kullanılan burada geliştirilmiştir substrat ciroya birleştirilmiştir tahlil. 5-10 Önemli olarak, bu tür bir çok paralel mikrodizilerinde olarak birlikte gerekli tüm ekran örnekler için bileşenler ve kontroller için dizayn edilebilir. 5,8 &lt;/ P&gt; Protein microarrays erken örnekleri tipik olarak kovalent bir eki olarak bir katı destek, üzerine protein immobilizasyonu için standart yöntemler kullanılarak hazırlandı, 3 11 afinite yakalama ve fiziksel adsorpsiyon. 12 biyo-immobilizasyonu, bu yöntem için gerekli olan artış Örnek konsantrasyonu ve hızlandırılmış reaksiyon kinetiği için izin verirken testi minyatür, her sakıncaları muzdarip. Genel olarak, her bir yüzeyin kimyasal modifikasyonu nedeniyle yerel biyomolekülün özelliğe azalma, aktif yerleri erişimi engellenmiş ya da spesifik olmayan hareketsizlik nedeniyle düzgün olmayan bir doğrultuda neden olur. Bu nedenle, biyomolekülün depozisyonunda bir artışı, muhtemelen yapay bir yüzeye biyomoleküllerin bağlamak için ihtiyacı nedeniyle ortaya çıkan bir tepki rağmen bütün yöntemleri düşük hassasiyet deneyi ile sonuçlanır. Fonksiyonel biyomolekülün microarrays üretimi için gelişmekte olan bir yaklaşım protein katkılı pin-baskı geçertipik olarak Fonksiyonlu cam slaytlar veya mikro plakaları tek tek kuyu olan katı destekler üzerine silika soller,. Sol-jel işlemi, kendi başına, oda sıcaklığında bir sulu ortam içinde yer alır, ve bunun içinde 13 yükleme yanı sıra, birden fazla bileşenden tuzak yüksek protein sağlayan, basılmış ve daha sonra 3D matris içinde entrap biyomoleküllerin jeller bu sıvıyı öncüsüdür Aynı mikrodizi elemanı. sol-jel türetilmiş malzeme 13,14 Biçme yanı sıra farklı tamponlar kullanımı (pH, iyonik kuvvet) aracılığıyla sulu bileşen değiştirerek, farklı silis öncülerinin dikkatli seçimi yoluyla yapılır ve kaynaştırma edilebilir optimal bir malzeme elde etmek için, çeşitli katkı maddeleri (polimerler, küçük moleküller), özel doğası sıkışmış bir biyomolekülün bağlıdır. 10 Pin-baskı ile sol-jel türevli protein mikroarrayler geliştirme ile ilgili olası bir sınırlamapin jelleşme olmadan basılı veya kez bir yüzey üzerine basılmış istenmeyen özellikleri (üretilemez nokta boyutları, çatlama, yapışmayı, tahlil bileşenleri ile uyumsuzluk, kötü protein aktivite) gösteren edilebilir sol-jel bazlı kompozit malzemeler tanımlamak için ihtiyaç. 5 Eşzamanlı tüm bu parametrelerin optimizasyonu bir yaklaşım, burada malzeme de novo olarak dizayn edilebilir önleyen ya da seri bir şekilde yavaş yavaş incelenmiştir. Diğer yandan, bir çok bin veya malzeme onbinlerce rastgele tarama ne zaman ne de maliyet-etkindir. Bu yazıda, rastgele malzemelerin çok sayıda taranması için gerek kalmadan proteinin microarrays üretimi için uygun malzemeler arasında hızla belirlenmesini sağlar yönlendirilmiş bir tarama yaklaşımı açıklar. Bir güdümlü bir yaklaşım kullanarak, mikroarray baskı için uygun malzeme ilk tanımlamak için küçük ölçekli ekranlar bir dizi izledi, tanımlanan sol-jel malzemeler elde en iyiAl kombinasyonları bu çatlama olmadan, yeniden üretilebilir biçimde basılmış ve belirli bir tahlil ile uyumlu olabilir. Son olarak, en uygun malzeme nihai bir küçük moleküllü bir tarama deneyi, enzim aktivitesi ve performans tutma göre tespit edilir. Bu şekilde, en uygun malzeme sadece bir kaç yüz tahlilinde adımları kullanarak birçok bin aday ikinci tespit edilebilir. Biz yüksek yoğunluklu asetilkolinesteraz ve multikinaz mikroarrayler ve küçük moleküllü tarama için bu tür microarrays kullanımı hem de üretim için bu yaklaşım göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü > Reaktif / Malzeme< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Poli (vinil alkol) (PVA)</td> <td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>% 80 hidrolozy, M < alt > < / alt> 600</td></tr><tr><td>Polietilen glikol 600 (PEG)</td> <td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)</td> <td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>suda ağırlıkça% 50 çözelti</td></tr><tr><td>Karboksietilatilanetriol (Si-COOH)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>Suda% 25</td></tr><tr><td>N- (3-trietoksisililpropil) glukonamid (GLS)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>bis[(3-metildimetoksisilil)propil]polipropilen oksit (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td> içinde %50.<td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metiltrimetoksisilan (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis (trietoksisiyly) etan (Bis-TEOS)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoksisilan (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Trehaloz dihidrat</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N ve epsilon; < / açıklık>-Asetil-L-lizin</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, 1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit, 1.0 N/0.1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digliserolsilan (DGS)</td><td></td><td></td> <td>Laboratuvarda hazırlanan</td></tr><tr><td>Sodyum silikat çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 iyon ekspresyon reçinesi</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Asetiltiyokolin</td><td>iyodür Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td> Electrophorus electricus (elektrikli yılan balığı)</td> <td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Sistin</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Elmas Fosfoprotein/Fosfopeptid Mikroarray Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenozin 5'trifosfat disodyum tuzu (ATP) çözeltisi</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinaz 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), aktif</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGFR)</td><td>Millipore</td>Glikojen sentaz kinaz 3 ve beta tarafından bağışlanan <td>EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>; (GSK-3 ve beta;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Miyelin bazik proteini (MBP)</td> <td>MAPK2 ve p38&alpha; için</td> <td>EMD Millipore</td><td></td> Substratı, Millipore</tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>GSK-3 ve beta için Substrat;</td></tr><tr><td>Poli-glu-tyr polipeptit p (E4Y)</td> <td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>EGFR</td></tr><tr><td>Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td> <td>için Substrat &</td></tr><tr><td>Gizli pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amin kaplı slaytlar</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aldehit kaplı slaytlar</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Exposy kaplamalı slaytlar</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli (metilmetakrilat) (PMMA) kaplı slaytlar</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&mu; m şırınga filtresi</td><td>PALL Yaşam Bilimleri</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Virtek İletişim Yazıcı</td><td>BioRad</td><td></td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray Floresan Slayt Görüntüleyici</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Masaüstü mikrodizi santrifüj</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Sentezi A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Deneyler için gerekli tüm suyu filtrelemek için kullanılır</td></tr></tbody></table>

kantitatif sol-jel türetilmiş protein mikroarray&#39;ler geliştirilmesi için rehberli malzeme tarama yaklaşım

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Mikrodiziler yeni malzemeler ve küçük moleküllü ilaç potansiyel keşfi için yüksek verimli testlerin geliştirilmesinde kullanımı bulduk. Burada üç boyutlu protein mikrodiziler üretimi için uygun olan, sol-jel esaslı malzemelerin belirlenmesine yönelik bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşım ilk, mikroarray&#39;ler olarak basılabilir malzeme tanımlayan maksimum enzim aktivitesi tutma dayalı belirli bir enzim testi ile uyumlu olanlar, ve sonra en uygun malzeme üzerinde dürüst belirleyerek malzemelerin sayısı daraltır. Bu yaklaşım, kanser dahil dört temel kinazlar bir dizi kullanarak asetilkolinesteraz ve diğer kullanılarak iki farklı enzim deneyleri, tek bir uygun mikrodiziler geliştirmek için uygulanır. Her iki durumda da, bu miktar küçük moleküllü tarama deneyleri ve doza bağımlı bir inhibitörü yanıt eğrileri üretimi için kullanılabilir mikrodiziler üretmek mümkün olmuştur. Önemlisi, yeteneği birçok arkadaşı ekranarials iyi enzim aktivitesi mikroarray üretim ve saklama hem de uygun malzeme türleri hakkında bilgi üretti. Malzemeler veriler uygun, yüksek yoğunluklu sol-jel elde mikroarrayler dikme için gerekli temel malzeme ihtiyaç ilişkin bilgi sağlar.

Malzeme ekran için bir rehberli faktör analizi yapılarak, biz ~ 20.000 yazdırma için uygun jelleşme zamanı vardı birkaç yüz için test malzemeleri sayısını en aza indirmek mümkün. Sıkı bir kılavuz gerektiren malzeme jelleşme süresi uygulayarak 2.5 saat veya daha fazla, baskı işaretçilerine yapışmasına neden veya üretilemez dizileri üretmek için muhtemel malzemeleri basılı hiçbir zaman. Yeterli (&gt; 2.5 saat) jelleşme günler için tespit yazdırılabilir malzeme 4 farklı Fonksiyonlu cam slayt yüzeyler üzerine basıldı. Düzen &quot;yazdırılabilir&quot; dikkate alınması gereken olarak, pin alındıktan hacim başına noktalar sayısı (SMP3 = 200) basılacak vardı. Noktalar da çatlama veya istenmeyen faz ayrılması Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi basit aydınlık mikroskopi kullanılarak gerçekleşmişti sağlamak için nokta morfolojisi değerlendirildi. Tespit yazdırılabilir malzeme bu aşamasında itibaren, mikroarray&#39;ler AChE ile üretilen ve edildikinazlar, tamponlu, sulu bir bileşen içine dahil edilmiştir. Tahlil işlemi (potansiyel üst baskı da dahil olmak üzere ve adımları yıkama veya boyama) ile uyumlu idi Malzeme (NC negatif kontrol için mikroarray noktalar tutma (çatlama, noktalar veya olağandışı floresan desen kaybı) ve pozitif kontrol (PC) gözlemleyerek tespit edildi ) görüntü ile gözlemlediği gibi 1&#39;den oranı yüksek. Bu malzeme yaklaşık% 50 protein etkinliğin tutulması ile uygun malzemeler tanımlamak için kullanılan 3 daha büyük bir PC / NC oranı olduğu gibi. Bu yöntem sayesinde,&gt; 3 PC / NC kriterlere uygun kinaz içeren AChE ve 2 malzemeleri içeren 26 sol-jel türevli malzemeler. Şekil 3 ve Şekil 4 en iyi AChE ve kinaz belirlenmesi için 5 güdümlü malzeme ekrandaki adımları bir grafik dökümünü gösterir mikroarrayler, sırasıyla. Tahliller, aynı zamanda, bir Z &quot;skorunun nesil ile geçerli olabilir. 17 </sup&gt; Bu en yüksek PC / NC oranı üretilen malzeme kullanılarak yapıldı. Şekil 5 Z &#39;arsa 200 noktalar, 100 PC ve AChE dizi gösterge boya ve yüzey üst baskı sonrası 100 NC üretilen sinyal karşılaştırarak elde gösterir. AChE ve kinaz diziler mükemmel bir test göstergesi 0.60 ve 0.67 ve ilgili Z &#39;skorları, sonuçlandı. Ancak, bu tahlil onaylama önce, on-dizi enzim, boya, substrat ve kofaktör konsantrasyonlarda başka ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, her bir bileşenin bir konsantrasyon aralığında üst baskı ve en yüksek sinyal üretilen konsantrasyonu seçilerek optimize edilmesi gerektiğini belirtmek gerekir . 5 Deneyleri doğrulamak için, nicel inhibisyon verileri iki kopya halinde gerçekleştirilir ve yinelenen araziler (Şekil 6A) ve inhibisyon eğrileri (Şekil 6B ve 6C) üretmek için kullanılır sonuçlar, bilinen ve bilinmeyen AChE inhibitörü kullanılarak elde edildi. &lt;Güçlü&gt; Spotlar ilk boya ve alt-tabaka ile daha sonra bilinen biyolojik olarak etkin olan küçük moleküllü inhibitörleri karışımları ile kesilmektedir edildi ve bilinen inhibitörleri veya inhibitör ya da bunların karışımları ihtiva eden kontrol dahil edilmiştir. Yinelenen araziler enzim aktivitesini değerlendirmek için oluşturulan ve en az% 25 enzim aktivitesi sonuçlanan herhangi bir karışımı da engellenmesi için pozitif olarak kabul edilmiştir. Bu tür karışımlar, tek tek bileşikler, daha sonra inhibisyonundan sorumlu spesifik küçük bir molekül (ler) tanımlamak için iki kopya halinde test edildi. Sonra, belirlenen bu küçük moleküller, IC50 değerleri ve inhibisyon sabitlerini belirlemek için niceliksel inhibisyon eğrileri oluşturmak için kullanılmıştır. Benzer nitel sonuçları ortak bir kinaz inhibitörü, Staurosporin ile multikinaz dizi kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 7A ve 7B mikroarray görüntü göstermek ve gösteriyor ki üst baskı ve multikinaz boyama sonra sinyal yoğunlukları(- ATP), pozitif kontrol (+ ATP içermeyen) ve bilinen bir inhibitörü (+ ATP + inh) bir dizi olarak bir negatif kontrol için beklenir. Mikroarray&#39;ler gelen nicel inhibe veri elde etmek için yeteneğini göstermek için, bir konsantrasyon bağımlı inhibisyon deneyi tek kinaz için yapıldı. Şekiller 8A ve 8B&#39;de gösterildiği gibi, sinyal yoğunluğu inhibitör konsantrasyonu arttıkça azalır, ve bu tepki p38α/MBP kinaz / alt sistem için beklenen konsantrasyon bağımlı bir inhibisyon eğrisini takip etmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Şekil 1. Güdümlü malzeme tarama yaklaşımı için genel şematik. Her blok sırayla ekranın bir adımı temsil etmektedir. Sol taraftaki numaralar analizi için hazırlanan malzemelerin toplam sayısını temsil eder. Daha büyük 2.5 saat (jelleşme kez malzemeleri az 2.5 saat ar bir jelleşme zaman kullanmae) çizili ile gösterildiği gibi, her bir aşama geçti ve malzeme ekran esnasında taşınan malzeme numarası sağ numara ile gösterilir. * En iyi faz ayrılması daha az olan malzemeler temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Şekil 2. Ekranın basılabilirlik aşamasında malzemelerin çeşitli hata modları gösteren optik görüntüler. &quot;Iyi&quot; malzeme (ikinci satır, üçüncü sütun) bir görüntü de karşılaştırma için gösterilmiştir. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Şekil 3,. Sol-gel-türetilmiş AChE mikroarrayler imalatı için en iyi malzemelerin belirlenmesi için bir yönetmen malzeme tarama yaklaşımı. Perma ile yayımlanmaktadırreferans 5, telif hakkı 2.013 Amerikan Kimya Derneği ission. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Şekil 4. Sol-gel-kaynaklı kinaz mikroarrayler imalatı için en iyi malzemelerin belirlenmesi için bir yönetmen malzemeleri tarama yaklaşımı. Referans 8, telif hakkı 2.013 Amerikan Kimya Derneği izni ile yayımlanmaktadır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Şekil 5,. (A) HC (parlak yeşil) ve LC (açık yeşil) noktalar (siyah-yeşil paleti sunum netlik için Pseudocolor olarak uygulanmıştır) gösteren AChE mikroarray bir bölümü, (B) kutulu alanı büyütülmüş bir görünüm nokta vurgulamak için morfolojisi ve hizalama,. ve (C) Z &#39;komplo Düz çizgiler ve ortalama gösterir<html> kesikli çizgiler 3SD uygun ise, çoğaltır. Referans 5, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> 6 Şekil. (A) &#39;Amaryllidaceae alkaloidler sentetik analogları on-dizi tarama için arsa Yinelenen, (B) belirli bir potansiyel inhibitörleri araziler IC50 bileşik 1 ve 25 arasındaki ortalama bir standart sapma gösteren hata çubukları, (c) bileşik 2 olarak işaretlenmiş çoğaltır. Örnek noktalar inhibitör konsantrasyonu ile orantılı sinyal farklılıkları göstermek için gösterilmiştir. Referans 5 izniyle, telif hakkı 2.013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Şekil 7. On-dizi olarak yakalanmalarında 1.4SS/1.0PVA kullanarak, dört kinaz deneyi ve bir amin ile derivatize slayt üzerine basıldı. (A) kinaz, ilgili maddeler ile birlikte sürüklenen ile lekeler tamponu ile kesilmektedir edildiği mikrodizisinin bir bölümünün bir görüntüsü (NC, üst sıra), ya da ATP (PC, orta sıra) veya ATP + Staurosporin (alt sıra) içeren çözümler. (B) arasında sinyal yoğunlukları karşılaştırarak Bar grafikler inhibe ve 25 ortalama bir standart sapma temsil eden arka plan sinyal ve hata çubukları çıkarma sonra sınır tanımayan reaksiyonlar, çoğaltır. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle. <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Şekil 8. Inhibiti. bir p38a/MBP mikroarray analizi (A) staurosporinin konsantrasyonları değişen overspotted temsilcisi noktalar gösteren microarrays Bölüm, olarak (; kompozit görüntü netliği için gösterilen görüntüler aynı slayt tek bir tarama ile elde edilmiştir) belirtti. (B) IC 50 eğrisi analiz dizi görüntüler elde. 100 mM elde yoğunluğu, her görüntü çıkarılmıştır; diğer tüm yoğunlukları% 100 bir etkinlik değeri 10 nM &#39;de elde edilen yoğunluğu ayarlanarak normalize edildi. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle. <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> 9 Şekil. Temas çeşitli kusurları gösteren pin-baskı için kullanılan mikroskobik gizli pin Görüntüler: (A) tıkalı, (B) bükülmüş.

Üretim gelişmekte olan bir pin-baskı yöntemi kullanılarak sol-jel türevli protein katkılı mikroarrayler geliştirmek için bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklanmıştır. Bu metodoloji maliyet-etkin küçük moleküllü tarama için kullanılan asetilkolinesteraz ve multikinaz microarrays, geliştirilmesi yoluyla gösterilmiştir.

Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray&#39;ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Bu prosedürün genel amacı, mikro-dizi üretimi için yeni sol-jel tabanlı malzemeler belirlemek ve bunları nano hacimli enzim analizlerinde kullanmaktır. Bu süreç, öncelikle baskı sırasında mikro-dizi baskı pininde jelleşmeyi önlemek adına yeterince uzun jelleşme sürelerine sahip malzemelerin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, uzun jelleşme sürelerine sahip malzemelerin mikro-diziler halinde tekrarlanabilir şekilde basılma yeteneklerini, çatlamaya karşı dirençlerini, yapışma kalitelerini, istenmeyen faz ayrışmalarını ve nihayetinde hapsedilen enzimler için yüksek aktivite sağlayıp sağlamadıklarını değerlendirmektir.Ardından, ilgili enzim optimal malzemeler kullanılarak bir mikro-dizi şeklinde basılır ve assay çözeltisini üzerine alma ve ölçülebilir bir enzimatik yanıt oluşturma yeteneği test edilir. Son adım, malzemelerin ilgili enzimi kullanarak yüksek düzeyde tekrarlanabilir assay'ler sağlama ve kantitatif veriler üretme yeteneklerini değerlendirmektir. Ardından, dizi üretimi için nihai malzeme seçilir.Nihayetinde, sol jel türevli protein mikro dizileri, enzim aktivitesini azaltan küçük molekülleri tanımlamak için kullanılır. Bu yöntemin plaka tabanlı tarama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, düşük miktarlarda reaktif kullanarak çok sayıda materyalin sistematik bir şekilde ve çok hızlı bir biçimde taranabilmesidir. Genellikle, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, basım pinleri içinde materyallerin jelleşmesi olasılığı nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Bunlar düzgünce temizlenmezse, yazdırılamayan maddeler olarak yorumlanabilecek eksik noktalar oluşacaktır. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde çok sayıda katkı çözeltisini hazırlayın. Çözeltilerin çoğu önceden hazırlanabilir ve uygun koşullar altında bir ay veya daha uzun süre saklanabilir, ancak bazıları deneyin yapıldığı gün hazırlanmalıdır.Sodyum silikat bazlı testereleri kullanmadan hemen önce karıştırın ve buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Suyun eklenmesinden sonra SOS bir saat içinde kullanılmalıdır; çünkü daha uzun bekleme süreleri, azalmış ve tutarsız DATION sürelerine yol açar. Ardından, 2,5 saatten daha uzun dilatasyon sürelerine sahip yazdırılabilir malzeme olarak hangi kombinasyonların kullanılabileceğini belirlemek için, beraberindeki metin protokolünde belirtildiği şekilde çeşitli tampon, salan polimer ve organ lan kombinasyonları hazırlayın.Bir dizi kombinasyon belirlendikten sonra, baskı odasındaki nemi %80 ile %90 arasına ayarlayın; %80'in altındaki nem, yazıcıdaki küçük depozisyon hacimleri nedeniyle numune buharlaşmasına ve baskıda tutarsızlıklara yol açabilir. Hazırlıklar tamamlandığında, Chip Writer Pro programını kullanarak basılacak dizi desenlerini düzenleyin. XY yönündeki ilerleme hızını saniyede 10 milimetre, Z yönündeki numune yaklaşma hızını saniyede iki milimetre ve daha önce belirlenen saw gel kombinasyonlarını kullanarak numune yükleme süresini 2,5 saniye olarak ayarlayın.Ön tarama süreciyle belirlenen ilgili polimerleri, organolanları ve küçük molekül katkılarını birleştirerek 25 µL baz materyal hazırlayın. 384 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasının münferit kuyucuklarına, pH değeri 8.0 olan 50 mM çözeltiler ekleyin. Ardından, 100 µm çapındaki dört adet yarık kılıf pimini çift distile su içerisinde sonikasyona tabi tutun.15 dakika sonra, bunları azot akımı altında kurutmayı deneyin. Ardından, pin tutucunun içindeki kalıntı nemi gidermek için bir boru temizleyici kullanın ve pini dikkatlice temas pini yazdırma robotunun baskı kafasına yerleştirin. Kalıntı nemin giderilmemesi, pinin tutucuyla birlikte serbestçe hareket etmesini engelleyebilir ve bu da boşlukların oluşmasına neden olabilir.Ardından, yazdırma işleminden hemen önce kuyucuğa ilgili SA'dan 25 µL ekleyin. Pipetle karıştırırken, çözeltiyi 50 kez tekrarlanan aşağı-yukarı pipetleme hareketiyle karıştırın. Çözeltiye giren hava miktarını minimuma indirin.Hava kabarcıkları, numunenin pin içerisine tamamen yüklenmesini engeller. Ardından, pini numuneye indirerek doldurun. Pinler yüklendiğinde, baskı işlemine başlayın ve numuneyi bir lam yüzeyine basın.Bir sonraki kaynak plakaya tuz eklemeden önce yazdırma işlemini durdurun. İşlem duraklatılmışken, yazdırma pinini bir mıknatıs kullanarak çıkarın ve yazdırma kafasında nem birikmesini önlemek için yazdırma kafasına bir temizleme çubuğu yerleştirin. Ardından, yazdırma pinini çift distile su ile durulayın ve temiz çift distile su içerisinde 30 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.Ardından, baskı pinini bir azot akımı altında kurutun ve pini tekrar baskı kafasına yerleştirin. Kaynak plaktaki kalan tüm örnekler için karıştırma, baskı ve temizleme işlemlerine devam edin; tek bir lam üzerine 100 mikron çapında 12.000 noktaya kadar depozisyon yapılabilir. Baskı işlemi tamamlandığında, diziyi baskı odasında %80 ila %90 nemde minimum 30 dakika ve maksimum 24 saat boyunca olgunlaştırın.Kullanımdan hemen önce, 25 µL 1 mM asetilkolin iyodür ile 0,14 µL 5 mM BODIPY FL sisteini ve pH 7,0'da 4% gliserol içeren 25 mM TRIS'i bir 384 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasının kuyucuğunda birleştirerek 50 µL pozitif kontrol hazırlayın; çözeltiyi, kabarcık oluşturmadan karıştırmak için pipetle yavaşça aşağı yukarı çekin. Ardından, 0,14 µL 5 mM BODIPY FL sisteini ile pH 7,0'da 4% gliserol içeren 49,86 µL 25 mM TRIS'i 384 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasının başka bir kuyucuğunda birleştirerek ve nazikçe karıştırarak kullanımdan hemen önce negatif kontrolleri hazırlayın. Kontrolleri, önceki bölümde açıklanan süreçlerin aynısını kullanarak yaşlandırılmış mikro diziler üzerine basın. Ancak, 100 mikron çaplı pinler yerine, 235 mikron çaplı slotlu çentikli pinler kullanın.Bu işlem, çözeltilerin daha önce yerleştirilen lekeleri tamamen kaplamasını sağlar. Asetilkolinin otohidrolizi nedeniyle lekeler, oda sıcaklığında %80 ila %90 nemde bir saat boyunca bekletilerek diziler yaşlandırılır. Daha uzun inkübasyon süreleri, artan enzim aktivitesi nedeniyle yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.Acetylcholine esterase mikro dizilerinin ölçümü için alpha innotech novo array imager cihazının açık olduğundan ve 478 ± 17 nanometre eksitasyon ile 538 ± 21 nanometre emisyon filtresinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, lamı, noktalar yukarı bakacak şekilde lam tutucuya yerleştirin. Ön izleme bölümlerinin sayısını, otomatik pozlama kullanarak lamın her iki tarafında en az bir bölümün minimum dört mikrometre çözünürlükle ön izlemesinin alınacağı şekilde ayarlayın.Parametreler kabul edilebilir bulunduğunda, bir slayt görüntüsü elde edin ve bunu TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından, elde edilen slayt görüntüsünü Image J 64'te açın. Oval Seçim Aracına (Oval Selection Tool) tıklayın ve her bir noktayı seçin.Gözlemlenen noktadan biraz daha büyük bir bölge seçin ve Image J'deki öznelliği azaltmak için noktalar arasında tutarlı bir boyut kullandığınızdan emin olun. Ardından, analiz sekmesi altındaki ölçme seçeneğini kullanarak her bir noktanın sinyal yoğunluğunu ölçün. Bireysel materyal bileşimleri için pozitif kontrolün negatif kontrole oranlarını elde etmek amacıyla, 25 benzer pozitif kontrol noktasından gelen yoğunluğun ortalamasını alın ve bunu 25 benzer negatif kontrol noktasının ortalama yoğunluğuna bölün.Burada, bu yöntemler kullanılarak hazırlanan mikro dizilerin sonuçlanan dinamik aralığına bir örnek gösterilmektedir. Yüksek kontroller parlak yeşil bölgelerle sonuçlanırken, düşük kontroller çok daha sönük spotlarla sonuçlanmıştır. Image J 64 ile ölçülen yoğunluk, yüksek kontrollerin ortalama 22, 000 relatif floresan birim, düşük kontrollerin ise yaklaşık 8, 000 birim olduğunu göstermektedir.Kesikli çizgiler, ortalamadan üç standart sapmayı temsil etmektedir. Burada, bileşik bir ve bileşik iki olarak tanımlanan ameral sier alkaloidlerinin sentetik analoglarının onur dizi taramasına ait örnek mikro diziler yer almaktadır. Her iki eksen de floresan sinyali ile belirlenen enzim yüzdesini temsil eder.Tekrarlarda noktaların diyagonale yakınlığı, yüksek assay tekrarlanabilirliğini temsil eder. Burada iki farklı potansiyel inhibitörün IC 50 grafikleri gösterilmektedir. Birinci bileşik 16 micromolar düzeyinde bir IC 50 değeri verirken, ikinci bileşiğin IC 50 değeri 21 micromolar olarak belirlenmiştir. İnhibitör konsantrasyonlarıyla orantılı sinyal farklılıklarını göstermek için yukarıda temsili noktalar sunulmuştur.Burada gösterilen dizi; P 38 map kinaz, EGFR ve GSK olmak üzere dört farklı kinaz ile basılmış ve üzerine yalnızca tampon, ATP içeren tampon ile ATP ve bir enzim aktivitesi inhibitörü olan staurosporin içeren tampon basılmıştır. Sonuçlar, burada açıklanan ortaya çıkan floresan yoğunluklarına dayanarak, kinaz inhibitörü staurosporinin anlamlı bir etkisi olduğunu göstermektedir. Burada kullanılan staurosporin konsantrasyonunda görülen en büyük fark, P 38 lekelerindeydi.Burada, farklı konsantrasyonlarda stor sporin ile üzerine nokta basılan bir P 30 sabah 08:00 BP mikro dizisinin temsili noktaları gösterilmiştir. Belirtildiği üzere, bu molekülün IC 50 değeri bir mikromolar olarak belirlenmiş olup sağdaki grafikte gösterilmiştir. Bu prosedür takip edilerek düzgün bir şekilde uygulandığında, teknik uzmanlaşıldıktan sonra birkaç saat içinde tamamlanabilir.Tanı veya küçük molekül keşfine yönelik ek soruları yanıtlamak için immünolojik analizler veya protein etkileşim analizleri gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

a-guided-materials-screening-approach-for-developing-quantitative-sol

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Bir çip üzerinde fotopolimerizasyon tekniği kullanılarak bir polimer mikro oluşumu açıklaması. Atomik kuvvet mikroskobu, temas açısı ölçümleri, X-ışını fotoelektron spektroskopisi ve uçuş ikincil iyon kütle spektrometresi ve hücre bağlanma testinin zaman kullanarak yüksek aktarım yüzey karakterizasyonu da açıklanmıştır.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Daha önce glikanların proteinler üzerinde otomatik ve hızlı analizi için bir sistem geliştirilmiştir. Bu makale, biyofarmasötikler ve diğer glikokonjugat malzemelerdeki glikan yapılarını analiz etmekle uğraşanlar gibi geniş bir kullanıcı yelpazesi için optimize edilmiş "gliko-kalitatif analiz" protokolünü sunmaktadır.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Öğrenin, sol-jel türetilmiş protein mikroarray'ler geliştirmek için rehberli malzeme tarama yaklaşımını. Bu yöntem, asetilkolinesteraz ve multikinaz mikroarray'leri oluşturarak küçük molekül taramalarında yüksek verimlilik sağlar.

Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray'ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Daha fazla video keşfet