Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray'ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, mikrodizi üretimi için yeni ruh jeli bazlı malzemeleri tanımlamak ve bunları nano hacimli enzim tahlilleri için kullanmaktır. Bu, ilk olarak, baskı işlemi sırasında mikrodizi baskı pininde jelleşmeyi önlemek için yeterince uzun yanma sürelerine sahip malzemelerin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mikrodiziler olarak baskı yapabilme yetenekleri, tekrarlanabilirlikleri, çatlamaya karşı dirençleri, yapışma kalitesi, istenmeyen faz ayrımı ve nihayetinde sıkışmış enzimler için yüksek aktivite açısından uzun yanma sürelerine sahip malzemeleri değerlendirmektir.

Daha sonra, ilgilenilen enzim, en uygun malzemeler kullanılarak bir mikrodizi olarak basılır ve tahlil çözeltisini aşırı tespit etme ve ölçülebilir bir enzimatik yanıt oluşturma yeteneği test edilir. Son adım, materyalleri, ilgilenilen enzimi kullanarak yüksek oranda tekrarlanabilir tahliller sağlama ve kantitatif veriler üretme yetenekleri açısından değerlendirmektir. Dizi üretimi için nihai malzeme daha sonra seçilir.

Sonuç olarak, ruh jeli türevi protein mikrodizileri, enzim aktivitesini azaltan küçük molekülleri tanımlamak için kullanılır. Bu yöntemin plaka bazlı tarama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, düşük hacimli reaktifler kullanarak çok sayıda malzemeyi sistematik bir şekilde çok hızlı bir şekilde tarayabilmenizdir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, baskı pimleri içinde jel malzemelerin bulunması mümkün olduğu için mücadele edeceklerdir.

Bunlar daha sonra düzgün bir şekilde temizlenirse, yazdırılamayan materyaller olarak yorumlanabilecek gözden kaçan noktalara neden olacaktır. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi çok sayıda katkı maddesi çözeltisini hazırlayın. Çözeltilerin birçoğu önceden hazırlanabilir ve doğru koşullar altında bir aya kadar veya daha uzun süre saklanabilir, ancak bazılarının deney günü yapılması gerekir.

Sodyum silikat bazlı testereleri kullanmadan hemen önce karıştırın ve buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. SOS, su eklendikten sonraki bir saat içinde kullanılmalıdır, çünkü daha uzun bekleme süreleri azalmış ve tutarsız DATION sürelerine neden olur. Daha sonra, hangi kombinasyonların 2,5 saatten daha uzun dilatasyon süreleriyle yazdırılabilir malzeme olarak kullanılabileceğini belirlemek için ekteki metin protokolünde belirtildiği gibi çeşitli tamponlar, salanlar polimerleri ve organ şeritleri kombinasyonları hazırlayın.

Bir dizi kombinasyon tanımlandıktan sonra, baskı odası içindeki nemi %80 ila %90 neme ayarlayın, bu da %80'den daha az bir nem oranına ayarlayın, bu da yazıcıyla küçük biriktirme hacimleri nedeniyle numunenin buharlaşmasına ve baskıda tutarsızlıklara neden olabilir. Artık hazır, Chip Writer Pro programını kullanarak yazdırılacak dizi desenlerini düzenleyin. Daha önce tanımlanan testere jeli kombinasyonlarını kullanarak 2,5 saniyelik numune yükleme süresi ile XY yönündeki hareketi saniyede 10 milimetreye ve Z yönündeki numune yaklaşma hızını saniyede iki milimetreye ayarlayın.

Ön eleme işlemi ile tanımlanan karşılık gelen polimerleri, organo şeritleri ve küçük moleküllü katkı maddelerini birleştirerek 25 mikrolitre temel malzeme hazırlayın. 384 kuyulu bir mikrotitre plakasının ayrı kuyucuklarına pH'ı 8.0 olan 50 milimolar yığın kullanarak. Daha sonra çift damıtılmış suda 100 mikron çapında dört oluklu kılıf pimini sonikleştirin.

15 dakika sonra, bir nitrojen akışı altında deneyin. Ardından, pim tutucunun içinde kalan nemi gidermek için bir boru temizleyici kullanın ve pimi dikkatli bir şekilde kontak pimi yazdırma robotunun baskı kafasına yerleştirin. Kalan nemin giderilmemesi, pimin tutucu ile serbestçe hareket etmesini engelleyerek noktaların gözden kaçmasına neden olabilir.

Ardından, yazdırmadan hemen önce kuyuya ilgili SA'dan 25 mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleme hareketi kullanarak karıştırın Pipetle karıştırırken 50 kez tekrarlanır. Çözeltiye dahil edilen hava miktarını en aza indirin.

Hava kabarcıkları, numunenin pim içine tamamen yüklenmesini önler. Ardından, pimi numunenin içine indirerek yükleyin. Pimler yüklendikten sonra, yazdırma işlemini başlatın ve numuneyi bir slayt yüzeyine yazdırın.

Sonraki kaynak plakasına tuz eklemeden önce yazdırma işlemini duraklatın. İşlem duraklatıldığında, bir mıknatıs kullanarak baskı pimini çıkarın ve baskı kafasında nem birikmesini önlemek için baskı kafasına bir boru temizleyici yerleştirin. Ardından baskı pimini çift damıtılmış suyla durulayın ve 30 saniye boyunca temiz çift damıtılmış suda sonikleştirin.

Ardından, baskı pimini bir nitrojen akışı altında kurutun ve ardından pimi tekrar yazıcı kafasına yerleştirin. Kaynak plakası içinde kalan tüm numuneler için karıştırmaya, yazdırmaya ve temizlemeye devam edin, 12.000 noktaya kadar, 100 mikron çapı tek bir slaytta biriktirilebilir. Baskı bittiğinde, diziyi en az 30 dakika ve %80 ila 90 nemde baskı haznesi içinde 24 saate kadar yaşlandırın.

Kullanmadan hemen önce 25 mikrolitre bir milimolar, asetilkolin iyodür ve 0.14 mikrolitre beş milimolar bodi pi, FIL sistein ve pH 7.0'da 25 milimolar tris ile %4 gliserol birleştirerek 50 mikrolitre pozitif kontrol hazırlayın. Daha sonra, kullanımdan hemen önce, 0.14 mikrolitre beş milimolar boai PI FIL sisteini% 4.0 ile pH 7.0'da 49.86 mikrolitre 25 milimolar trisis ile 384 kuyulu bir mikro baştankara plakasının başka bir kuyusuna birleştirerek negatif kontrolleri hazırlayın ve önceki bölümde açıklanan aynı işlemleri kullanarak kontrolleri eski mikrodiziler üzerine yazdırın. Ancak 100 mikron çapındaki pimler yerine 235 mikron çapında yarıklı baş pimler taktınız.

Bu, çözümlerin daha önce biriktirilen noktaları tamamen kapsamasını sağlar. Spotlar, asetilkolinin otomatik hidrolizi nedeniyle dizileri oda sıcaklığında bir saat boyunca% 80 ila 90 nemde yaşlandırır. Daha uzun inkübasyon süreleri, gelişmiş enzim aktivitesi nedeniyle yanlış pozitiflere neden olabilir.

alpha innotech novo dizi görüntüleyicinin açık olduğundan ve asetilkolin esteraz mikrodizilerinin ölçümü için 478 artı veya eksi 17 nanometre uyarma ve 538 artı veya eksi 21 nanometre emisyon filtresi ile donatıldığından emin olun. Ardından sürgüyü, noktalar yukarı bakacak şekilde sürgü tutucuya yerleştirin. Önizleme bölümlerinin sayısını, mikroskop lamının her iki tarafındaki en az bir bölüm, otomatik pozlama kullanılarak en az dört mikrometre çözünürlükle önizlenecek şekilde ayarlayın.

Parametreler kabul edilebilir bulunduğunda, bir slayt görüntüsü alın ve bunu bir TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından, alınan slayt görüntüsünü resim J 64'te açın. Oval Seçim Aracı'nı tıklatın ve her noktayı seçin.

Gözlemlenen noktadan biraz daha büyük bir bölge seçin ve görüntünün öznelliğini azaltmak için noktalar arasında tutarlı bir boyut kullandığınızdan emin olun J.Ardından, ölçüm seçeneğini kullanarak her noktanın sinyal yoğunluğunu ölçün. Analiz sekmesi altında. 25 benzer pozitif kontrol noktasından gelen yoğunluğun ortalamasını alın ve tek tek malzeme bileşimleri için pozitif kontrol / negatif kontrol oranları elde etmek için 25 benzer negatif kontrol noktasının ortalama yoğunluğuna bölün.

Burada, bu yöntemler kullanılarak hazırlanan elde edilen mikrodizilerin dinamik aralığının bir örneği gösterilmektedir. Yüksek kontroller parlak yeşil bölgelerle sonuçlanırken, düşük kontroller çok daha sönük noktalarla sonuçlandı. Resim J 64 ile ölçülen yoğunluk, yüksek kontrollerin ortalama olarak yaklaşık 22.000 bağıl floresan birimi olduğunu ve düşük kontrollerin ortalama 8.000'e yakın olduğunu göstermektedir.

Noktalı çizgiler, ortalamadan üç standart sapmayı temsil eder. Burada, bileşik bir ve bileşik iki olarak tanımlanan ameral sier alkaloidlerinin sentetik analoglarının bir onur dizisi taraması için örnek mikrodiziler verilmiştir. Her iki eksen de floresan sinyali tarafından belirlenen enzim yüzdesini temsil eder.

Çift olarak, noktaların köşegene yakınlığı, yüksek tahlil tekrarlanabilirliğini temsil eder. Burada iki farklı potansiyel inhibitörün IC 50 grafikleri gösterilmiştir. Birinci bileşik, 16 mikromolar IC 50 seviyesi ile sonuçlanırken, ikinci bileşiğin IC 50'si 21 mikromolar idi. İnhibitör konsantrasyonlarıyla orantılı sinyaldeki farklılıkları göstermek için yukarıda temsili noktalar gösterilmektedir.

Burada gösterilen dizi, P 38 harita kinaz, EGFR ve GSK olmak üzere dört farklı kinaz ile basıldı ve A TP içeren tampon tek başına tampon ve A TP ve enzim aktivitesinin bir inhibitörü olan starro sporin içeren tampon ile üst üste basıldı. Sonuçlar, burada tarif edildiği gibi ortaya çıkan floresan yoğunluklarına bağlı olarak kinaz inhibitörü starro sporin'den önemli bir etki göstermektedir. Burada kullanılan stor sporin konsantrasyonunda görülen en büyük fark P 38 noktalarındandı.

Burada, değişen konsantrasyonlarda stor sporin ile aşırı lekelenmiş bir P 30 8:00 BP mikrodizisinin temsili noktaları gösterilmektedir. Belirtildiği gibi, bu molekülün IC 50'sinin bir mikromolar olduğu belirlendi ve bir kez ustalaştıktan sonra sağdaki grafikte gösterildi. Bu teknik, bu prosedürü takiben uygun şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir.

İmmünoanalizler veya protein etkileşim testleri gibi diğer yöntemler, teşhis veya küçük molekül keşfi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için de yapılabilir.