Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray'ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, mikro-dizi üretimi için yeni sol-jel tabanlı malzemeler belirlemek ve bunları nano hacimli enzim analizlerinde kullanmaktır. Bu süreç, öncelikle baskı sırasında mikro-dizi baskı pininde jelleşmeyi önlemek adına yeterince uzun jelleşme sürelerine sahip malzemelerin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, uzun jelleşme sürelerine sahip malzemelerin mikro-diziler halinde tekrarlanabilir şekilde basılma yeteneklerini, çatlamaya karşı dirençlerini, yapışma kalitelerini, istenmeyen faz ayrışmalarını ve nihayetinde hapsedilen enzimler için yüksek aktivite sağlayıp sağlamadıklarını değerlendirmektir.

Ardından, ilgili enzim optimal malzemeler kullanılarak bir mikro-dizi şeklinde basılır ve assay çözeltisini üzerine alma ve ölçülebilir bir enzimatik yanıt oluşturma yeteneği test edilir. Son adım, malzemelerin ilgili enzimi kullanarak yüksek düzeyde tekrarlanabilir assay'ler sağlama ve kantitatif veriler üretme yeteneklerini değerlendirmektir. Ardından, dizi üretimi için nihai malzeme seçilir.

Nihayetinde, sol jel türevli protein mikro dizileri, enzim aktivitesini azaltan küçük molekülleri tanımlamak için kullanılır. Bu yöntemin plaka tabanlı tarama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, düşük miktarlarda reaktif kullanarak çok sayıda materyalin sistematik bir şekilde ve çok hızlı bir biçimde taranabilmesidir. Genellikle, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, basım pinleri içinde materyallerin jelleşmesi olasılığı nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Bunlar düzgünce temizlenmezse, yazdırılamayan maddeler olarak yorumlanabilecek eksik noktalar oluşacaktır. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde çok sayıda katkı çözeltisini hazırlayın. Çözeltilerin çoğu önceden hazırlanabilir ve uygun koşullar altında bir ay veya daha uzun süre saklanabilir, ancak bazıları deneyin yapıldığı gün hazırlanmalıdır.

Sodyum silikat bazlı testereleri kullanmadan hemen önce karıştırın ve buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Suyun eklenmesinden sonra SOS bir saat içinde kullanılmalıdır; çünkü daha uzun bekleme süreleri, azalmış ve tutarsız DATION sürelerine yol açar. Ardından, 2,5 saatten daha uzun dilatasyon sürelerine sahip yazdırılabilir malzeme olarak hangi kombinasyonların kullanılabileceğini belirlemek için, beraberindeki metin protokolünde belirtildiği şekilde çeşitli tampon, salan polimer ve organ lan kombinasyonları hazırlayın.

Bir dizi kombinasyon belirlendikten sonra, baskı odasındaki nemi %80 ile %90 arasına ayarlayın; %80'in altındaki nem, yazıcıdaki küçük depozisyon hacimleri nedeniyle numune buharlaşmasına ve baskıda tutarsızlıklara yol açabilir. Hazırlıklar tamamlandığında, Chip Writer Pro programını kullanarak basılacak dizi desenlerini düzenleyin. XY yönündeki ilerleme hızını saniyede 10 milimetre, Z yönündeki numune yaklaşma hızını saniyede iki milimetre ve daha önce belirlenen saw gel kombinasyonlarını kullanarak numune yükleme süresini 2,5 saniye olarak ayarlayın.

Ön tarama süreciyle belirlenen ilgili polimerleri, organolanları ve küçük molekül katkılarını birleştirerek 25 µL baz materyal hazırlayın. 384 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasının münferit kuyucuklarına, pH değeri 8.0 olan 50 mM çözeltiler ekleyin. Ardından, 100 µm çapındaki dört adet yarık kılıf pimini çift distile su içerisinde sonikasyona tabi tutun.

15 dakika sonra, bunları azot akımı altında kurutmayı deneyin. Ardından, pin tutucunun içindeki kalıntı nemi gidermek için bir boru temizleyici kullanın ve pini dikkatlice temas pini yazdırma robotunun baskı kafasına yerleştirin. Kalıntı nemin giderilmemesi, pinin tutucuyla birlikte serbestçe hareket etmesini engelleyebilir ve bu da boşlukların oluşmasına neden olabilir.

Ardından, yazdırma işleminden hemen önce kuyucuğa ilgili SA'dan 25 µL ekleyin. Pipetle karıştırırken, çözeltiyi 50 kez tekrarlanan aşağı-yukarı pipetleme hareketiyle karıştırın. Çözeltiye giren hava miktarını minimuma indirin.

Hava kabarcıkları, numunenin pin içerisine tamamen yüklenmesini engeller. Ardından, pini numuneye indirerek doldurun. Pinler yüklendiğinde, baskı işlemine başlayın ve numuneyi bir lam yüzeyine basın.

Bir sonraki kaynak plakaya tuz eklemeden önce yazdırma işlemini durdurun. İşlem duraklatılmışken, yazdırma pinini bir mıknatıs kullanarak çıkarın ve yazdırma kafasında nem birikmesini önlemek için yazdırma kafasına bir temizleme çubuğu yerleştirin. Ardından, yazdırma pinini çift distile su ile durulayın ve temiz çift distile su içerisinde 30 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.

Ardından, baskı pinini bir azot akımı altında kurutun ve pini tekrar baskı kafasına yerleştirin. Kaynak plaktaki kalan tüm örnekler için karıştırma, baskı ve temizleme işlemlerine devam edin; tek bir lam üzerine 100 mikron çapında 12.000 noktaya kadar depozisyon yapılabilir. Baskı işlemi tamamlandığında, diziyi baskı odasında %80 ila %90 nemde minimum 30 dakika ve maksimum 24 saat boyunca olgunlaştırın.

Kullanımdan hemen önce, 25 µL 1 mM asetilkolin iyodür ile 0,14 µL 5 mM BODIPY FL sisteini ve pH 7,0'da 4% gliserol içeren 25 mM TRIS'i bir 384 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasının kuyucuğunda birleştirerek 50 µL pozitif kontrol hazırlayın; çözeltiyi, kabarcık oluşturmadan karıştırmak için pipetle yavaşça aşağı yukarı çekin. Ardından, 0,14 µL 5 mM BODIPY FL sisteini ile pH 7,0'da 4% gliserol içeren 49,86 µL 25 mM TRIS'i 384 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasının başka bir kuyucuğunda birleştirerek ve nazikçe karıştırarak kullanımdan hemen önce negatif kontrolleri hazırlayın. Kontrolleri, önceki bölümde açıklanan süreçlerin aynısını kullanarak yaşlandırılmış mikro diziler üzerine basın. Ancak, 100 mikron çaplı pinler yerine, 235 mikron çaplı slotlu çentikli pinler kullanın.

Bu işlem, çözeltilerin daha önce yerleştirilen lekeleri tamamen kaplamasını sağlar. Asetilkolinin otohidrolizi nedeniyle lekeler, oda sıcaklığında %80 ila %90 nemde bir saat boyunca bekletilerek diziler yaşlandırılır. Daha uzun inkübasyon süreleri, artan enzim aktivitesi nedeniyle yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.

Acetylcholine esterase mikro dizilerinin ölçümü için alpha innotech novo array imager cihazının açık olduğundan ve 478 ± 17 nanometre eksitasyon ile 538 ± 21 nanometre emisyon filtresinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, lamı, noktalar yukarı bakacak şekilde lam tutucuya yerleştirin. Ön izleme bölümlerinin sayısını, otomatik pozlama kullanarak lamın her iki tarafında en az bir bölümün minimum dört mikrometre çözünürlükle ön izlemesinin alınacağı şekilde ayarlayın.

Parametreler kabul edilebilir bulunduğunda, bir slayt görüntüsü elde edin ve bunu TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından, elde edilen slayt görüntüsünü Image J 64'te açın. Oval Seçim Aracına (Oval Selection Tool) tıklayın ve her bir noktayı seçin.

Gözlemlenen noktadan biraz daha büyük bir bölge seçin ve Image J'deki öznelliği azaltmak için noktalar arasında tutarlı bir boyut kullandığınızdan emin olun. Ardından, analiz sekmesi altındaki ölçme seçeneğini kullanarak her bir noktanın sinyal yoğunluğunu ölçün. Bireysel materyal bileşimleri için pozitif kontrolün negatif kontrole oranlarını elde etmek amacıyla, 25 benzer pozitif kontrol noktasından gelen yoğunluğun ortalamasını alın ve bunu 25 benzer negatif kontrol noktasının ortalama yoğunluğuna bölün.

Burada, bu yöntemler kullanılarak hazırlanan mikro dizilerin sonuçlanan dinamik aralığına bir örnek gösterilmektedir. Yüksek kontroller parlak yeşil bölgelerle sonuçlanırken, düşük kontroller çok daha sönük spotlarla sonuçlanmıştır. Image J 64 ile ölçülen yoğunluk, yüksek kontrollerin ortalama 22, 000 relatif floresan birim, düşük kontrollerin ise yaklaşık 8, 000 birim olduğunu göstermektedir.

Kesikli çizgiler, ortalamadan üç standart sapmayı temsil etmektedir. Burada, bileşik bir ve bileşik iki olarak tanımlanan ameral sier alkaloidlerinin sentetik analoglarının onur dizi taramasına ait örnek mikro diziler yer almaktadır. Her iki eksen de floresan sinyali ile belirlenen enzim yüzdesini temsil eder.

Tekrarlarda noktaların diyagonale yakınlığı, yüksek assay tekrarlanabilirliğini temsil eder. Burada iki farklı potansiyel inhibitörün IC 50 grafikleri gösterilmektedir. Birinci bileşik 16 micromolar düzeyinde bir IC 50 değeri verirken, ikinci bileşiğin IC 50 değeri 21 micromolar olarak belirlenmiştir. İnhibitör konsantrasyonlarıyla orantılı sinyal farklılıklarını göstermek için yukarıda temsili noktalar sunulmuştur.

Burada gösterilen dizi; P 38 map kinaz, EGFR ve GSK olmak üzere dört farklı kinaz ile basılmış ve üzerine yalnızca tampon, ATP içeren tampon ile ATP ve bir enzim aktivitesi inhibitörü olan staurosporin içeren tampon basılmıştır. Sonuçlar, burada açıklanan ortaya çıkan floresan yoğunluklarına dayanarak, kinaz inhibitörü staurosporinin anlamlı bir etkisi olduğunu göstermektedir. Burada kullanılan staurosporin konsantrasyonunda görülen en büyük fark, P 38 lekelerindeydi.

Burada, farklı konsantrasyonlarda stor sporin ile üzerine nokta basılan bir P 30 sabah 08:00 BP mikro dizisinin temsili noktaları gösterilmiştir. Belirtildiği üzere, bu molekülün IC 50 değeri bir mikromolar olarak belirlenmiş olup sağdaki grafikte gösterilmiştir. Bu prosedür takip edilerek düzgün bir şekilde uygulandığında, teknik uzmanlaşıldıktan sonra birkaç saat içinde tamamlanabilir.

Tanı veya küçük molekül keşfine yönelik ek soruları yanıtlamak için immünolojik analizler veya protein etkileşim analizleri gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.