Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu video makale, kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikrodizisi ilk glikoprotein kullanılarak bir hepatoselüler karsinom hastası serum örneğinde 20 farklı glikoproteinin glikozilasyon profillerini elde etmek için bir prosedürü açıklar Spesifik antikorlar doğrudan mikrodizi slaytlarına basılır ve lektin bağlanmasını önlemek için antikor glikanları bloke edilir. Hasta serum örnekleri uygulandığında, örnekteki glikoproteinler antikorlar tarafından yakalanır. Biyotinile glikan bağlayıcı proteinler daha sonra glikanları tespit etmek için eklenir ve biyotinile lektinleri etiketlemek için di konjuge nötrain eklenir.

Mikrodizi lamı daha sonra floresan algılamak için taranır, elde edilen verilerin analizi, numune proteinlerinin glikozilasyon profillerini ortaya çıkarır. Bu tekniğin HPLC gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Bu yöntem, tek tek glikoproteinlerin doğal durumlarında tespit edilmesine izin verir.

Aynı anda birden fazla protein için glikozilasyon değişikliğini taramak daha hızlı ve daha kolaydır. Pekala, hastalıkların biyobelirteçlerinin, özellikle kanser ve karaciğer kanserinin, en dikkatli şekilde incelediğimiz, genellikle glikosile olduğunu bulduk. Ve bulduğumuz spesifik gliko formlarını tespit etme yeteneği, duyarlılığı ve özgüllüğü açısından biyobelirteç performansını büyük ölçüde artırır.

Dolayısıyla bu önlem, HCC'deki çoklu serum proteinleri üzerindeki glikozilasyon değişiklikleri hakkında bilgi sağlayabilir. Pankreas kanseri, diyabet ve Alzheimer hastalığı gibi diğer kanserlerde ve hastalıklarda patoloji çalışmasına ve biyobelirteç keşfine de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Chen Lu olacak.

Bu protokole ilk olarak antikor mikrodizisini hazırlayarak başlayın, buz üzerinde 0.8 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde, mikrodizi baskısı için kullanılacak tüm antikorları en az 40 mililitre PBS'de mililitre başına 0.5 miligram konsantrasyona seyreltin, burada pozitif kontrol olarak 26 farklı antikor kullanılacaktır. Ayrıca PBS'de mililitre biyotinile BSA başına aynı miktarda 0.5 miligram hazırlayın. Her bir antikorun 40 mililitresini buz üzerindeki 384 kuyulu kaynak plakasına ayırmak için bir pipetleyici kullanın.

Daha sonra mikrodizi kontrol yazılımında, her bir antikor konumunu belirleyin. Ardından, plakayı kaynak olarak mikrodiziye yükleyin. Ardından, 20 mikrodizi slaytlarını hedef olarak mikrodiziye yükleyin.

Mikrodiziyi, 27 antikorun ve kontrol proteininin dokuza dokuz düzende üçlü olarak tespit edildiği 48 özdeş subar dizisi yazdıracak şekilde ayarlayın. Antikor mikrodizi slaytlarını yazdırmak için mikrodiziyi başlatın. Antikor mikrodizi slaytlarını toplayın ve bunları kurutucu içeren bir slayt kasetinde saklayın.

Depolama sırasında slaytlarda protein denatürasyonunu ve nemi önlemek için kaseti plastik bir torbaya koyun. Mühürlü mikrodizi slaytlarını kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bu prosedürün en zor ve önemli yönü, kimyasal engelleme adımıdır.

Başarıyı sağlamak için, mikro dizi ışığına yeterli miktarda antikor basılması çok önemlidir. Deneyden hemen önce daima taze sodyum IDE ve agro asit hidrosit hazırlayın. Ve oksidasyon prosedürünü ışıktan kaçınarak dört derecede gerçekleştirdiğinizden emin olun.

Mikrodizi slaytlarını buzdolabından çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengeleyin. Saklama kutusundan bir slayt çıkarın. Sürgüyü kısaca %0,1 ara 20 PBS içeren bir lavaboya daldırın.

Daha sonra slaydı 15 milimolar sodyum asetat tamponuna 10 dakika boyunca% 0.1 ara ile daldırın. Daha sonra, 15 milimolar sodyum asetat tamponunda iyodat başına taze 150 milimolar sodyum hazırlayın ve bir sürgülü lavaboya aktarın Buzdolabında saklayın, kullanana kadar ışıktan kaçının. Slaytı sodyum asetat tamponundan çıkarın ve antikor tarafı yukarı bakacak şekilde taze sodyum püryat içeren leğene koyun.

Işıktan kaçınmak için lavaboyu alüminyum folyo ile örtün. Ardından, sürgü havuzunu iki saat boyunca hafifçe sallayarak dört santigrat dereceye yerleştirin. Slaytı leğenden çıkarın ve sodyum asetat tamponunda beş dakika boyunca üç kez kısa bir süre durulayın.

Slaytı, 300 mililitre taze hazırlanmış 10 milimolar hidro glutamik asit bloke edici çözelti içinde, oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe çalkalayarak bir inkübasyon odasında inkübe edin. Slaytları hazneden çıkarın ve üç dakika boyunca% 0.1 ara ile PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir slayt yıkama lavabosunda, mikrodizi slaytını PBS'de 300 mililitre% 1 BSA'da% 0,5 arayla% 0.5 ile oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak inkübe edin.

Slaytları PBS'de %0,1 ara ile üç dakika boyunca üç kez durulayın. Slaytı bir slayt rafına koyun ve daha sonra mikrodizi slaytı kurutmak için iki dakika boyunca 1, 200 kez G'de döndürün. Her bir subar dizisini ayırmak için, slayt üzerine bir balmumu ızgarası basılır.

Balmumu yazıcısını 70 santigrat derecede beş dakika önceden ısıttıktan sonra, tıkalı mikrodizi sürgüsünü, antikor tarafı balmumuna bakacak şekilde balmumu yazıcısına yükleyin. Balmumu slayta eşit şekilde basmak için kolu yavaşça çekin. Bu yöntem, tek bir numune için gliko profilleme testleri yapmak veya birden fazla numunede tek bir gliko epitopunu ölçmek için kullanılabilir.

Burada gliko profilleme tahlillerini göstereceğiz. 40 mikrolitre serumu, fare, sıçan, tavşan, keçi ve eşek IgG'nin her biri olmak üzere% 0.1 arasında% 0.1 köprü 35 ve 100 mikrogram içeren 360 mikrolitre PBS'ye seyrelterek başlayın. Bu hacim, her bir alt diziye altı mikrolitre seyreltilmiş serum çözeltisi uygulamak için yeterlidir.

Slaytın her bir alt dizisine seyreltilmiş numuneden veya kontrolden altı mikrolitreyi dikkatlice uygulayın. Slaytı nemlendirilmiş bir kasette ıslak kağıt havlularla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Slaytı PBS ile %0,1 ara ile üç dakika boyunca üç kez durulayın.

Daha sonra slaydı iki dakika boyunca 1200 kez G döndürerek kurutun. Buz üzerinde 0.8 mililitrelik bir mikro füj tüpünde PBS arasında mililitre başına 10 miligramda 20 mikrolitre biyotinile glikan bağlayıcı protein hazırlayın. Slaytın her bir alt dizisine altı mikrolitre seyreltilmiş biyotinile lektin uygulayın ve nemlendirilmiş slayt kutusunda ıslak kağıt havlularla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Slaytları PBS ile daha önce olduğu gibi üç kez% 0.1 ara ile duruladıktan sonra, slaytı bir santrifüjde iki dakika boyunca 1200 kez G döndürerek kurutun. Mililitre başına 400 mikrolitre 10 miligram DITE 5 49 etiketli nötr travaini PBS'de% 0.8 arada% 0.8 mikro füj tüpünde buz üzerinde hazırlayın. Her bir alt diziye altı mikrolitre DITE 5 49 etiketli nötr travain uygulamak için bir tekrar pipetleyici kullanın ve inkübasyonu takiben slaytı nemlendirilmiş slayt kasetinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Slaytı PBS %0,1 ara ile üç dakika boyunca üç kez durulayın. Slaytı iki dakika boyunca bir santrifüjde 1200 kez G döndürerek kurutun. 10 milimetre çözünürlükte bir floresan mikrodizi tarayıcı kullanarak slaydı tarayın.

Lazer ve PMT ayarları, doygunluk gözlenmediğinden emin olurken mümkün olduğunca güçlü olmalıdır. Görüntüyü Pro 3.2 dizisinde açın. Dizi şablonunu, antikor nokta konumlarını gösteren dizi haritasına göre ayarlayın.

Her şablon dairesini görüntüdeki ilgili noktaya dikkatlice hizalayın, daha fazla analiz için her noktanın yoğunluğunu bir Excel dosyasına çıkarın. 20 serum glikoproteinine ve biotine karşı 26 antikor ile 48 özdeş subar dizisi içeren bir antikor mikro dizisi. BSA, engelleme prosedürünün önemini incelemek için bu videoda anlatıldığı gibi tasarlanmış ve üretilmiştir.

Glikoprotein profillemesinin analizinde, iki özdeş mikrodizi lamı oluşturuldu. Biri kimyasal olarak bloke edilmemiş, diğeri kontrol numunesi ise birinci ve üçüncü kolonlardaki subar dizilere uygulanmış ve subar dizileri üzerine havuzlanmış bir HCC serum örneği uygulanmıştır. İkinci ve 4. sütunlarda 22.

Farklı glikanlara özgü biyotinillenmiş lektinler daha sonra subar dizilerinin bu görüntülerinde gösterildiği gibi her bir alt diziye uygulandı. Kontrol kolonlarındaki antikorları yakalamak için bağlanan lektinler, bloke edilmemiş mikrodizilerdeki serum yüklü kolonlardan ayırt edilemeyen yüksek bir arka plan verir. Bununla birlikte, aynı deney kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikrodizi lamı üzerinde yapıldığında, kontrol kolonlarında antikorları yakalamak için hiç bağlanma yoktu veya çok düşüktü ve serum yüklü kolonlarda yüksek antijen bağlanması vardı.

Bu sonuçlar, kimyasal bloke etme prosedürünün, antikor yakalanan glikoproteinler üzerindeki glikanların ölçümü için kritik bir adım olduğunu göstermektedir: Protokolü izleyerek, HCC serumundaki 22 glikoproteinin glikozilasyon profilleri elde edilebilir. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa sekiz saat içinde yapılabilir. Antikorlar modifiye edildiklerinde antijenleri ve diğer özellikleri için afinitelerini kaybedebilirler.

Bu nedenle, bunu akılda tutmak ve bu prosedürü takiben farklı antikor kaynaklarında birkaç farklı antikor kullanmak önemlidir. Glikozilasyon değişikliğinin protein ekspresyon seviyelerinin değişmesinden mi yoksa yalnızca her bir protein üzerindeki glikozilasyon değişikliğinden mi kaynaklandığı gibi ek soruları yanıtlamak için aynı mikro ışın lamı kullanılarak her bir protein konsantrasyonunun tespiti gibi diğer ölçümler gerçekleştirilebilir. Patojen içeren serum örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.