Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri
5 Eylül 2013
Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.
Bu floresan mikroskobu deneyi, konakçı hücrelerle ilişkili bireysel bakterilerin canlılığını değerlendirir ve farklı hücre altı konumlardaki bakteri canlılığını belirler. İlk olarak, dış bakterileri tanımlamak için, enfekte olmuş hücreleri, bakteri zarı bütünlüğüne dayalı olarak canlı bakterileri canlı olmayan bakterilerden ayıran floresan boyaların varlığında enfekte olmuş konakçı olan bakteri geçirgenliğine özgü bir floresan reaktife maruz bırakın. Daha sonra, bakterilerin konakçı hücrelerin içinde nerede bulunduğunu belirtmek için, enfekte olmuş hücreleri floresan olarak bağlanmış bir antikorla ilgilenilen bir işaretleyiciye inkübe edin.
Elde edilen immünofloresan görüntüler, konakçı hücrelerin içindeki ve dışındaki canlı bakterilerin yüzdesini ve canlı ve canlı olmayan hücre içi bakterilerin hücre altı lokalizasyonunu belirleyebilir. Koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobunun aksine, bu yöntem tek tek bakterilerin canlılığının doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, farklı hücre altı bölmelerdeki bakterilerin canlılıklarında farklılıklar olup olmadığını da ortaya çıkarabilir.
Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Brittany Johnson, 24'te dairesel cam kapak kızakları üzerinde kültürlenen hücrelere Atory olacak, kuyu plakaları ilgilenilen bakterileri ekler ve istenen süre boyunca inkübe eder. Enfekte olmuş hücreleri bir kez nazikçe durulayın. Daha sonra dış bakterileri tespit etmek için Alexa Fluor 6 4 7 bağlı antikor veya bakteriye özgü bir lektin ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
İki durulamadan sonra, ortamı aspire edin ve sito dokuz ve propidyum iyot içeren 0,5 mililitre canlı ölü boyama solüsyonu ekleyin. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından paspas magnezyum klorürde iki kez durulayın. Kapak kızaklarını yüzü aşağı bakacak şekilde cam kızakların üzerine ters çevirin.
Şeffaf oje ile kapatın. Bakterileri etiketlemek için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan filtre setlerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri 30 dakika içinde elde edin. Mors tanımlı ortamda mililitre DPI başına 10 mikrogram ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Şimdi yapışık hücreleri DPI etiketli bakterilerle enfekte edin. Hücreleri aldehitler veya organik çözücüler ile sabitlemeyin. Hücreleri bir kez durulayın.
Daha sonra Alexa Fluor 6, 4, 7 bağlı antikor veya lektin ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Paspas tamponu ile iki durulamadan sonra, ilgilenilen hücre altı işaretleyiciye karşı bir Alexa Fluor 5 5, 5 bağlı antikor ekleyin ve 20 dakika inkübe edin İkisinden sonra, paspas tamponlu RIN'ler, hücreleri bir kez paspas magnezyum klorür ile yıkayın. Daha sonra ortamı aspire edin ve karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0.4 mikromolar sit yeşil inkübe hücresi ekleyin, hücreleri iki kez paspas, magnezyum klorür içinde rinleyin.
Sonra hücreleri yıkayın. Beş dakika boyunca magnezyum klorür paspaslarda bir kez daha. Kapak fişlerini yüzü aşağı bakacak şekilde cam slaytlara ters çevirin, şeffaf oje ile kapatın, floresan mikroskobunda 30 dakika içinde slaytların görüntülerini elde edin.
Bu deneyde, insan nötrofilleri gonore ile enfekte edildi. Alexa Fluor 6 4 7 bağlı soya fasulyesi lektini, hücre dışı gonoreyi tespit eder. Daha sonra yeşil floresan canlılık kalıbı ve kırmızı floresan propidyum iyodür, kolesterolü tercihen konakçı hücre plazma zarlarına nüfuz etmek için tutan saponin varlığında eklendi, ancak enfekte hücrelerde gonore zarına nüfuz etmedi, ökaryotik hücre çekirdeği hem sito dokuz hem de propidyum iyodür ile boyanır.
Belsoğukluğu ile enfekte olmuş nötrofillerin bu görüntüleri, canlılık boyaları, cyt talk screen ve dpi kullanılarak oluşturuldu. Probidyum iyodür boyası, floresan mikroskobunda hem kırmızı hem de ultraviyole kanallarda floresan olduğu için kullanılmamıştır. Tüm gonore dpi ile lekelenir, ancak yalnızca zarları bozulmuş bakteriler öküz yeşili ile boyanır.
Canlı olmayan hücre içi bakteriler, bakterileri çevreleyen CD 63 için bir boyama halkasına sahiptir. Bu halka, birincil granüllerin bu fagozomda zenginleştirildiğini gösterir. Canlı hücre içi bakteri, CD 63 için boyamadan yoksundur, bu da primer granüllerin fagozomunda zenginleştirilmediğini gösterir. Alınan.
Veriler birlikte, gonore ve primer granül negatif fagozomdaki sakinler arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, konakçı hücrelerdeki bakterilerin canlılığını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, bu hücre altı bölmelere yönelik antikorları kullanarak, konakçı hücrelerdeki farklı bölmelere lokalize bakterilerin canlılığını belirleyebileceksiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, floresan mikroskobu kullanarak konak hücrelerle ilişkili bireysel bakterilerin canlılığını değerlendirmek için protokolleri ana hatlarıyla belirtmektedir. Ayrıntılı yöntemler, çeşitli hücrealtı yerleşimlerinde bakteri canlılığının belirlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bakteryal patogenez
- Floresan mikroskobu
- Hücresel etkileşimler
Arka Plan
- Bakteriyel sağkalımın konak hücrelerde anlaşılması, enfeksiyonların incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Floresan boyalar, canlı ve cansız bakteriler arasında ayrım yapabilir.
- Geleneksel yöntemler, bireysel bakteri canlılığının doğrudan değerlendirmesini sağlamayabilir.
- Bu çalışma, konak hücreler içindeki bakteri davranışının anlaşılmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Konak hücrelerde bakteri canlılığının değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Canlı ve cansız bakterilerin lokalizasyonunu keşfetmek.
- Mevcut canlılık değerlendirme yöntemlerine daha doğru bir alternatif sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Enfekte hücrelerin bakteriyel permeazına özgü floresan reaktiflere maruz bırakılması.
- Canlı ve cansız bakterileri ayırt etmek için floresan boyaların kullanılması.
- Bakteryal lokalizasyonları tanımlamak için floresan olarak eşleştirilmiş antikorlarla inkübasyon.
- Bakteriyel canlılığı belirlemek için immünofloresan görüntülerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, bireysel bakteri canlılığının doğrudan değerlendirilmesine olanak tanır.
- Sonuçlar, hücrealtı lokalizasyona bağlı olarak canlılık farklılıklarını gösterir.
- İmmünofloresan görüntüleme, bakterilerin net görselleştirilmesini sağlar.
- Bu yaklaşım, bakteriyel canlılığı değerlendirmede geleneksel yöntemlerden daha üstündür.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş yöntem, konak hücrelerde bakteriyel canlılığın incelenmesi için etkilidir.
- Floresan mikroskobu, bakteriyal patogenez hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarabilir.
- Bu çalışma, mikrobiyal sağkalım stratejilerinin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
