Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Bu floresan mikroskopi deneyi, konak hücrelerle ilişkili tekil bakterilerin canlılığını değerlendirir ve farklı subselüler bölgelerdeki bakteriyel canlılığı belirler. İlk olarak, dışarıdaki bakterileri tanımlamak için enfekte hücreleri, bakteri permeazına özgü bir floresan reaktife maruz bırakın; ardından enfekte konağı, bakteriyel membran bütünlüğüne dayanarak canlı ve canlı olmayan bakterileri ayırt eden floresan boyaların varlığında inkübe edin. Daha sonra, bakterilerin konak hücrelerin içinde nerede bulunduğunu belirtmek için enfekte hücreleri, ilgi duyulan bir marköre floresanla bağlanmış bir antikor ile inkübe edin.

Elde edilen immunofloresan görüntüler, konak hücrelerin içindeki ve dışındaki canlı bakterilerin yüzdesini ve canlıya karşı canlı olmayan hücre içi bakterilerin subselüler lokalizasyonunu belirleyebilir. Koloni sayım analizleri, gentamisin koruma analizleri ve elektron mikroskobunun aksine bu yöntem, tekil bakterilerin canlılığının doğrudan değerlendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, farklı subselüler kompartmanlardaki bakterilerin canlılıklarında farklılıklar olup olmadığını da ortaya çıkarabilir.

Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Brittany Johnson uygulamalı olarak gösterecek. 24 kuyucuklu plaklarda, dairesel cam lameller üzerinde kültüre edilmiş hücrelere ilgili bakterileri ekleyin ve istenen süre boyunca inkübe edin. Enfekte hücreleri bir kez nazikçe durulayın. Ardından, dış bakterileri tespit etmek için Alexa Fluor 6 4 7 ile konjuge edilmiş antikor veya bakteriye özgü bir lektin ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.

İki kez duruladıktan sonra medyumu aspire edin ve cyto nine ile propidium iodine içeren 0,5 milliliters canlı-ölü boyama çözeltisi ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından mops magnezyum klorür ile iki kez durulayın. Lamel ve lamları, lamel yüzeyi aşağı gelecek şekilde ters çevirin.

Şeffaf oje ile mühürleyin. Bakterileri etiketlemek için metin protokolünde detaylandırılan filtre setlerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri 30 dakika içinde elde edin. MORS tanımlı besiyerine mililitrede 10 µg DPI ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.

Şimdi adherent hücreleri DPI ile işaretlenmiş bakterilerle enfekte edin. Hücreleri aldehitler veya organik çözücülerle fikse etmeyin. Hücreleri bir kez durulayın.

Ardından, Alexa Fluor 6 4, 7 konjuge antikor veya lektin ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika inkübe edin. MOPS tamponu ile iki kez duruladıktan sonra, ilgili hücre altı belirtecine karşı Alexa Fluor 5 5, 5 konjuge antikor ekleyin ve 20 dakika inkübe edin. MOPS tamponu ile iki durulama işleminden sonra, hücreleri bir kez MOPS magnezyum klorür ile yıkayın. Daha sonra medyumu aspire edin ve 0,4 µM Cy3 ekleyip hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta beş dakika inkübe edin; hücreleri MOPS magnezyum klorür ile iki kez durulayın.

Ardından hücreleri yıkayın. MOPS magnezyum klorür içerisinde beş dakika boyunca bir kez daha yıkayın. Lamelleri cam lamların üzerine yüzleri aşağı gelecek şekilde ters çevirip yerleştirin, şeffaf oje ile mühürleyin ve 30 dakika içerisinde floresan mikroskobu ile lamların görüntülerini alın.

Bu deneyde, insan nötrofilleri bel soğukluğu (gonore) etkeni ile enfekte edilmiştir. Alexa Fluor 6 4 7 ile konjuge edilmiş soya lektini, hücre dışındaki gonokoku tespit eder. Ardından, kolesterolü bağlayarak öncelikle konak hücre plazma membranlarını geçirgen hale getiren, ancak enfekte hücrelerdeki gonokok membranını geçirgen kılmayan saponin varlığında, yeşil floresan canlılık boyası ve kırmızı floresan propidyum iyodür eklenmiştir; ökaryotik hücre çekirdeği hem cyto nine hem de propidyum iyodür ile boyanır.

Gonore enfeksiyonlu nötrofillerin bu görüntüleri, canlılık boyaları cyt talk screen ve dpi kullanılarak oluşturulmuştur. Propidyum iyodür boyası, floresan mikroskobunda hem kırmızı hem de ultraviyole kanallarda floresans verdiği için kullanılmamıştır. Tüm gonore bakterileri dpi ile boyanırken, sadece membranları hasar görmüş bakteriler ox green ile boyanır.

Canlı olmayan hücre içi bakteride, bakteriyi çevreleyen bir CD 63 boyanma halkası görülmektedir. Bu halka, primer granüllerin bu fagozomda zenginleştiğini göstermektedir. Canlı hücre içi bakteride ise CD 63 boyanması yoktur, bu da primer granüllerin onun fagozomunda zenginleşmediğini göstermektedir.

Veriler hep birlikte, bel soğukluğu etkeninin canlılığı ile primer granül negatif fagozomdaki yerleşimi arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, konak hücrelerdeki bakterilerin canlılığının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, bu hücre altı kompartmanlara yönelik antikorlar kullanarak konak hücrelerde farklı kompartmanlarda lokalize olmuş bakterilerin canlılığını belirleyebileceksiniz.