Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Bu floresan mikroskobu deneyi, konakçı hücrelerle ilişkili bireysel bakterilerin canlılığını değerlendirir ve farklı hücre altı konumlardaki bakteri canlılığını belirler. İlk olarak, dış bakterileri tanımlamak için, enfekte olmuş hücreleri, bakteri zarı bütünlüğüne dayalı olarak canlı bakterileri canlı olmayan bakterilerden ayıran floresan boyaların varlığında enfekte olmuş konakçı olan bakteri geçirgenliğine özgü bir floresan reaktife maruz bırakın. Daha sonra, bakterilerin konakçı hücrelerin içinde nerede bulunduğunu belirtmek için, enfekte olmuş hücreleri floresan olarak bağlanmış bir antikorla ilgilenilen bir işaretleyiciye inkübe edin.

Elde edilen immünofloresan görüntüler, konakçı hücrelerin içindeki ve dışındaki canlı bakterilerin yüzdesini ve canlı ve canlı olmayan hücre içi bakterilerin hücre altı lokalizasyonunu belirleyebilir. Koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobunun aksine, bu yöntem tek tek bakterilerin canlılığının doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, farklı hücre altı bölmelerdeki bakterilerin canlılıklarında farklılıklar olup olmadığını da ortaya çıkarabilir.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Brittany Johnson, 24'te dairesel cam kapak kızakları üzerinde kültürlenen hücrelere Atory olacak, kuyu plakaları ilgilenilen bakterileri ekler ve istenen süre boyunca inkübe eder. Enfekte olmuş hücreleri bir kez nazikçe durulayın. Daha sonra dış bakterileri tespit etmek için Alexa Fluor 6 4 7 bağlı antikor veya bakteriye özgü bir lektin ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

İki durulamadan sonra, ortamı aspire edin ve sito dokuz ve propidyum iyot içeren 0,5 mililitre canlı ölü boyama solüsyonu ekleyin. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından paspas magnezyum klorürde iki kez durulayın. Kapak kızaklarını yüzü aşağı bakacak şekilde cam kızakların üzerine ters çevirin.

Şeffaf oje ile kapatın. Bakterileri etiketlemek için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan filtre setlerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri 30 dakika içinde elde edin. Mors tanımlı ortamda mililitre DPI başına 10 mikrogram ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Şimdi yapışık hücreleri DPI etiketli bakterilerle enfekte edin. Hücreleri aldehitler veya organik çözücüler ile sabitlemeyin. Hücreleri bir kez durulayın.

Daha sonra Alexa Fluor 6, 4, 7 bağlı antikor veya lektin ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Paspas tamponu ile iki durulamadan sonra, ilgilenilen hücre altı işaretleyiciye karşı bir Alexa Fluor 5 5, 5 bağlı antikor ekleyin ve 20 dakika inkübe edin İkisinden sonra, paspas tamponlu RIN'ler, hücreleri bir kez paspas magnezyum klorür ile yıkayın. Daha sonra ortamı aspire edin ve karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0.4 mikromolar sit yeşil inkübe hücresi ekleyin, hücreleri iki kez paspas, magnezyum klorür içinde rinleyin.

Sonra hücreleri yıkayın. Beş dakika boyunca magnezyum klorür paspaslarda bir kez daha. Kapak fişlerini yüzü aşağı bakacak şekilde cam slaytlara ters çevirin, şeffaf oje ile kapatın, floresan mikroskobunda 30 dakika içinde slaytların görüntülerini elde edin.

Bu deneyde, insan nötrofilleri gonore ile enfekte edildi. Alexa Fluor 6 4 7 bağlı soya fasulyesi lektini, hücre dışı gonoreyi tespit eder. Daha sonra yeşil floresan canlılık kalıbı ve kırmızı floresan propidyum iyodür, kolesterolü tercihen konakçı hücre plazma zarlarına nüfuz etmek için tutan saponin varlığında eklendi, ancak enfekte hücrelerde gonore zarına nüfuz etmedi, ökaryotik hücre çekirdeği hem sito dokuz hem de propidyum iyodür ile boyanır.

Belsoğukluğu ile enfekte olmuş nötrofillerin bu görüntüleri, canlılık boyaları, cyt talk screen ve dpi kullanılarak oluşturuldu. Probidyum iyodür boyası, floresan mikroskobunda hem kırmızı hem de ultraviyole kanallarda floresan olduğu için kullanılmamıştır. Tüm gonore dpi ile lekelenir, ancak yalnızca zarları bozulmuş bakteriler öküz yeşili ile boyanır.

Canlı olmayan hücre içi bakteriler, bakterileri çevreleyen CD 63 için bir boyama halkasına sahiptir. Bu halka, birincil granüllerin bu fagozomda zenginleştirildiğini gösterir. Canlı hücre içi bakteri, CD 63 için boyamadan yoksundur, bu da primer granüllerin fagozomunda zenginleştirilmediğini gösterir. Alınan.

Veriler birlikte, gonore ve primer granül negatif fagozomdaki sakinler arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, konakçı hücrelerdeki bakterilerin canlılığını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, bu hücre altı bölmelere yönelik antikorları kullanarak, konakçı hücrelerdeki farklı bölmelere lokalize bakterilerin canlılığını belirleyebileceksiniz.